目录
抗菌肽药物制备方法 2
第章 文献综述 4
11抗菌肽分类 4
12抗菌肽性质 5
121抗菌肽般理化性质 5
122抗菌肽生物学特性 5
13抗菌肽作机理 5
14抗菌肽制备方法 6
141生物材料提取法 6
142化学合成法 6
143基工程法 6
144酶解法 7
15抗菌肽方面应前景目前存问题 7
151抗菌肽医疗方面应 7
152抗菌肽食品方面应 8
153抗菌肽禽畜养殖业方面应 8
155抗菌肽研究存问题 8
16基工程制备抗菌肽简介 9
161抗菌肽分子设计改造策略 9
162目基获取 12
163制备重组抗菌肽 12
第二章 抗菌肽制备工艺 14
21目前抗菌肽生产方法 14
22抗菌肽制备改造设计 16
221抗菌肽改造原 16
222抗菌肽改造方法 17
223抗菌肽改造 17
图2 抗菌肽筛选 18
23抗菌肽筛选 19
231通生物信息学工具优化抗菌肽结构参数 19
232抗菌肽合成纯化 19
233抗菌肽活性检测 20
234抗菌肽结构检测 20
24宿菌育种车间工艺流程设备 22
241设备途： 22
242制备基 22
243构建重组表达载体 23
244目基片段载体连接 23
245宿菌制备 23
246连接产物转入肠杆菌 24
2 47 筛选 24
25抗菌肽表达纯化分离工艺流程设备 24
251设备途： 24
252重组质粒肠杆菌中表达 24
253融合蛋白表达制备 25
254抗菌肽切割纯化 25
26抗菌肽抗菌活性检测 25
第三章 抗菌肽药物前景展 26
抗菌肽药物制备方法
摘
抗菌肽抗生素种年抗生素滥导致抗生素耐药性急需解决问题抗菌肽药物具抗菌谱广作强迅速易产生耐药等优点优点抗菌肽类药物巨开发价值具成取代抗生素新型抗菌药物潜然抗菌肽源非常广泛源动物植物微生物等抗菌肽工艺化生产许问题需解决天然抗菌肽少工合成抗菌肽成太高形势寻找量合成抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法文目文通查阅量相关文献综合实际情况选择DNA合成仪合成抗菌肽基肠杆菌作表达系统通融合表达方式生产抗菌肽根肠杆菌密码子偏爱性稀密码子改造抗菌肽基 首先数库作理基础计算机软件作理辅助理筛选出抗菌活性抗菌肽通实验进步筛选终选出优异抗菌基然通基工程制备出抗菌肽通TTC微量稀释法检测抗菌肽抑菌活性
关键词：抗菌肽生产工艺基工程抑菌活性
Abstract
Antimicrobial peptides are members of the antibiotic family In recent years an urgent problem is that the overuse of antibiotics leads to antibiotic resistance Antimicrobial peptides have many important advantages such as broad spectrum antimicrobial strong and fast effect and uneasy to produce drug resistance These advantages make antimicrobial peptides possess tremendous value on the field of new drugs development and thus the potential to become a perfect alternative of antibiotics Although antimicrobial peptides can be obtained from wide range of sources for instance animals plants and microorganisms there are many problems need to be solved before its’ factory production Nowadays seldom natural antimicrobial peptides are available and the synthesis of these peptides is expensive Therefore the aim of this study is to develop an effective strategy for producing antimicrobial peptides at relatively low cost We firstly synthesize antimicrobial peptide genes with DNA synthesizer the Escherichia coli was selected as expression system to produce antimicrobial peptides from the synthesized genes Primers were designed according to the E coli codon preference and amino acid sequence of antimicrobial peptides Recombinant expression vectors were constructed and induce expressed in E coli Gene products were purified by hydroxylamine cut buffer to release antimicrobial peptides Activity of antimicrobial peptides was detected by TTC microdilution
Keywords antimicrobial peptides production process genetic engineering antibacterial activity
第章 文献综述
抗菌肽(antimicrobial petidesAMPs)生物体中具抗菌活性肽类物质总称宿产生类够抵抗外界病原体感染分子蛋白生物体先天免疫系统重组成部分真菌细菌病毒线虫等具广泛杀伤活性[1]抗菌肽传统抗生素化学药物作机制具明显差异抗菌谱广作强迅速易产生耐药等优点抗菌肽药物成理想抗菌药物年关抗菌肽研究越越学者抗菌肽分离纯化氨基酸序列分析抗菌肽作机理研究蛋白质结构功分析改造设计合成新型抗菌肽动植物转抗菌肽基工程抗菌肽基工程等方面做量工作[8]
11抗菌肽分类
抗菌肽分类方式分类分类结果：（1）根抗菌肽源抗菌肽分动物源抗菌肽植物源抗菌肽微生物源抗菌肽动物源抗菌肽包括昆虫抗菌肽哺乳动物抗菌肽两栖类抗菌肽节肢动物抗菌肽贝类抗菌肽原索类抗菌肽鸟类抗菌肽鱼类抗菌肽等植物源抗菌肽种类繁源种植物存植物种组织中现已发现植物源抗菌肽硫素转脂蛋白knottin类抗菌肽植物防御素橡胶蛋白类等微生物源抗菌肽包括病毒源细菌源现已发现微生物抗菌肽短杆菌肽S粘菌素杆菌肽乳链菌肽勃菌素E等[1]（2）根氨基酸序列二级结构抗菌肽分α螺旋型抗菌肽β折叠抗菌肽具环形结构抗菌肽伸展性抗菌肽[1]（3）根带电荷抗菌肽分非阳离子阳离子两种抗菌肽[1]（4）根抗菌蛋白作机制分类亲环素蛋白葡聚糖酶脂转移蛋白核糖体失活蛋白2S清蛋白类蛋白酶抑制剂丁质酶类丁质酶防御素类防御素蛋白等[1]
