牛奶中酪蛋白提取含量测定
实验原理
1牛乳成分：碳水化合物（5）脂类（4）蛋白质（35）维生素微量元素（CaP等矿物质）水（87）
牛奶中糖乳糖乳糖种二糖D半乳糖分子D葡萄糖分子通β14糖苷键连接成乳糖溶水溶乙醇乙醇混入乳糖水溶液中时乳糖会结晶出达分离目
牛奶中蛋白质酪蛋白乳清蛋白两种中酪蛋白占牛乳蛋白质80酪蛋白白色味物质溶水乙醇等机溶剂溶碱溶液乳清蛋白水合力强分散性强牛乳中呈高分子状态
2等电点沉淀法：
等电点时蛋白质分子两性离子形式存分子净电荷零(正负电荷相等)时蛋白质分子颗粒溶液中没相电荷相互排斥分子相互间作力减弱颗粒极易碰撞凝聚产生沉淀蛋白质等电点时溶解度易形成沉淀物酪蛋白等电点47左右（结构酪蛋白等电点）实验中牛乳pH调值47时酪蛋白沉淀出
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂增加粘稠度致pH调等电点酪蛋白沉淀少实验时pH稍微调点调回等电点时市售牛奶生产程通常导致酪蛋白组分发生变化pI偏离47通常偏酸
3酪蛋白提纯
根乳糖乳清蛋白等酪蛋白溶解性质差异纯水洗涤乳糖乳清蛋白等溶水杂质乙醇脂类然渡乙醚洗涤乙醚快挥发终纯粹酪蛋白结晶
4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝结合法）
考马斯亮蓝蛋白质疏水微区结合种结合具高敏感性考马斯亮蓝G520磷酸溶液呈棕红色吸收峰465nm蛋白质结合形成复合物时呈蓝色吸收峰变595nm定范围考马斯亮蓝G520蛋白质复合物呈色595nm吸光度蛋白质含量呈线性关系测定蛋白质浓度
二实验器材试剂
1器材：恒温水浴锅离心机抽滤装置蒸发皿精密pH试纸旋涡混合器紫外分光光度计试*95mL吸50mL容量瓶100mL量筒电子分析天
2试剂：鲜牛奶pH47醋酸醋酸钠缓溶液乙醇乙醚混合液（95乙醇水乙醚体积1：1）09NaCl溶液标准蛋白液（01mgmL牛血清蛋白）考马斯亮蓝G520染液
三实验操作记录
1酪蛋白制备
20mL牛奶盛100mL烧杯中加热40℃搅拌慢慢加入预热40℃pH47醋酸缓溶液20mL冰醋酸调节溶液pH47时量酪蛋白沉淀析出述悬浮液冷室温离心5min（4000rmin）弃清液沉淀酪蛋白粗品
蒸馏水洗涤沉淀3次（次约20mL）离心5min（3000rmin）弃清液沉淀中加入约20mL95乙醇搅拌片刻全部悬浊液转移布氏漏斗中抽滤乙醇乙醚混合溶液洗涤沉淀2次乙醚洗涤沉淀2次抽干沉淀摊开培养皿中风干保存周
2标准曲线制作
取7支干净干燥试表进行编号加入试剂
混匀室温静置3min第空白波长595nm处色读取吸光度吸光度坐标标准液浓度横坐标标准曲线
表 1 标准曲线制作
试剂＼编号
1（空白）
2
3
4
5
6
7
标准蛋白液mL
——
01
02
03
04
06
08
09NaClmL
10
09
08
07
06
04
02
考马斯亮蓝染液mL
40
40
40
40
40
40
40
蛋白质浓度(μgmL)
0
10
20
30
40
60
80
A595nm
0000
0151
0260
0326
0440
0535
0636
3样液测定
