体内药物分析
- 1. 体内药物分析Biopharmaceutical analysis
- 2. 第一章 体内药物分析概述一、体内药物分析的定义 狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析 广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价
- 3. 二、体内药物分析的意义（一）在新药评价 和开发中的意义 1．全面质量控制 2．新药报批 3．为设计新药提供信息 ①从代谢产物中开发新药 保泰松→羟基保泰松（作用强、副作用小） 非那西丁→扑热息痛 ②前药设计 ③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决
- 4. （二）临床合理用药中的意义 1．血药浓度与药理作用
- 5. 2. 影响血药浓度的因素（1）机体因素 a．生理因素 年龄、性别、生理状况 b．病理因素 c．遗传因素 （2）药物因素 a．剂型因素（生物利用度问题） b．药物合并使用（酶抑、酶促） c．时间因素
- 6. （三）药物中毒解救的意义 （四）兴奋剂检测的意义
- 7. 三、体内药物分析的对象3．从样品的来源分1．从分析物分母体药物 代谢物 内源性物质2．从生物样品种类分均匀样品 非均匀样品人体 实验动物
- 8. 四、体内药物分析的任务（一）方法学的研究 （二）治疗药物监测 TDM，therapeutical Drug Monitoring 1．定义 2．哪些药物需进行体内血药浓度监测
- 9. ①有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效 ②剂量小，毒性大的药物 ③个体差异大，剂量难以控制 ④药物毒性反应与疾病症状相似 ⑤多种药物合并应用，有中毒危险 ⑥胃肠道、肝脏、肾脏疾病 ⑦呈非线性动力学的药物 ⑧判断患者用药的依从性
- 10. （三）药代动力学的研究 （四）代谢分型的应用 （五）内源性物质测定
- 11. 五、体内药物分析的特点1．干扰杂质多 2．样品浓度低 3．取样量少 4．工作量大 5．时间短 6．有一定设备
- 12. 六、体内药物分析的发展1．国外发展概况 60年代初 发现药效与血药浓度关系 70年代 体内药物分析方法建立 80年代~至今 发展迅猛，新仪器不断涌现 书籍出版 《Drug Level Monitoring》 1980 《Therapeutical Drug Monitoring》 1981 《Textbook of Biopharmaceutic Analysis》 1981
- 13. 2．国内情况 80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版《药物分析》教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。 80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。
- 14. 有关书籍吴如金《体内药物分析》 人卫版 1984 陆明廉《血药浓度测定与临床应用》上海科技 1986 陈刚《治疗药物监测理论与实践》人民军医 1988 吴莱文《治疗药物监测》 人卫版 1989 曾经泽《生物药物分析》 北京大学出版社 1998 姚彤炜《体内药物分析》 浙大 2001 张君仁《体内药物分析》 化学工业出版社 2002
- 15. 3．学科前沿 游离药物浓度测定 直接进样方法研究 代谢物测定 对映体分析
- 16. 第二章 体内药物存在的状态与 体内药物分析的关系一、药物的体内变化 吸收→分布→代谢→排泄 ADME过程 发生两种变化 物理变化 可逆变化 化学变化 结构和数量发生变化
- 17. 二、药物与血浆蛋白的结合1．游离型药物与结合型药物（非特异性的结合） ①在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物 ②尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10 ③与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性药物主要与白蛋白结合 弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合 ④药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）
- 18. 2．血浆蛋白结合率 Df+P Db K= 解离常数 血浆蛋白结合率： Β= = [P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np
- 19. 结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。 由此可见，K、np是影响β的重要因素 np↓ β↓ K↓ β↑ 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。
- 20. 3．血浆蛋白结合的测定 平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。 （1）平衡透析法 ①原理 ②计算 β= ×100% =Ct-Cf/Ct×100% 袋内-袋外袋内药物
- 21. ③注意事项a. 蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定 b. 缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合 c. 温度与平衡时间 37℃ 16~48h 注意防腐剂加入，药物的分解 d. 透析袋 渗漏检测 3%三氯醋酸 e. 搅拌 保持动态平衡
- 22. ④影响因素a. 药物膜上吸附 b. Donnan效应 由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。 c. 空白值增加 d. 缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓↑ 此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用
- 23. （2）超滤法原理 计算 注意事项 a．装置 50μl→5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。 b．速度与时间 3000~10000r/min 5~15min c．温度 37℃，25℃，4℃ 影响因素 a．膜吸附 b．超滤液的体积 超滤液/总体积≈0.3~0.6 c．超滤膜温度
- 24. 三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响1．血浆不同对体内药物分析的影响 2．平衡状态不同对体内药物分析的影响 3．平衡状态受破坏对体内药物分析的影响 4．游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响
- 25. 四、药物代谢1．研究药物代谢的意义 了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全 有效 研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新 药 研究药物相互作用机制 有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰
- 26. 2．药物代谢的途径 第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强 第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。
- 27. 氧化反应 还原反应 水解反应 结合反应 a．葡萄糖醛酸结合 b．硫酸酯化 c．谷胱甘肽缀合 d．乙酰化结合 e．氨基酸结合
- 28. 五、药物代谢与体内药物分析的关系1．样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。 2．分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法 3．样品的提取、分离法 代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开 尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）
- 29. 第三章 生物样品的预处理一、生物样品的采集与贮藏 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。
- 30. （一）样品的采集1．血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。 血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液