12抗菌肽性质
121抗菌肽般理化性质
抗菌肽分子量般30氨基酸残基组成超5010kD热稳定性高通常100℃加热十分钟保持活性水溶性抗酸碱力强强酸强碱条件保持较高活性具两亲性部分阳离子特征
122抗菌肽生物学特性
传统抗生素仅细菌作抗菌肽抗菌谱广仅革兰阴性菌革兰阳性菌抑制作真菌病毒原生动物作抗菌肽生物学特性包括（1）抗菌活性（2）抗肿瘤活性抗菌肽选择性杀死肿瘤细胞正常细胞损害作特性抗菌肽成抗肿瘤潜力药物（3）抗病毒活性（4）抗寄生虫活性（5）免疫活性抗菌肽调节免疫活性
13抗菌肽作机理
抗菌肽作机制目前没统说法认抗菌肽通细胞膜作研究员认抗菌肽通细胞膜特异物质作认抗菌肽通细胞壁线粒体等作具体纳：（1）抗菌肽通改变细胞膜通透性起作数抗菌肽属阳离子型具两亲α螺旋型两亲β折叠结构两亲α螺旋正电荷细菌质膜磷脂分子负电荷通静电作抗菌肽分子中疏水端插入细菌质膜中然两亲性α螺旋插入中破坏质膜结构终渗透压改变细菌死亡（2）抗菌肽通细菌胞酶结构功细菌胞信号转导影响起作抗菌肽直接作细胞质DNA干扰细菌外膜蛋白转录抑制细菌生长达抑菌效果（3）抗菌肽直接细胞壁作（4）抗菌肽直接作线粒体
14抗菌肽制备方法
目前抗菌肽制备方法生物材料提取化学合成法基工程法酶解法4种方法获
141生物材料提取法
分子肽提取方法：中性盐沉淀法机溶剂抽提法机酸提法等[15]组织捣碎机组织捣碎组织捣碎完超声波细胞破碎机细胞完全破坏细胞完全破坏乙酸浸提获定抗菌肽然采SephadexLH20 凝胶柱滤层析分盐类蛋白质分开利RPHPLC具活性SephadexLH20凝胶柱收集物进行进步洗脱纯化[ 1718]通天然生物中提取抗菌肽工序：浸提吸附洗脱盐析凝胶滤离子交换层析反层析[16]生物材料提取天然抗菌肽方法操作技术简单原料源广天然抗菌肽数量极少提取样品量法达生产应需求实验研究
142化学合成法
化学合成法已知抗菌肽氨基酸序列通工合成方式氨基酸残基连接起通研究种方法抗菌肽某氨基酸进行删换抗菌肽抗菌效果更合成肽链长度限制需量机溶剂化学合成法制备抗菌肽成较高进行产业化生产困难
143基工程法
基工程法通基组中分离获抗菌肽目基然段基克隆复制选载体连接构成重组质粒定方法重组质粒转移受体菌中诱导重组质粒受体菌中表达获抗菌肽程基工程法制备抗菌肽获量抗菌肽产物成较低通基工程法制备某抗菌肽二三级结构天然抗菌肽差致抗菌肽抗菌活性降时某抗菌肽会杀灭受体菌方法制备抗菌肽定困难需解决难题
144酶解法
酶解法通食品级酶某利率生物效价高农副产品蛋白质进行水解获抗菌肽[16]利蛋白水解法制备抗菌肽操作简单条件容易控制济环保目前已研究者通种方法制备出抗菌肽袁永俊等[19]已蛋白水解法制备出酪蛋白抗菌肽蛋白水解法制备抗菌肽较理想方法蛋白水解法足处：首先种方法受蛋白酶身影响次水解程中产生副产物会纯化效率降低导致产物量降低抗菌肽纯度降低
综提四种制备抗菌肽方法优缺点中基工程法酶解法发展前景研究价值
15抗菌肽方面应前景目前存问题
抗菌肽具抗菌谱广耐受性易产生耐药性等优点抗菌肽发展前景研究中抗菌肽仅医疗方面领域食品畜牧业转基方面传统抗生素法代优越性现已证实抗菌肽药物代抗菌优越性真正抗菌肽药物推市场存问题首先抗菌肽研究历史长资料缺乏药安全性法保证次抗菌肽源需解决问题
151抗菌肽医疗方面应
青霉素发现抗生素滥越越严重产生耐药性越越受重视情况抗菌肽身分子量热稳定性高抗酸碱力强广泛抗菌产生耐药性等特点抗菌方面天独厚优越性学者已研究抗菌肽床应价值目前抗菌肽数库APD中已发现2400种抗菌肽国际知名药厂已研究开发抗菌肽类新药然抗菌肽药物研究时间较短资料欠缺药物FDA审批程序中某新药已取良床试验
152抗菌肽食品方面应
食品防腐剂量逐渐增越越食品防腐剂证实存安全隐患天然食品防腐剂越越备受青睐抗菌肽低毒性易消化水解具良水溶性稳定性作天然防腐剂抗菌肽加入食品中制作种功性食品制成保健营养品时抗菌肽作食品质量增效剂[20]
153抗菌肽禽畜养殖业方面应
饲料中添加抗生素抑制病菌繁殖着抗生素滥饲料中添加抗生素出现问题药物残留较严重影响禽畜产品质量体健康等抗菌肽具抗菌谱广抗菌机制独特易产生耐药性等特点优点抗菌肽成新型饲料添加剂宠
155抗菌肽研究存问题
着抗菌肽研究深入抗菌肽应发掘越越研究证明抗菌肽具广泛途抗菌肽走市场长段路走目前存问题需解决：1）抗菌肽毒理性药理药效研究数极少食计量药方式作时间需作进步研究2）抗菌肽制备问题天然抗菌肽含量极低提取工艺复杂致产率极低利化学合成法制备成高外法保证抗菌肽结构活性基工程技术制备抗菌肽抗菌肽工程菌抑制作抗菌肽表达效率较低酶解法制备抗菌肽仅资源限纯化问题着肽蛋白质化学结构越越解工合成目肽蛋白质手段研究中较常见原种方法较快速种方法昂贵般研究领域成太高难达产业化规模目前抗菌肽制备已成抗菌肽研究难题
16基工程制备抗菌肽简介
抗菌肽制备研究抗菌肽难题通研究发现基工程技术微生物发酵抗菌肽规模化生产效途径仅降低成受天然资源少限制废液处理工艺较成熟目前许研究者研究基工程制备抗菌肽通基工程表达抗菌肽存问题：抗菌肽宿菌毒性作会抑制宿菌生长降低抗菌肽表达外通基工程表达出抗菌肽产物会基工程菌蛋白酶降解影响产量针两问题国外学者提出解决方案方面分子角度设计改造抗菌肽方面制备重组抗菌肽角度优化抗菌肽表达[3]
161抗菌肽分子设计改造策略
抗菌肽制备生产方面问题外药理方面问题抗菌肽想取代抗生素位置需克服困难通研究发现抗菌肽抗菌活性存问题少数抗菌肽进入床试验阶段床研究中发现抗菌肽存着许问题毒性强稳定性差成高选择性差等 研究者抗菌肽进行分子设计结构改造修饰发现降低抗菌肽毒性增加稳定性选择性天然抗菌肽数库中通序列结构源性分析确定残基保守模式（疏水性电荷数电性极性等）知模板序列[3]选择天然活性较强抗菌基作模板序列优良母板序列基础通肽链氨基酸残基设计肽片段拼接设计肽链环合设计计算机辅助设计靶设计模拟生物模型设计改造抗菌肽获新型抗菌肽效途径[3]
1611氨基酸残基设计
抗菌肽生物活性定程度受抗菌肽带电荷两亲性氨基酸影响通增加肽链正电荷数改变两亲性氨基酸例换氨基酸残基抗菌肽组合设计筛选帮助定范围抗菌肽抗菌活性会着正电荷数增加增加增加某值便增加猜测正电荷导致抗菌肽磷脂头部牢固结合抗菌肽穿膜效率降时正电荷数超界值致抗菌肽分子间静电斥力抗菌肽分子膜静电引力阻碍膜抗菌肽分子聚集穿膜孔道形成降低抗菌活性膜裂解力 马清泉等通螺旋轮亲水面设计精氨酸疏水面设计亮氨酸缬氨酸获具良活性新型抗菌肽LGG16[3]通Frecer等试验证明选择性亲水性更强氨基酸残基换疏水面部分氨基酸残基降低溶血活性时抗菌活性没影响外增加极性面亲水氨基酸残基增强抗菌活性[3]
1612肽片段拼接设计
蛋白质工程酶工程生产杂合蛋白杂合酶研究思路研究者进行拼接设计通分析抗菌肽理化性质活性截取功区域获毒副作更活性更高杂合肽[3] 目前成功抗菌肽CecropinAMelittin拼接杂合肽仅抗菌活性增强蜂毒肽Melittin溶血活性降低外李国栋等抗菌肽CecropinAlN端(KWKLFKKI)鸡源抗菌肽Cathelicidin2(CATH2)拼接抗菌肽缩减抗菌肽抑菌浓度[21]
1613肽链环合设计
维持肽链结构稳定性通肽链环合环合肽链宿菌分泌蛋白酶抵抗力增强线性抗菌肽容易血浆酶降解环合仅肽链稳定性增强抗疟疾抗肿瘤活性提高毒性作降低目前研究者研究成功KLK2鸡源抗菌肽CATH2等