准确称取25mg制酪蛋白置50mL烧杯中加入约20mL09NaCl准确加入1molL NaOH 5mL酪蛋白溶解准确加入1molL乙酸5mL充分振摇直酪蛋白完全溶解止（溶50℃水浴加热溶）全部转移50mL容量瓶中加09NaCl稀释定容50mL充分摇匀取5mL述蛋白液转移50mL容量瓶中09NaCl稀释定容50mL
取支干净试加入样品液10mL考马斯亮蓝染液40mL混匀室温静置3min波长595nm处色读取吸光度样品液吸光度查标准曲线求出含量
四实验结果
1酪蛋白产量产率计算
表 2酪蛋白产量产率计算
酪蛋白质量g
牛奶样品质量g
产率g
078
2003
389
2标准曲线
散点图出两点前面点线性关系出现明显负偏差线性拟合时舍两点取前5点进行拟合拟合出直线R²达0983线性较
2 样品液吸光度0324标准曲线酪蛋白浓度2840μgmL
称取酪蛋白样品质量00267g稀释倍数500倍
ω酪蛋白酪蛋白浓度×10mL×500样品质量×1002840×106×1×50000267×100532
五误差分析讨
1次制备实验中蛋白质量较纯度较低分析原：
1）蛋白质略呈黄色发粘说明脱脂彻底蛋白质产品中含脂质
2）考马斯亮蓝G520染液中沉淀影响考马斯亮蓝蛋白质复合物溶液吸光度
3）配制标准溶液时操作误差试中加入溶液时挂壁终没方溶液混合均匀导致标准溶液浓度准致标准曲线准数处理时发现数线性尤浓度较时然超出考马斯蓝线性范围排操作失误
2注意事项
1）试提前周清洗干净晾干否制作标准曲线时法保证浓度干净试加溶液时容易挂壁利控制标准蛋白液浓度
2）配制浓度标准蛋白液时组分体积准确移取特量较少标准蛋白液稍微洒出点会导致较相误差
3）蛋白质粗品洗涤定规范做次离心洗涤时搅匀布氏漏斗洗涤时先微接抽气洗出液缓慢流出接紧橡皮抽干
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实验原理
1牛乳成分：碳水化合物（5）脂类（4）蛋白质（35）维生素微量元素（CaP等矿物质）水（87）
牛奶中糖乳糖乳糖种二糖D半乳糖分子D葡萄糖分子通β14糖苷键连接成乳糖溶水溶乙醇乙醇混入乳糖水溶液中时乳糖会结晶出达分离目
牛奶中蛋白质酪蛋白乳清蛋白两种中酪蛋白占牛乳蛋白质80酪蛋白白色味物质溶水乙醇等机溶剂溶碱溶液乳清蛋白水合力强分散性强牛乳中呈高分子状态
2等电点沉淀法：
等电点时蛋白质分子两性离子形式存分子净电荷零(正负电荷相等)时蛋白质分子颗粒溶液中没相电荷相互排斥分子相互间作力减弱颗粒极易碰撞凝聚产生沉淀蛋白质等电点时溶解度易形成沉淀物酪蛋白等电点47左右（结构酪蛋白等电点）实验中牛乳pH调值47时酪蛋白沉淀出
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂增加粘稠度致pH调等电点酪蛋白沉淀少实验时pH稍微调点调回等电点时市售牛奶生产程通常导致酪蛋白组分发生变化pI偏离47通常偏酸
3酪蛋白提纯
根乳糖乳清蛋白等酪蛋白溶解性质差异纯水洗涤乳糖乳清蛋白等溶水杂质乙醇脂类然渡乙醚洗涤乙醚快挥发终纯粹酪蛋白结晶
4蛋白质含量测定（考马斯亮蓝结合法）
考马斯亮蓝蛋白质疏水微区结合种结合具高敏感性考马斯亮蓝G520磷酸溶液呈棕红色吸收峰465nm蛋白质结合形成复合物时呈蓝色吸收峰变595nm定范围考马斯亮蓝G520蛋白质复合物呈色595nm吸光度蛋白质含量呈线性关系测定蛋白质浓度
二实验器材试剂
1器材：恒温水浴锅离心机抽滤装置蒸发皿精密pH试纸旋涡混合器紫外分光光度计试*95mL吸50mL容量瓶100mL量筒电子分析天