- 31. 2．尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离 3．唾液 唾液中药浓与血浓相关性 收集方法 离心 收集
- 32. （二）样品的贮藏1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏， -70℃加入稳定 剂NaF 2．尿样 ①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4℃保存 ②加入防腐剂 a．1%甲苯 b．饱和氯仿 c．pH改变 3．唾液：同血样
- 33. 二、生物样品的预处理（一）预处理的目的 ①存在形式的多样性 游离 结合 代谢物 ②浓度低，杂质多（分离浓缩） ③出现浑浊和沉淀 ④与试剂起反应 ⑤影响色谱柱寿命
- 34. （二）处理方法选择的一般原则1．药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性 2．浓度范围 灵敏的方法 3．测定的目的 定性 定量 母体 代谢 4．生物样品的种类 5．样品处理与分析方法的选择 ① 专一性 ② 灵敏性
- 35. （三）生物样品去蛋白处理1．加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl 2．加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而↓，pH低于等电点
- 36. 3．组织酶消化法 加入酶使蛋白质水解 优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解 ②可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 ③不产生乳化 4．其他 加热 超滤
- 37. （四）生物样品缀合物水解1．酸水解 2．酶水解 β-葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 37℃ 3．溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中
- 38. （五）生物样品的萃取1．液-液萃取 （1）优点：①与杂质分离 ②简便 ③浓集 ④提取率高 （2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， >70%重现性
- 39. （3）影响提取率的因素 ①pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH ②提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应 ③离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取
- 40. （4）离子对提取对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取 ①原理 ②应用 阴离子：COOH+ SO3H- 反离子 四丁基铵 阳离子：NH2+ 反离子烷基或芳基磺酸盐 （5）提取技术 一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1
- 41. （6）乳化问题 措施 ①轻缓振摇 ②含有分散度大或不溶物应过滤掉 ③避免在高pH条件下，从水中提取药物 ④避免使用易发生乳化的溶剂 ⑤萃取剂水中加入少量NaCl
- 42. 破孔方法 ①机械法 ②加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 ③改善混合溶剂比例，增加分散相分数
- 43. （7）药物的吸附 ①玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷 ②血浆
- 44. 2．液固萃取固相萃取[solid phase extraction SPE] 针管式 抽空减压 加压 过滤
- 45. （1）固相萃取步骤①固相选择 样品1ml 1ml规格固相 1~25ml 3ml规格固相 ②固相处理 反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态 ③上样 ④分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 ⑤洗脱待测物 改变pH或极性
- 46. （2）影响固相萃取的因素（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 5~10ml·min-1 洗脱 0.2~1ml·min-1（〈300mg〉 2~5ml·min-1（>300mg） （2）装样 过载 突破性试验 已知浓度样品液 ① 小体积上柱→洗脱回收百分率 ②加大体积→洗脱回收百分率 ③绘图 当回收率下降时为过载
- 47. （六）生物样品的组分浓集 （七） 衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化
- 48. 第四章 体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法灵敏度专属性光谱法++刚开始应用较多双波长，导数色谱法++++++HPLC GC免疫法++++++疫交叉反应，重现性根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的
- 49. 二、分析方法的设计依据 方法的建立 原始方法改进→创新 创立方法
- 50. 1．做好文献总结 2．充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况 3．明确测定目的、要求 目的 4．结合实验室条件 设备条件 预处理方法药浓监测 药代动力学研究 母体药物和代谢物
- 51. 三、分析方法的建立1．纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T） 2．空白样品测定 确定空白样品是否有干扰 3．以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等 4．空白样品加入标准液测定 标准曲线建立 回归方程 回收率 5．实验样品测定
- 52. 四、分析方法的评价可行性和可靠性 1．准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 ①接近100% ②相对恒定
- 53. ①绝对回收率 也称萃取回收率、提取回收率 测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率 考虑3个浓度（高、中、低） 分布在标准曲线成上、中、下 一般要求绝对回收率在≥70% 一般方法 HPLC内标 内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值<10%
- 54. ②相对回收率 方法回收率 药物系列浓度+血样→标准曲线 取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值<15%，定量限<20%
- 55. 注意问题： a．加入药量与实际测定值相近 b．加入物与实际存在状态相近 c．空白试验 与已确定方法进行比较
- 56. 2．精密度precision ①标准差SD ②相对标准性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20% ② 日间精密度 日内精密度
- 57. 3．灵敏度（sensitivity） 检测的最小量（1）检测限（LOD） 从背景中检测到的最小药物浓度：S/N≥3的绝对量 LOD=3N/S （N噪间 S被测物信号/单位重量） N=1mm 取2μg·ml样品，20μl进样 峰度30mm LOD=4ng
- 58. （2）定量限(LOQ) 在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可S/N=10作为定量限，实际测定时，满足3~5个半衰期浓度，或Cmax1/10~1/20
- 59. （3）最低检测浓度 可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关 最低检测浓度=LOQ/进样体积 体内浓度检测限=仪器浓度检测限×稀释度 1ml→0.1ml 体内检测限=仪×0.1 1ml→10ml 体内检测限=仪×10
- 60. （4）提取灵敏度的方法 ①提取仪器灵敏度 ②提取进样量 ③降低仪器噪音 ④提取浓度程度
- 61. 4．专属法（specificity）选择性 同时受试药物合并应用的药物，体内代谢物等 5．线性范围（Linear range）
- 62. 6．稳定性（stability） （1）长期贮存稳定性 -20~-70℃ （2）短期室温稳定性 室温放置4~24h （3）冷冻解冻稳定性 冷冻—解冻—冷冻—解冻 （4）贮备液稳定性 贮备液在室温或冷冻条件下
- 63. 五、应用实例
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