1614 计算机辅助设计
王远强通计算机辅助设计优势位点保守残基优势氨基酸分析基础结合2DQSAR3DQSAR结果建立QSAR模型理筛选活性较肽通试验验证[22] 谢秀枝等通抗菌肽CaseicinA氨基酸排列序重排20种突变体中筛选获原始抗菌肽活性更高序列[24]
1615靶设计
年靶性设计抗菌肽变异体抗菌肽药物研发方面优势较Ecert等开发设计选择性抗菌肽STAMP技术[3]种技术关键利灵活连接体AMP区域靶定位区域连接起机制通靶定位区达致病菌表面AMP区域负责破坏致病菌细胞膜终消灭致病菌非致病菌作[3]特异性靶抗菌肽区域识位点提高消灭病原微生物选择性治疗肿瘤较选择具免疫识杀菌抗体药物络合物毒性电荷疏水性外激素受体抗体抗体变区信息素等影响靶区域病原微生物结合素外致病菌生长程中会改变周围环境改变环境易引起致病菌生长果设计出感应环境变化发挥相应作抗菌肽够特异性抑制消灭致病菌繁殖保护正常菌群预防治疗致病菌新方法[3]已研究者构建出酸碱度敏感选择性抗菌肽发挥作设计靶性环境感应型抗菌肽未抗菌肽研发方
1616模拟生物模型设计
模拟生物模型着生物技术发展显越越重膜作机制角度探索抗菌肽靶细胞膜影响提供定理基础更设计获抗菌肽验证抗菌肽靶细胞膜穿透效率唐文婷通模拟细胞膜法抗菌肽进行筛选分离发现模拟细胞膜构成脂质疏水性烃基链电荷性异极性头决定磷脂双分子层抗菌肽辨识度亲性进影响筛选结果[25]黄金丰典型α－螺旋型膜活性肽模型研究细胞膜构效关系发现肽满足物理化学条件求时细胞膜位点结合力更强[26]冉瑜研究构象抗菌肽膜结合力设计含单活性序列短链肽含双活性序列环形肽线性肽结果发现双活性序列环形肽线性肽更易磷脂酰胆碱磷脂酰甘油作单活性序列基反应推测单活性序列通细胞靶点作起杀菌效果[27]出预测检测抗菌肽作效果方面模拟生物膜技术提供参考
162目基获取
目基获取方法：基文库中获取二通工合成 三PCR技术扩增目基研究早期般构建文库DNARNA模板PCR技术扩增获两种方法费时间精力生产程中显然行着DNA合成仪产生DNA合成仪合成需目核苷酸片段种方法仅快速获意核苷酸序列目基片段节省时间精力抗菌肽编码基cDNA片段较通常仅百bp甚十bp通工方法直接合成抗菌肽cDNA编码基时两端引入粘性接头构建表达载体减少基片段损失简化基工程操作程直接根抗菌肽氨基酸序列研究目助计算生物学手段优化设计cDNA编码序列采工方法合成获基片段然直接构建表达载体失种简便快捷效方法[7]
163制备重组抗菌肽
目前百分二十重组抗菌肽没采原核表达系统制备［28］原核表达系统存问题首先原核表达系统表达抗菌肽易抗菌肽抑制生长甚杀伤死亡次表达程中表达程抗菌肽稳定性值关注点研究者通研究发现解决两问题方法通抗菌肽融合标签表达
1631融合表达
抗菌肽融合表达暂时改变抗菌肽构象降低原核表达系统作表达产物需酶化学试剂裂解纯化具活性然融合表达系统中融合标签作关重目前根融合标签功融合标签分促进蛋白溶分子伴侣促进包涵体形成分子伴侣两种第种谷胱甘肽转移酶GST泛素相关蛋白修饰SUMO硫氧原蛋白Trx第二种包涵体易分离常弹性蛋白丁酯结合结构域亲标签结合[29] 年研究者进行重组蛋白表达研究时采体蛋白酶带动剪切功切割效率高
1632串联表达
抗菌肽分子克隆表达分离纯化检测工序繁琐回收产率较低抗菌肽串联表达仅提高抗菌肽回收效率保持抗菌肽活性降低宿细胞作增加抗菌肽稳定性表达量便识分离串联表达肽聚体需条肽基间加具裂解特性基序列表达出识短肽片段方法：①非酶类裂解点②肽酶切位点 ③混合肽切割点[3]
第二章 抗菌肽制备工艺
目前抗菌肽制备通生物材料提取化学合成法基工程法酶解法4种方法获四种方法制备抗菌肽存问题生物材料提取天然抗菌肽方法操作技术简单原料源广天然抗菌肽数量极少提取样品量法达生产应需求实验研究化学合成法合成肽链长度限制需量机溶剂化学合成法制备抗菌肽成较高进行产业化生产困难基工程法制备抗菌肽获量抗菌肽产物成较低通基工程法制备某抗菌肽会杀灭受体菌方法制备抗菌肽定困难需解决难题酶解法受蛋白酶身影响次水解程中产生副产物会纯化效率降低导致产物量降低抗菌肽纯度降低四种方法缺点通较会发现基工程法制备抗菌肽具发展潜力文基工程法基础设计较合理合成量抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法
21目前抗菌肽生产方法
抗菌肽研究起步20世纪80年代昆虫动物植物微生物等生物中分离通化学合成法直接合成基工程法通宿表达抗菌肽十年研究发展出现市场成品已生产生活带新变化发展目前进入市场抗菌肽生物材料提取法基工程法制备成基工程法受原材料缺乏限制生产成较低备受青睐目前基工程法制备抗菌肽工艺流程：
制备目基
构建重组表达载体
目基片段载体相连
连接产物转入宿菌
筛选鉴定
重组质粒宿菌中表达
融合蛋白表达制备
抗菌肽切割纯化
抗菌肽抗菌活性检测
图1 基工程法制备抗菌肽流程图
种基工程法制备抗菌肽融合表达策略解决表达抗菌肽抑制宿菌生长问题时简化抗菌肽纯化分离种方法制备抗菌肽需已知抗菌肽基序列基础进行
22抗菌肽制备改造设计
抗菌肽制备工艺设计部分通阅读文献基工程方法制备抗菌肽基础根研究者研究NCBI数库APD数库设计较合理合成量抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法文抗菌肽进行规模化生产前先筛选出优异抗菌肽筛选方法先通生物信息学统计学工具优化抗菌肽结构参数根肠杆菌密码子偏爱性抗菌肽基序列换成肠杆菌偏爱密码子根稀密码子存会影响抗菌肽表达产量稀密码子换成密码子稀密码子剔应计算机软件辅助已改造抗菌肽基进行初步筛选然工合成抗菌肽分离纯化合成抗菌肽进行结构检测抗菌活性检测筛选出抗菌活性较基序列筛选出优异基基工程法规模化生产出检测否具生物学活性
221抗菌肽改造原
基工程法制备抗菌肽融合表达策略解决表达抗菌肽抑制宿菌生长问题时简化抗菌肽纯化分离种方法制备抗菌肽需已知抗菌肽基序列基础进行抗菌肽基序列里仅含稀密码子含抗菌肽表达产量降低核苷酸序列方法制备出抗菌肽产量会理想抗菌肽基进行改编仅会抗菌肽生物学活性更提高抗菌肽产量1）进行抗菌肽制备时果选肠杆菌做表达系统肠杆菌某密码子具偏爱性适增加肠杆菌偏爱密码子会发现抗菌肽表达产量提高2）果基序列含稀密码子时会影响抗菌肽表达基序列中稀密码子换剔时抗菌肽表达产量提高基工程制备抗菌肽时候果先抗菌肽基进行研究然影响表达密码子换成提高产量密码子适增加表达系统偏爱密码子会提高抗菌肽产量
222抗菌肽改造方法
抗菌肽改造根数库查询抗菌肽信息稀密码子肠杆菌密码子偏爱性然通计算机辅助设计优势位点保守残基优势氨基酸分析基础结合2DQSAR3DQSAR结果建立QSAR模型进行初步筛选理筛选活性较肽通试验验证计算机筛选出抗菌肽工合成合成抗菌肽分离纯化进行结构检测抗菌活性检测筛选出具抗菌活性抗菌肽基序列
223抗菌肽改造
整改造方法数库作理研究者研究容参考具定行性
天然抗菌肽
通生物信息学统计学工具优化抗菌肽结构参数
计算机软件筛选
改造天然抗菌肽
固相合成HPLC纯化
结构检测
活性检测
筛选出优异抗菌肽
图2 抗菌肽筛选
23抗菌肽筛选
231通生物信息学工具优化抗菌肽结构参数
生物信息学门计算机基础研究生物学学科进行生物数序列测定分析等[30]欧洲生物信息学研究( EBI) 日生物信息学中心( CBI) 美国国立生物技术中心( NCBI)目前国际三蛋白质核苷酸公数库[30]生物信息学进行蛋白质结构预测系统发育分析序列[30]利NCBI数库运生物信息学方法植物抗菌肽分类跨膜区域均疏水性亚细胞定位信号肽等方面进行简分析预测着抗菌肽研究断深入生物信息学断发展应生物信息学方法分析预测抗菌肽会取更发展空间利软件预测抗菌肽结构特点抗菌肽活性影响 工设计合成杂合肽成抗菌肽研究热点