2试剂：鲜牛奶pH47醋酸醋酸钠缓溶液乙醇乙醚混合液（95乙醇水乙醚体积1：1）09NaCl溶液标准蛋白液（01mgmL牛血清蛋白）考马斯亮蓝G520染液
三实验操作记录
1酪蛋白制备
20mL牛奶盛100mL烧杯中加热40℃搅拌慢慢加入预热40℃pH47醋酸缓溶液20mL冰醋酸调节溶液pH47时量酪蛋白沉淀析出述悬浮液冷室温离心5min（4000rmin）弃清液沉淀酪蛋白粗品
蒸馏水洗涤沉淀3次（次约20mL）离心5min（3000rmin）弃清液沉淀中加入约20mL95乙醇搅拌片刻全部悬浊液转移布氏漏斗中抽滤乙醇乙醚混合溶液洗涤沉淀2次乙醚洗涤沉淀2次抽干沉淀摊开培养皿中风干保存周
2标准曲线制作
取7支干净干燥试表进行编号加入试剂
混匀室温静置3min第空白波长595nm处色读取吸光度吸光度坐标标准液浓度横坐标标准曲线
表 1 标准曲线制作
试剂＼编号
1（空白）
2
3
4
5
6
7
标准蛋白液mL
——
01
02
03
04
06
08
09NaClmL
10
09
08
07
06
04
02
考马斯亮蓝染液mL
40
40
40
40
40
40
40
蛋白质浓度(μgmL)
0
10
20
30
40
60
80
A595nm
0000
0151
0260
0326
0440
0535
0636
3样液测定
准确称取25mg制酪蛋白置50mL烧杯中加入约20mL09NaCl准确加入1molL NaOH 5mL酪蛋白溶解准确加入1molL乙酸5mL充分振摇直酪蛋白完全溶解止（溶50℃水浴加热溶）全部转移50mL容量瓶中加09NaCl稀释定容50mL充分摇匀取5mL述蛋白液转移50mL容量瓶中09NaCl稀释定容50mL
取支干净试加入样品液10mL考马斯亮蓝染液40mL混匀室温静置3min波长595nm处色读取吸光度样品液吸光度查标准曲线求出含量
四实验结果
1酪蛋白产量产率计算
表 2酪蛋白产量产率计算
酪蛋白质量g
牛奶样品质量g
产率g
078
2003
389
2标准曲线
散点图出两点前面点线性关系出现明显负偏差线性拟合时舍两点取前5点进行拟合拟合出直线R²达0983线性较
2 样品液吸光度0324标准曲线酪蛋白浓度2840μgmL
称取酪蛋白样品质量00267g稀释倍数500倍
ω酪蛋白酪蛋白浓度×10mL×500样品质量×1002840×106×1×50000267×100532
五误差分析讨
1次制备实验中蛋白质量较纯度较低分析原：
1）蛋白质略呈黄色发粘说明脱脂彻底蛋白质产品中含脂质
2）考马斯亮蓝G520染液中沉淀影响考马斯亮蓝蛋白质复合物溶液吸光度
3）配制标准溶液时操作误差试中加入溶液时挂壁终没方溶液混合均匀导致标准溶液浓度准致标准曲线准数处理时发现数线性尤浓度较时然超出考马斯蓝线性范围排操作失误
2注意事项
1）试提前周清洗干净晾干否制作标准曲线时法保证浓度干净试加溶液时容易挂壁利控制标准蛋白液浓度
2）配制浓度标准蛋白液时组分体积准确移取特量较少标准蛋白液稍微洒出点会导致较相误差
3）蛋白质粗品洗涤定规范做次离心洗涤时搅匀布氏漏斗洗涤时先微接抽气洗出液缓慢流出接紧橡皮抽干
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