血清γ球蛋白分离纯化
目求
1掌握分离纯化蛋白质基原理基程
2熟悉盐析离心层析电泳等生化基技术蛋白质分离纯化中综合应
3学会设计制定分离纯化蛋白质实验方案技术路线质量监控保证措施
二实验原理
血清蛋白300种粗略分清球蛋白两类γ球蛋白球蛋白中亚类欲常规方法获先半饱硫酸铵血清中盐析出球蛋白接着葡萄糖凝胶G25脱球蛋白中盐分DEAE纤维素阴离子交换柱便直接脱盐球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白反应机理：
C2H5
H
纤维素O(CH2)2N(C2H5)2 纤维素O(CH2)2N+……H2PO4
H++H2PO4
DEAE纤维素离子交换柱
COOH
C2H5
αβγ球蛋白
NH2 COO
H
盐析脱盐球蛋白液 纤维素O(CH2)2N+…αβ G
PH63 NH2
交换柱αβ球蛋白
H2PO4
COOH
γ球蛋白
NH3+
DEAE柱分离纯化γ球蛋白
柱层析交换结合α球蛋白β球蛋白通增加洗脱液离子强度降低洗脱pH值（两者时改变）分部洗脱纯化纯化前γ球蛋白电泳方法进行较鉴定
三仪器材料
仪器：离心机15×40cm层析柱层析架滴定台核酸蛋白检测仪部分收集器紫外分光光度计色谱柱电泳槽电泳仪
材料：马血清Sephadex G25×200gDEAE32×200g
四 实验步骤
（）分离纯化步骤
1取3mL4℃预冷血清加入3mL 4℃预冷饱硫酸铵边滴边摇
2静置10min3500rpm离心15min 弃清液沉淀溶少量生理盐水中取05mL测定蛋白质含量
3剩余样品Sephadex G25柱002 molL pH65 NH4AC缓液洗脱收集3 mL绘制洗脱曲线选择颜色深（浓度高）取05mL留电泳
4剩余蛋白质溶液已衡DEAE32柱（装半柱子）002 molL pH65 NH4AC缓液洗脱干净试收集20磺基水杨酸检测否蛋白流出绘制洗脱曲线收集蛋白质溶液γ球蛋白（留少量电泳05ml测[Pr]）
5柱子生先03molL高盐缓液002molL缓液衡
（二）电泳步骤
1安装垂直板电泳槽表配制分离胶溶液滴吸取分离胶溶液壁注入玻璃板距端3cm处(插梳准)
2立滴凝胶壁加蒸馏水约05cm高度加水时应注意减少胶液表面震动扩散加蒸馏水目隔离空气中氧消凝胶柱表面弯月面凝胶表面坦（加水时切勿呈滴状滴入胶液）
3静置30分钟凝胶表面水间出现清晰界面表示聚合已完成（注：刚加水时出界面逐渐消失等出清晰界面时表明凝胶已聚合）滴吸凝胶水层滤纸条（毛边）轻轻吸凝胶表面残留水分注意损伤已聚合凝胶表面
4表制备浓缩胶壁加入浓缩胶插梳子静置15分钟凝胶聚合
5加入10倍稀释甘氨酸Tris缓溶液电泳槽中注射针排样品孔中气泡样品样品处理液1：1混合微量注射器样
6电泳槽电极接电泳仪负极电泳槽电极接电泳仪正极接通电源刚开始5分钟67 mA／板示踪染料迁移口约05cm处时停止电泳切断电源（电泳时间约 2／时左右）
7剥胶 取玻璃板带10cm长注射针头盛蒸馏水作润滑剂针头插胶玻璃板间边注水边慢慢推针前进水流压力润滑作玻璃板凝胶分开
8固定染色脱色 固定染色液染色夜脱色液脱色
9染色加入染色液染色夜
10拍记录结果
五实验结果分析
**
血清样蛋白质种类较区带清脱盐样品中剩余蛋白质αβγ球蛋白结果中条较明显区带γ球蛋白电泳结果显示分离较纯净
六注意事项
1样前柱子重生
2样时注意3相切：缓液柱床表面相切样品柱床表面相切洗样时缓 液柱床表面相切
3琼脂糖封胶时定封延时防止漏胶
4配胶时序加样配完立刻混匀
5剥胶时水洗情况进行