232抗菌肽合成纯化
2321 抗菌肽合成
抗菌肽合成固相合成方法固相合成法反应容器中进行完反应操作简单便动化理产物易分离想提高产物量通加入量反应物固相法合成抗菌肽氯甲基聚苯乙烯树脂作固相载体三氟乙酸脱掉氨基保护基氨基酸接固相载体然DCC（NN’二环基碳二亚胺）活化氨基酸相互反应形成肽键合成完成HF水解合成肽链固相载体间脂键独立合成抗菌肽
2322抗菌肽纯化
抗菌肽纯化较复杂程需保证抗菌肽生物活性前提纯化抗菌肽说制备抗菌肽关键点天然抗菌肽般先进行超速离心分子杂蛋白进行纯化分离层析法高效液相色谱法（HPLC）采半制备型HPLC制备抗菌肽进行进步分离纯化收集洗脱峰进行浓缩方便面鉴定
233抗菌肽活性检测
抗菌肽活性检测选TTC（氯化三苯四氮唑）微量稀释法TTC种氧化原色素作氢受体细菌脱氢辅酶氢原色TTC变成红色溶水三苯甲腙[13]1％吧TTC加入已纯化抗菌肽中TTC终浓度低0005mgml（TTC高浓度时某细菌明显抑菌作）[13]处数期细菌（金黄色葡萄球菌肠杆菌铜绿假单孢菌等）适宜条件放置LB液体培养基中培养段时间取定量菌液稀释数倍接种LB抗固体板先培养半时菌液吸收完全孔器孔含TTC纯化抗菌肽注入孔适宜温度培养（根细菌生长条件）定时间观察根否变红判断抗菌效果变红抗菌效果理想未变红抗菌效果
234抗菌肽结构检测
抗菌肽结构分级结构高级结构级结构送检测机构进行检测目前国已检测机构够测定氨基酸序列抗菌肽送相关机构检测级结构高级结构测定两种方法：1）理方法软件数库级结构输入通建立模型理确定高级结构2）实验方法通X衍射核磁振等方法确定高级结构节约成选择理方法进行二级结构检测
研究发现特殊氨基酸肽链长度会影响抗菌肽抗菌活性通影响疏水性二级结构抗菌肽溶液膜状态抗菌肽带静电荷疏水性影响膜结合力影响抗菌活性般认正电荷负电荷机制清楚
制备抗菌肽
构建重组表达载体
目基片段载体相连
连接产物转入肠杆菌
筛选鉴定
重组质粒肠杆菌中表达
融合蛋白表达制备
抗菌肽切割纯化
抗菌肽抗菌活性检测
图1 基工程法制备抗菌肽流程图
24宿菌育种车间工艺流程设备
241设备途：
DNA合成仪2台分合成目基表达载体
保温罐 1 作反应器分目基表达载体进行双酶切双酶切加热高温段时间限制性切酶失活
配料罐 2 作培养基原料配制稀释含特殊营养物质培养基配制稀释
瞬时灭菌器3 作培养基加热灭菌
微生物液体连续培养器 3作宿菌培养包括激活培养转化培养筛选培养
242制备基
2421制备目基
稀密码子基表达定影响通常情况会降低抗菌肽基表达水肠杆菌基密码子定偏爱性根种偏爱性稀密码子换成表达宿偏爱密码子根密码子偏爱性碱基例设计抗菌肽基DNA合成仪合成 减少基片段损失简化基工程操作程根已设计核苷酸序列 时两端引入粘性接头构建表达载体
2422制备载体基
DNA合成仪合成合成两条反相互补寡核苷酸链两条引物5’端分引入两限制性酶切位点目片段游引入羟胺切割蛋白位点[8]
243构建重组表达载体
表达载体质粒中加入两限制性酶进行双酶切混匀适合温度水浴加热段时间时合成目基相条件进行双酶切里果想缩短酶切时间加入点Fast Digest Buffer双酶切分反应体系高温限制性切酶失活
244目基片段载体连接
回收表达载体目基片段加入加入高效连接DNA酶混匀室温反应半时左右
245宿菌制备
宿菌制备包括宿菌选择保存制备
2451宿菌选择
基工程制备抗菌肽需宿细胞表达抗菌肽目前宿表达肠杆菌中表达酵母菌中表达昆虫杆状病毒表达系统转基动植物中表达[8]肠杆菌表达系统具产量高生长快速操作简单目基导入容易方便成低等优点选择肠杆菌宿菌
2452 宿菌保存
宿菌选肠杆菌进行生产前肠杆菌应保存真空冷冻干燥状态状态肠杆菌酶活性均已抑制降低菌种变异速度般保存80℃左右冰箱液氮中温度加入甘油减少冰晶形成甘油细菌毒性
2453菌种制备
低温环境取出保存肠杆菌接种抗生素液体培养罐中培养罐中加NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质离子水溶解NaOH调节PH接种肠杆菌前培养罐进行高温高压灭菌适合温度搅拌培养十时培养液转离心机中离心降低温度菌种停止生长预冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞低温放置段时间细胞液中加菌甘油低温保存
246连接产物转入肠杆菌
连接产物加肠杆菌细胞悬液中混匀低温放置段时间加入预热含抗生素液体培养罐培养灌中加NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质离子水溶解NaOH调节PH接入细胞悬液前培养罐进行高温高压灭菌接种混匀摇床培养肠杆菌恢复正常生长状态
2 47 筛选
离心菌液接入含Amp（筛选出含Amp抗性基）培养罐中培养罐中加入NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质外加入Amp琼脂粉样接种前需培养罐进行高温高压灭菌培养段时间选出转化成功肠杆菌
25抗菌肽表达纯化分离工艺流程设备
251设备途：
配料罐1含特殊营养物质培养基配制稀释
培养罐1培养转化宿菌
离心机1离心培养菌液
252重组质粒肠杆菌中表达
取重组质粒转化入肠杆菌保存菌液接入含氨苄青霉素液体培养罐中室温搅拌培养夜加入培养液继续培养加IPTG(异丙基 β D 硫代吡喃半乳糖苷）室温诱v导表达
253融合蛋白表达制备
然转入离心机中低温离心段时间收集菌体离子水洗涤次离心洗涤液低温条件灭菌PBS缓液重悬高压重复破碎菌体加入Triton X100DNaseRNase低速搅拌孵育离心取清液加DTT纯化融合蛋白
254抗菌肽切割纯化
纯化融合蛋白加入羟胺切割缓液（盐酸羟胺三羟基甲基氨基甲烷溶ddH2O中然NaOH调节PH溶液）适合温度水浴加热盐酸PH调中性降低温度低温PBS透析天夜透析Glitathione Sepharose 4B 亲层析凝胶柱杂质
26抗菌肽抗菌活性检测
抗菌肽活性检测选TTC（氯化三苯四氮唑）微量稀释法TTC种氧化原色素作氢受体细菌脱氢辅酶氢原色TTC变成红色溶水三苯甲腙[13]1％吧TTC加入已纯化抗菌肽中TTC终浓度低0005mgml（TTC高浓度时某细菌明显抑菌作）[13]处数期细菌（金黄色葡萄球菌肠杆菌铜绿假单孢菌等）适宜条件放置LB液体培养基中培养段时间取定量菌液稀释数倍接种LB抗固体板先培养半时菌液吸收完全孔器孔含TTC纯化抗菌肽注入孔适宜温度培养（根细菌生长条件）定时间观察根否变红判断抗菌效果变红抗菌效果理想未变红抗菌效果
第三章 抗菌肽药物前景展
抗菌肽作新代会产生耐药性抗菌药物然发展前景较客观实际应中存问题抗菌肽规模化制备需解决问题首先分离纯化天然抗菌肽仅缺乏资源工艺较复杂难度非常导致效率极低次基工程方法制备抗菌肽融合表达策略基会出现产率低情况外抗菌肽药效学药动学毒性免疫原性研究少想抗菌肽投放市场需抗菌肽规模化制备应效果副作等进行进步研究抗菌肽存问题已少抗菌肽进入Ⅲ期床试验阶段抗菌肽出现抵抗肿瘤病毒疾病提供更性开发新抗菌药物提供理基础着研究员抗菌肽研究深入相信抗菌肽更类服务
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抗菌肽药物制备方法 2
第章 文献综述 4
11抗菌肽分类 4
12抗菌肽性质 5
121抗菌肽般理化性质 5
122抗菌肽生物学特性 5
13抗菌肽作机理 5
14抗菌肽制备方法 6
141生物材料提取法 6
142化学合成法 6
143基工程法 6
144酶解法 7
15抗菌肽方面应前景目前存问题 7
151抗菌肽医疗方面应 7
152抗菌肽食品方面应 8
153抗菌肽禽畜养殖业方面应 8
155抗菌肽研究存问题 8
16基工程制备抗菌肽简介 9
161抗菌肽分子设计改造策略 9
162目基获取 12
163制备重组抗菌肽 12
第二章 抗菌肽制备工艺 14
21目前抗菌肽生产方法 14
22抗菌肽制备改造设计 16
221抗菌肽改造原 16
222抗菌肽改造方法 17
223抗菌肽改造 17
图2 抗菌肽筛选 18
23抗菌肽筛选 19
231通生物信息学工具优化抗菌肽结构参数 19
232抗菌肽合成纯化 19
233抗菌肽活性检测 20
234抗菌肽结构检测 20
24宿菌育种车间工艺流程设备 22
241设备途： 22
242制备基 22
243构建重组表达载体 23
244目基片段载体连接 23
245宿菌制备 23
246连接产物转入肠杆菌 24
2 47 筛选 24
25抗菌肽表达纯化分离工艺流程设备 24
251设备途： 24
252重组质粒肠杆菌中表达 24
253融合蛋白表达制备 25
254抗菌肽切割纯化 25
26抗菌肽抗菌活性检测 25
第三章 抗菌肽药物前景展 26
抗菌肽药物制备方法
摘
抗菌肽抗生素种年抗生素滥导致抗生素耐药性急需解决问题抗菌肽药物具抗菌谱广作强迅速易产生耐药等优点优点抗菌肽类药物巨开发价值具成取代抗生素新型抗菌药物潜然抗菌肽源非常广泛源动物植物微生物等抗菌肽工艺化生产许问题需解决天然抗菌肽少工合成抗菌肽成太高形势寻找量合成抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法文目文通查阅量相关文献综合实际情况选择DNA合成仪合成抗菌肽基肠杆菌作表达系统通融合表达方式生产抗菌肽根肠杆菌密码子偏爱性稀密码子改造抗菌肽基 首先数库作理基础计算机软件作理辅助理筛选出抗菌活性抗菌肽通实验进步筛选终选出优异抗菌基然通基工程制备出抗菌肽通TTC微量稀释法检测抗菌肽抑菌活性
关键词：抗菌肽生产工艺基工程抑菌活性
Abstract
Antimicrobial peptides are members of the antibiotic family In recent years an urgent problem is that the overuse of antibiotics leads to antibiotic resistance Antimicrobial peptides have many important advantages such as broad spectrum antimicrobial strong and fast effect and uneasy to produce drug resistance These advantages make antimicrobial peptides possess tremendous value on the field of new drugs development and thus the potential to become a perfect alternative of antibiotics Although antimicrobial peptides can be obtained from wide range of sources for instance animals plants and microorganisms there are many problems need to be solved before its’ factory production Nowadays seldom natural antimicrobial peptides are available and the synthesis of these peptides is expensive Therefore the aim of this study is to develop an effective strategy for producing antimicrobial peptides at relatively low cost We firstly synthesize antimicrobial peptide genes with DNA synthesizer the Escherichia coli was selected as expression system to produce antimicrobial peptides from the synthesized genes Primers were designed according to the E coli codon preference and amino acid sequence of antimicrobial peptides Recombinant expression vectors were constructed and induce expressed in E coli Gene products were purified by hydroxylamine cut buffer to release antimicrobial peptides Activity of antimicrobial peptides was detected by TTC microdilution
Keywords antimicrobial peptides production process genetic engineering antibacterial activity
第章 文献综述
抗菌肽(antimicrobial petidesAMPs)生物体中具抗菌活性肽类物质总称宿产生类够抵抗外界病原体感染分子蛋白生物体先天免疫系统重组成部分真菌细菌病毒线虫等具广泛杀伤活性[1]抗菌肽传统抗生素化学药物作机制具明显差异抗菌谱广作强迅速易产生耐药等优点抗菌肽药物成理想抗菌药物年关抗菌肽研究越越学者抗菌肽分离纯化氨基酸序列分析抗菌肽作机理研究蛋白质结构功分析改造设计合成新型抗菌肽动植物转抗菌肽基工程抗菌肽基工程等方面做量工作[8]
11抗菌肽分类
抗菌肽分类方式分类分类结果：（1）根抗菌肽源抗菌肽分动物源抗菌肽植物源抗菌肽微生物源抗菌肽动物源抗菌肽包括昆虫抗菌肽哺乳动物抗菌肽两栖类抗菌肽节肢动物抗菌肽贝类抗菌肽原索类抗菌肽鸟类抗菌肽鱼类抗菌肽等植物源抗菌肽种类繁源种植物存植物种组织中现已发现植物源抗菌肽硫素转脂蛋白knottin类抗菌肽植物防御素橡胶蛋白类等微生物源抗菌肽包括病毒源细菌源现已发现微生物抗菌肽短杆菌肽S粘菌素杆菌肽乳链菌肽勃菌素E等[1]（2）根氨基酸序列二级结构抗菌肽分α螺旋型抗菌肽β折叠抗菌肽具环形结构抗菌肽伸展性抗菌肽[1]（3）根带电荷抗菌肽分非阳离子阳离子两种抗菌肽[1]（4）根抗菌蛋白作机制分类亲环素蛋白葡聚糖酶脂转移蛋白核糖体失活蛋白2S清蛋白类蛋白酶抑制剂丁质酶类丁质酶防御素类防御素蛋白等[1]