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2熟悉盐析离心层析电泳等生化基技术蛋白质分离纯化中综合应
3学会设计制定分离纯化蛋白质实验方案技术路线质量监控保证措施
二实验原理
血清蛋白300种粗略分清球蛋白两类γ球蛋白球蛋白中亚类欲常规方法获先半饱硫酸铵血清中盐析出球蛋白接着葡萄糖凝胶G25脱球蛋白中盐分DEAE纤维素阴离子交换柱便直接脱盐球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白反应机理：
C2H5
H
纤维素O(CH2)2N(C2H5)2 纤维素O(CH2)2N+……H2PO4
H++H2PO4
DEAE纤维素离子交换柱
COOH
C2H5
αβγ球蛋白
NH2 COO
H
盐析脱盐球蛋白液 纤维素O(CH2)2N+…αβ G
PH63 NH2
交换柱αβ球蛋白
H2PO4
COOH
γ球蛋白
NH3+
DEAE柱分离纯化γ球蛋白
柱层析交换结合α球蛋白β球蛋白通增加洗脱液离子强度降低洗脱pH值（两者时改变）分部洗脱纯化纯化前γ球蛋白电泳方法进行较鉴定
三仪器材料
仪器：离心机15×40cm层析柱层析架滴定台核酸蛋白检测仪部分收集器紫外分光光度计色谱柱电泳槽电泳仪
材料：马血清Sephadex G25×200gDEAE32×200g
四 实验步骤
（）分离纯化步骤
1取3mL4℃预冷血清加入3mL 4℃预冷饱硫酸铵边滴边摇
2静置10min3500rpm离心15min 弃清液沉淀溶少量生理盐水中取05mL测定蛋白质含量
3剩余样品Sephadex G25柱002 molL pH65 NH4AC缓液洗脱收集3 mL绘制洗脱曲线选择颜色深（浓度高）取05mL留电泳
4剩余蛋白质溶液已衡DEAE32柱（装半柱子）002 molL pH65 NH4AC缓液洗脱干净试收集20磺基水杨酸检测否蛋白流出绘制洗脱曲线收集蛋白质溶液γ球蛋白（留少量电泳05ml测[Pr]）
5柱子生先03molL高盐缓液002molL缓液衡
（二）电泳步骤
1安装垂直板电泳槽表配制分离胶溶液滴吸取分离胶溶液壁注入玻璃板距端3cm处(插梳准)
2立滴凝胶壁加蒸馏水约05cm高度加水时应注意减少胶液表面震动扩散加蒸馏水目隔离空气中氧消凝胶柱表面弯月面凝胶表面坦（加水时切勿呈滴状滴入胶液）
3静置30分钟凝胶表面水间出现清晰界面表示聚合已完成（注：刚加水时出界面逐渐消失等出清晰界面时表明凝胶已聚合）滴吸凝胶水层滤纸条（毛边）轻轻吸凝胶表面残留水分注意损伤已聚合凝胶表面
4表制备浓缩胶壁加入浓缩胶插梳子静置15分钟凝胶聚合
5加入10倍稀释甘氨酸Tris缓溶液电泳槽中注射针排样品孔中气泡样品样品处理液1：1混合微量注射器样
6电泳槽电极接电泳仪负极电泳槽电极接电泳仪正极接通电源刚开始5分钟67 mA／板示踪染料迁移口约05cm处时停止电泳切断电源（电泳时间约 2／时左右）
7剥胶 取玻璃板带10cm长注射针头盛蒸馏水作润滑剂针头插胶玻璃板间边注水边慢慢推针前进水流压力润滑作玻璃板凝胶分开
8固定染色脱色 固定染色液染色夜脱色液脱色
9染色加入染色液染色夜
10拍记录结果
五实验结果分析
**
血清样蛋白质种类较区带清脱盐样品中剩余蛋白质αβγ球蛋白结果中条较明显区带γ球蛋白电泳结果显示分离较纯净
六注意事项
1样前柱子重生
2样时注意3相切：缓液柱床表面相切样品柱床表面相切洗样时缓 液柱床表面相切
3琼脂糖封胶时定封延时防止漏胶
4配胶时序加样配完立刻混匀
5剥胶时水洗情况进行
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