12抗菌肽性质
121抗菌肽般理化性质
抗菌肽分子量般30氨基酸残基组成超5010kD热稳定性高通常100℃加热十分钟保持活性水溶性抗酸碱力强强酸强碱条件保持较高活性具两亲性部分阳离子特征
122抗菌肽生物学特性
传统抗生素仅细菌作抗菌肽抗菌谱广仅革兰阴性菌革兰阳性菌抑制作真菌病毒原生动物作抗菌肽生物学特性包括（1）抗菌活性（2）抗肿瘤活性抗菌肽选择性杀死肿瘤细胞正常细胞损害作特性抗菌肽成抗肿瘤潜力药物（3）抗病毒活性（4）抗寄生虫活性（5）免疫活性抗菌肽调节免疫活性
13抗菌肽作机理
抗菌肽作机制目前没统说法认抗菌肽通细胞膜作研究员认抗菌肽通细胞膜特异物质作认抗菌肽通细胞壁线粒体等作具体纳：（1）抗菌肽通改变细胞膜通透性起作数抗菌肽属阳离子型具两亲α螺旋型两亲β折叠结构两亲α螺旋正电荷细菌质膜磷脂分子负电荷通静电作抗菌肽分子中疏水端插入细菌质膜中然两亲性α螺旋插入中破坏质膜结构终渗透压改变细菌死亡（2）抗菌肽通细菌胞酶结构功细菌胞信号转导影响起作抗菌肽直接作细胞质DNA干扰细菌外膜蛋白转录抑制细菌生长达抑菌效果（3）抗菌肽直接细胞壁作（4）抗菌肽直接作线粒体
14抗菌肽制备方法
目前抗菌肽制备方法生物材料提取化学合成法基工程法酶解法4种方法获
141生物材料提取法
分子肽提取方法：中性盐沉淀法机溶剂抽提法机酸提法等[15]组织捣碎机组织捣碎组织捣碎完超声波细胞破碎机细胞完全破坏细胞完全破坏乙酸浸提获定抗菌肽然采SephadexLH20 凝胶柱滤层析分盐类蛋白质分开利RPHPLC具活性SephadexLH20凝胶柱收集物进行进步洗脱纯化[ 1718]通天然生物中提取抗菌肽工序：浸提吸附洗脱盐析凝胶滤离子交换层析反层析[16]生物材料提取天然抗菌肽方法操作技术简单原料源广天然抗菌肽数量极少提取样品量法达生产应需求实验研究
142化学合成法
化学合成法已知抗菌肽氨基酸序列通工合成方式氨基酸残基连接起通研究种方法抗菌肽某氨基酸进行删换抗菌肽抗菌效果更合成肽链长度限制需量机溶剂化学合成法制备抗菌肽成较高进行产业化生产困难
143基工程法
基工程法通基组中分离获抗菌肽目基然段基克隆复制选载体连接构成重组质粒定方法重组质粒转移受体菌中诱导重组质粒受体菌中表达获抗菌肽程基工程法制备抗菌肽获量抗菌肽产物成较低通基工程法制备某抗菌肽二三级结构天然抗菌肽差致抗菌肽抗菌活性降时某抗菌肽会杀灭受体菌方法制备抗菌肽定困难需解决难题
144酶解法
酶解法通食品级酶某利率生物效价高农副产品蛋白质进行水解获抗菌肽[16]利蛋白水解法制备抗菌肽操作简单条件容易控制济环保目前已研究者通种方法制备出抗菌肽袁永俊等[19]已蛋白水解法制备出酪蛋白抗菌肽蛋白水解法制备抗菌肽较理想方法蛋白水解法足处：首先种方法受蛋白酶身影响次水解程中产生副产物会纯化效率降低导致产物量降低抗菌肽纯度降低
综提四种制备抗菌肽方法优缺点中基工程法酶解法发展前景研究价值
15抗菌肽方面应前景目前存问题
抗菌肽具抗菌谱广耐受性易产生耐药性等优点抗菌肽发展前景研究中抗菌肽仅医疗方面领域食品畜牧业转基方面传统抗生素法代优越性现已证实抗菌肽药物代抗菌优越性真正抗菌肽药物推市场存问题首先抗菌肽研究历史长资料缺乏药安全性法保证次抗菌肽源需解决问题
151抗菌肽医疗方面应
青霉素发现抗生素滥越越严重产生耐药性越越受重视情况抗菌肽身分子量热稳定性高抗酸碱力强广泛抗菌产生耐药性等特点抗菌方面天独厚优越性学者已研究抗菌肽床应价值目前抗菌肽数库APD中已发现2400种抗菌肽国际知名药厂已研究开发抗菌肽类新药然抗菌肽药物研究时间较短资料欠缺药物FDA审批程序中某新药已取良床试验
152抗菌肽食品方面应
食品防腐剂量逐渐增越越食品防腐剂证实存安全隐患天然食品防腐剂越越备受青睐抗菌肽低毒性易消化水解具良水溶性稳定性作天然防腐剂抗菌肽加入食品中制作种功性食品制成保健营养品时抗菌肽作食品质量增效剂[20]
153抗菌肽禽畜养殖业方面应
饲料中添加抗生素抑制病菌繁殖着抗生素滥饲料中添加抗生素出现问题药物残留较严重影响禽畜产品质量体健康等抗菌肽具抗菌谱广抗菌机制独特易产生耐药性等特点优点抗菌肽成新型饲料添加剂宠
155抗菌肽研究存问题
着抗菌肽研究深入抗菌肽应发掘越越研究证明抗菌肽具广泛途抗菌肽走市场长段路走目前存问题需解决：1）抗菌肽毒理性药理药效研究数极少食计量药方式作时间需作进步研究2）抗菌肽制备问题天然抗菌肽含量极低提取工艺复杂致产率极低利化学合成法制备成高外法保证抗菌肽结构活性基工程技术制备抗菌肽抗菌肽工程菌抑制作抗菌肽表达效率较低酶解法制备抗菌肽仅资源限纯化问题着肽蛋白质化学结构越越解工合成目肽蛋白质手段研究中较常见原种方法较快速种方法昂贵般研究领域成太高难达产业化规模目前抗菌肽制备已成抗菌肽研究难题
16基工程制备抗菌肽简介
抗菌肽制备研究抗菌肽难题通研究发现基工程技术微生物发酵抗菌肽规模化生产效途径仅降低成受天然资源少限制废液处理工艺较成熟目前许研究者研究基工程制备抗菌肽通基工程表达抗菌肽存问题：抗菌肽宿菌毒性作会抑制宿菌生长降低抗菌肽表达外通基工程表达出抗菌肽产物会基工程菌蛋白酶降解影响产量针两问题国外学者提出解决方案方面分子角度设计改造抗菌肽方面制备重组抗菌肽角度优化抗菌肽表达[3]
161抗菌肽分子设计改造策略
抗菌肽制备生产方面问题外药理方面问题抗菌肽想取代抗生素位置需克服困难通研究发现抗菌肽抗菌活性存问题少数抗菌肽进入床试验阶段床研究中发现抗菌肽存着许问题毒性强稳定性差成高选择性差等 研究者抗菌肽进行分子设计结构改造修饰发现降低抗菌肽毒性增加稳定性选择性天然抗菌肽数库中通序列结构源性分析确定残基保守模式（疏水性电荷数电性极性等）知模板序列[3]选择天然活性较强抗菌基作模板序列优良母板序列基础通肽链氨基酸残基设计肽片段拼接设计肽链环合设计计算机辅助设计靶设计模拟生物模型设计改造抗菌肽获新型抗菌肽效途径[3]
1611氨基酸残基设计
抗菌肽生物活性定程度受抗菌肽带电荷两亲性氨基酸影响通增加肽链正电荷数改变两亲性氨基酸例换氨基酸残基抗菌肽组合设计筛选帮助定范围抗菌肽抗菌活性会着正电荷数增加增加增加某值便增加猜测正电荷导致抗菌肽磷脂头部牢固结合抗菌肽穿膜效率降时正电荷数超界值致抗菌肽分子间静电斥力抗菌肽分子膜静电引力阻碍膜抗菌肽分子聚集穿膜孔道形成降低抗菌活性膜裂解力 马清泉等通螺旋轮亲水面设计精氨酸疏水面设计亮氨酸缬氨酸获具良活性新型抗菌肽LGG16[3]通Frecer等试验证明选择性亲水性更强氨基酸残基换疏水面部分氨基酸残基降低溶血活性时抗菌活性没影响外增加极性面亲水氨基酸残基增强抗菌活性[3]
1612肽片段拼接设计
蛋白质工程酶工程生产杂合蛋白杂合酶研究思路研究者进行拼接设计通分析抗菌肽理化性质活性截取功区域获毒副作更活性更高杂合肽[3] 目前成功抗菌肽CecropinAMelittin拼接杂合肽仅抗菌活性增强蜂毒肽Melittin溶血活性降低外李国栋等抗菌肽CecropinAlN端(KWKLFKKI)鸡源抗菌肽Cathelicidin2(CATH2)拼接抗菌肽缩减抗菌肽抑菌浓度[21]
1613肽链环合设计
维持肽链结构稳定性通肽链环合环合肽链宿菌分泌蛋白酶抵抗力增强线性抗菌肽容易血浆酶降解环合仅肽链稳定性增强抗疟疾抗肿瘤活性提高毒性作降低目前研究者研究成功KLK2鸡源抗菌肽CATH2等
1614 计算机辅助设计
王远强通计算机辅助设计优势位点保守残基优势氨基酸分析基础结合2DQSAR3DQSAR结果建立QSAR模型理筛选活性较肽通试验验证[22] 谢秀枝等通抗菌肽CaseicinA氨基酸排列序重排20种突变体中筛选获原始抗菌肽活性更高序列[24]
1615靶设计
年靶性设计抗菌肽变异体抗菌肽药物研发方面优势较Ecert等开发设计选择性抗菌肽STAMP技术[3]种技术关键利灵活连接体AMP区域靶定位区域连接起机制通靶定位区达致病菌表面AMP区域负责破坏致病菌细胞膜终消灭致病菌非致病菌作[3]特异性靶抗菌肽区域识位点提高消灭病原微生物选择性治疗肿瘤较选择具免疫识杀菌抗体药物络合物毒性电荷疏水性外激素受体抗体抗体变区信息素等影响靶区域病原微生物结合素外致病菌生长程中会改变周围环境改变环境易引起致病菌生长果设计出感应环境变化发挥相应作抗菌肽够特异性抑制消灭致病菌繁殖保护正常菌群预防治疗致病菌新方法[3]已研究者构建出酸碱度敏感选择性抗菌肽发挥作设计靶性环境感应型抗菌肽未抗菌肽研发方
1616模拟生物模型设计
模拟生物模型着生物技术发展显越越重膜作机制角度探索抗菌肽靶细胞膜影响提供定理基础更设计获抗菌肽验证抗菌肽靶细胞膜穿透效率唐文婷通模拟细胞膜法抗菌肽进行筛选分离发现模拟细胞膜构成脂质疏水性烃基链电荷性异极性头决定磷脂双分子层抗菌肽辨识度亲性进影响筛选结果[25]黄金丰典型α－螺旋型膜活性肽模型研究细胞膜构效关系发现肽满足物理化学条件求时细胞膜位点结合力更强[26]冉瑜研究构象抗菌肽膜结合力设计含单活性序列短链肽含双活性序列环形肽线性肽结果发现双活性序列环形肽线性肽更易磷脂酰胆碱磷脂酰甘油作单活性序列基反应推测单活性序列通细胞靶点作起杀菌效果[27]出预测检测抗菌肽作效果方面模拟生物膜技术提供参考
162目基获取
目基获取方法：基文库中获取二通工合成 三PCR技术扩增目基研究早期般构建文库DNARNA模板PCR技术扩增获两种方法费时间精力生产程中显然行着DNA合成仪产生DNA合成仪合成需目核苷酸片段种方法仅快速获意核苷酸序列目基片段节省时间精力抗菌肽编码基cDNA片段较通常仅百bp甚十bp通工方法直接合成抗菌肽cDNA编码基时两端引入粘性接头构建表达载体减少基片段损失简化基工程操作程直接根抗菌肽氨基酸序列研究目助计算生物学手段优化设计cDNA编码序列采工方法合成获基片段然直接构建表达载体失种简便快捷效方法[7]
163制备重组抗菌肽
目前百分二十重组抗菌肽没采原核表达系统制备［28］原核表达系统存问题首先原核表达系统表达抗菌肽易抗菌肽抑制生长甚杀伤死亡次表达程中表达程抗菌肽稳定性值关注点研究者通研究发现解决两问题方法通抗菌肽融合标签表达
1631融合表达
抗菌肽融合表达暂时改变抗菌肽构象降低原核表达系统作表达产物需酶化学试剂裂解纯化具活性然融合表达系统中融合标签作关重目前根融合标签功融合标签分促进蛋白溶分子伴侣促进包涵体形成分子伴侣两种第种谷胱甘肽转移酶GST泛素相关蛋白修饰SUMO硫氧原蛋白Trx第二种包涵体易分离常弹性蛋白丁酯结合结构域亲标签结合[29] 年研究者进行重组蛋白表达研究时采体蛋白酶带动剪切功切割效率高
1632串联表达
抗菌肽分子克隆表达分离纯化检测工序繁琐回收产率较低抗菌肽串联表达仅提高抗菌肽回收效率保持抗菌肽活性降低宿细胞作增加抗菌肽稳定性表达量便识分离串联表达肽聚体需条肽基间加具裂解特性基序列表达出识短肽片段方法：①非酶类裂解点②肽酶切位点 ③混合肽切割点[3]
第二章 抗菌肽制备工艺
目前抗菌肽制备通生物材料提取化学合成法基工程法酶解法4种方法获四种方法制备抗菌肽存问题生物材料提取天然抗菌肽方法操作技术简单原料源广天然抗菌肽数量极少提取样品量法达生产应需求实验研究化学合成法合成肽链长度限制需量机溶剂化学合成法制备抗菌肽成较高进行产业化生产困难基工程法制备抗菌肽获量抗菌肽产物成较低通基工程法制备某抗菌肽会杀灭受体菌方法制备抗菌肽定困难需解决难题酶解法受蛋白酶身影响次水解程中产生副产物会纯化效率降低导致产物量降低抗菌肽纯度降低四种方法缺点通较会发现基工程法制备抗菌肽具发展潜力文基工程法基础设计较合理合成量抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法
21目前抗菌肽生产方法
抗菌肽研究起步20世纪80年代昆虫动物植物微生物等生物中分离通化学合成法直接合成基工程法通宿表达抗菌肽十年研究发展出现市场成品已生产生活带新变化发展目前进入市场抗菌肽生物材料提取法基工程法制备成基工程法受原材料缺乏限制生产成较低备受青睐目前基工程法制备抗菌肽工艺流程：
制备目基
构建重组表达载体
目基片段载体相连
连接产物转入宿菌
筛选鉴定
重组质粒宿菌中表达
融合蛋白表达制备
抗菌肽切割纯化
抗菌肽抗菌活性检测
图1 基工程法制备抗菌肽流程图
种基工程法制备抗菌肽融合表达策略解决表达抗菌肽抑制宿菌生长问题时简化抗菌肽纯化分离种方法制备抗菌肽需已知抗菌肽基序列基础进行
22抗菌肽制备改造设计
抗菌肽制备工艺设计部分通阅读文献基工程方法制备抗菌肽基础根研究者研究NCBI数库APD数库设计较合理合成量抗菌肽成相较低抗菌肽制备方法文抗菌肽进行规模化生产前先筛选出优异抗菌肽筛选方法先通生物信息学统计学工具优化抗菌肽结构参数根肠杆菌密码子偏爱性抗菌肽基序列换成肠杆菌偏爱密码子根稀密码子存会影响抗菌肽表达产量稀密码子换成密码子稀密码子剔应计算机软件辅助已改造抗菌肽基进行初步筛选然工合成抗菌肽分离纯化合成抗菌肽进行结构检测抗菌活性检测筛选出抗菌活性较基序列筛选出优异基基工程法规模化生产出检测否具生物学活性
221抗菌肽改造原
基工程法制备抗菌肽融合表达策略解决表达抗菌肽抑制宿菌生长问题时简化抗菌肽纯化分离种方法制备抗菌肽需已知抗菌肽基序列基础进行抗菌肽基序列里仅含稀密码子含抗菌肽表达产量降低核苷酸序列方法制备出抗菌肽产量会理想抗菌肽基进行改编仅会抗菌肽生物学活性更提高抗菌肽产量1）进行抗菌肽制备时果选肠杆菌做表达系统肠杆菌某密码子具偏爱性适增加肠杆菌偏爱密码子会发现抗菌肽表达产量提高2）果基序列含稀密码子时会影响抗菌肽表达基序列中稀密码子换剔时抗菌肽表达产量提高基工程制备抗菌肽时候果先抗菌肽基进行研究然影响表达密码子换成提高产量密码子适增加表达系统偏爱密码子会提高抗菌肽产量
222抗菌肽改造方法
抗菌肽改造根数库查询抗菌肽信息稀密码子肠杆菌密码子偏爱性然通计算机辅助设计优势位点保守残基优势氨基酸分析基础结合2DQSAR3DQSAR结果建立QSAR模型进行初步筛选理筛选活性较肽通试验验证计算机筛选出抗菌肽工合成合成抗菌肽分离纯化进行结构检测抗菌活性检测筛选出具抗菌活性抗菌肽基序列
223抗菌肽改造
整改造方法数库作理研究者研究容参考具定行性
天然抗菌肽
通生物信息学统计学工具优化抗菌肽结构参数
计算机软件筛选
改造天然抗菌肽
固相合成HPLC纯化
结构检测
活性检测
筛选出优异抗菌肽
图2 抗菌肽筛选
23抗菌肽筛选
231通生物信息学工具优化抗菌肽结构参数
生物信息学门计算机基础研究生物学学科进行生物数序列测定分析等[30]欧洲生物信息学研究( EBI) 日生物信息学中心( CBI) 美国国立生物技术中心( NCBI)目前国际三蛋白质核苷酸公数库[30]生物信息学进行蛋白质结构预测系统发育分析序列[30]利NCBI数库运生物信息学方法植物抗菌肽分类跨膜区域均疏水性亚细胞定位信号肽等方面进行简分析预测着抗菌肽研究断深入生物信息学断发展应生物信息学方法分析预测抗菌肽会取更发展空间利软件预测抗菌肽结构特点抗菌肽活性影响 工设计合成杂合肽成抗菌肽研究热点
232抗菌肽合成纯化
2321 抗菌肽合成
抗菌肽合成固相合成方法固相合成法反应容器中进行完反应操作简单便动化理产物易分离想提高产物量通加入量反应物固相法合成抗菌肽氯甲基聚苯乙烯树脂作固相载体三氟乙酸脱掉氨基保护基氨基酸接固相载体然DCC（NN’二环基碳二亚胺）活化氨基酸相互反应形成肽键合成完成HF水解合成肽链固相载体间脂键独立合成抗菌肽
2322抗菌肽纯化
抗菌肽纯化较复杂程需保证抗菌肽生物活性前提纯化抗菌肽说制备抗菌肽关键点天然抗菌肽般先进行超速离心分子杂蛋白进行纯化分离层析法高效液相色谱法（HPLC）采半制备型HPLC制备抗菌肽进行进步分离纯化收集洗脱峰进行浓缩方便面鉴定
233抗菌肽活性检测
抗菌肽活性检测选TTC（氯化三苯四氮唑）微量稀释法TTC种氧化原色素作氢受体细菌脱氢辅酶氢原色TTC变成红色溶水三苯甲腙[13]1％吧TTC加入已纯化抗菌肽中TTC终浓度低0005mgml（TTC高浓度时某细菌明显抑菌作）[13]处数期细菌（金黄色葡萄球菌肠杆菌铜绿假单孢菌等）适宜条件放置LB液体培养基中培养段时间取定量菌液稀释数倍接种LB抗固体板先培养半时菌液吸收完全孔器孔含TTC纯化抗菌肽注入孔适宜温度培养（根细菌生长条件）定时间观察根否变红判断抗菌效果变红抗菌效果理想未变红抗菌效果
234抗菌肽结构检测
抗菌肽结构分级结构高级结构级结构送检测机构进行检测目前国已检测机构够测定氨基酸序列抗菌肽送相关机构检测级结构高级结构测定两种方法：1）理方法软件数库级结构输入通建立模型理确定高级结构2）实验方法通X衍射核磁振等方法确定高级结构节约成选择理方法进行二级结构检测
研究发现特殊氨基酸肽链长度会影响抗菌肽抗菌活性通影响疏水性二级结构抗菌肽溶液膜状态抗菌肽带静电荷疏水性影响膜结合力影响抗菌活性般认正电荷负电荷机制清楚
制备抗菌肽
构建重组表达载体
目基片段载体相连
连接产物转入肠杆菌
筛选鉴定
重组质粒肠杆菌中表达
融合蛋白表达制备
抗菌肽切割纯化
抗菌肽抗菌活性检测
图1 基工程法制备抗菌肽流程图
24宿菌育种车间工艺流程设备
241设备途：
DNA合成仪2台分合成目基表达载体
保温罐 1 作反应器分目基表达载体进行双酶切双酶切加热高温段时间限制性切酶失活
配料罐 2 作培养基原料配制稀释含特殊营养物质培养基配制稀释
瞬时灭菌器3 作培养基加热灭菌
微生物液体连续培养器 3作宿菌培养包括激活培养转化培养筛选培养
242制备基
2421制备目基
稀密码子基表达定影响通常情况会降低抗菌肽基表达水肠杆菌基密码子定偏爱性根种偏爱性稀密码子换成表达宿偏爱密码子根密码子偏爱性碱基例设计抗菌肽基DNA合成仪合成 减少基片段损失简化基工程操作程根已设计核苷酸序列 时两端引入粘性接头构建表达载体
2422制备载体基
DNA合成仪合成合成两条反相互补寡核苷酸链两条引物5’端分引入两限制性酶切位点目片段游引入羟胺切割蛋白位点[8]
243构建重组表达载体
表达载体质粒中加入两限制性酶进行双酶切混匀适合温度水浴加热段时间时合成目基相条件进行双酶切里果想缩短酶切时间加入点Fast Digest Buffer双酶切分反应体系高温限制性切酶失活
244目基片段载体连接
回收表达载体目基片段加入加入高效连接DNA酶混匀室温反应半时左右
245宿菌制备
宿菌制备包括宿菌选择保存制备
2451宿菌选择
基工程制备抗菌肽需宿细胞表达抗菌肽目前宿表达肠杆菌中表达酵母菌中表达昆虫杆状病毒表达系统转基动植物中表达[8]肠杆菌表达系统具产量高生长快速操作简单目基导入容易方便成低等优点选择肠杆菌宿菌
2452 宿菌保存
宿菌选肠杆菌进行生产前肠杆菌应保存真空冷冻干燥状态状态肠杆菌酶活性均已抑制降低菌种变异速度般保存80℃左右冰箱液氮中温度加入甘油减少冰晶形成甘油细菌毒性
2453菌种制备
低温环境取出保存肠杆菌接种抗生素液体培养罐中培养罐中加NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质离子水溶解NaOH调节PH接种肠杆菌前培养罐进行高温高压灭菌适合温度搅拌培养十时培养液转离心机中离心降低温度菌种停止生长预冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞低温放置段时间细胞液中加菌甘油低温保存
246连接产物转入肠杆菌
连接产物加肠杆菌细胞悬液中混匀低温放置段时间加入预热含抗生素液体培养罐培养灌中加NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质离子水溶解NaOH调节PH接入细胞悬液前培养罐进行高温高压灭菌接种混匀摇床培养肠杆菌恢复正常生长状态
2 47 筛选
离心菌液接入含Amp（筛选出含Amp抗性基）培养罐中培养罐中加入NaCl蛋白胨酵母提取物等营养物质外加入Amp琼脂粉样接种前需培养罐进行高温高压灭菌培养段时间选出转化成功肠杆菌
25抗菌肽表达纯化分离工艺流程设备
251设备途：
配料罐1含特殊营养物质培养基配制稀释
培养罐1培养转化宿菌
离心机1离心培养菌液
252重组质粒肠杆菌中表达
取重组质粒转化入肠杆菌保存菌液接入含氨苄青霉素液体培养罐中室温搅拌培养夜加入培养液继续培养加IPTG(异丙基 β D 硫代吡喃半乳糖苷）室温诱v导表达
253融合蛋白表达制备
然转入离心机中低温离心段时间收集菌体离子水洗涤次离心洗涤液低温条件灭菌PBS缓液重悬高压重复破碎菌体加入Triton X100DNaseRNase低速搅拌孵育离心取清液加DTT纯化融合蛋白
254抗菌肽切割纯化
纯化融合蛋白加入羟胺切割缓液（盐酸羟胺三羟基甲基氨基甲烷溶ddH2O中然NaOH调节PH溶液）适合温度水浴加热盐酸PH调中性降低温度低温PBS透析天夜透析Glitathione Sepharose 4B 亲层析凝胶柱杂质
26抗菌肽抗菌活性检测
抗菌肽活性检测选TTC（氯化三苯四氮唑）微量稀释法TTC种氧化原色素作氢受体细菌脱氢辅酶氢原色TTC变成红色溶水三苯甲腙[13]1％吧TTC加入已纯化抗菌肽中TTC终浓度低0005mgml（TTC高浓度时某细菌明显抑菌作）[13]处数期细菌（金黄色葡萄球菌肠杆菌铜绿假单孢菌等）适宜条件放置LB液体培养基中培养段时间取定量菌液稀释数倍接种LB抗固体板先培养半时菌液吸收完全孔器孔含TTC纯化抗菌肽注入孔适宜温度培养（根细菌生长条件）定时间观察根否变红判断抗菌效果变红抗菌效果理想未变红抗菌效果
第三章 抗菌肽药物前景展
抗菌肽作新代会产生耐药性抗菌药物然发展前景较客观实际应中存问题抗菌肽规模化制备需解决问题首先分离纯化天然抗菌肽仅缺乏资源工艺较复杂难度非常导致效率极低次基工程方法制备抗菌肽融合表达策略基会出现产率低情况外抗菌肽药效学药动学毒性免疫原性研究少想抗菌肽投放市场需抗菌肽规模化制备应效果副作等进行进步研究抗菌肽存问题已少抗菌肽进入Ⅲ期床试验阶段抗菌肽出现抵抗肿瘤病毒疾病提供更性开发新抗菌药物提供理基础着研究员抗菌肽研究深入相信抗菌肽更类服务
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