鳕鱼制品中裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼源性成分检测
BJS 201907
1 范围
方法规定鳕鱼制品中裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）油鱼（Lepidocybium flavobrunneumRuvettus pretiosus）南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoidesDissostichus mawsoni）源性成分实时荧光PCR检测方法
方法适鳕鱼鳕鱼片鳕鱼扒等生鲜速冻鳕鱼产品（包含鱼丸鱼糕鱼饼鱼肠鱼豆腐鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼源性成分定性检测
2 原理
商业化DNA提取试剂盒获适实时荧光PCR检测DNA分裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼特异性引物探针通实时荧光PCR反应获Ct值根Ct值判断样品否检出裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼源性成分
3 试剂材料
规定外方法中试剂均分析纯水应符合GBT 6682级水求试剂均DNA酶污染容器分装
31引物探针序列
311裸盖鱼源性成分NADH2基
裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’AGGGACCACCCTAACATTCG3 ’
裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’GTGGGTGGTGATGCTGTGCT3 ’
裸盖鱼源性成分探针：5 ’FAMCAGCTCTCACTGACTACTCGCATGABHQ13 ’
312油鱼源性成分Cytb基
油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’TAACTTCGGATGACTCATCCG3 ’
油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT3 ’
油鱼源性成分探针：5 ’FAMCATCCGAAACCTTCATGCAAACGGCBHQ13 ’
313 南极犬牙鱼源性成分CK基
南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’CTGAATATGTAGGTGCATACG3 ’
南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT3 ’
南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’FAMTCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGABHQ13 ’
314参基真核生物18SrRNA
参5 ’端引物：5 ’TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA3 ’
参3 ’端引物：5 ’AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT3 ’
参探针：5 ’FAMCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACBHQ13 ’
32 商业化DNA提取试剂盒
33 商业化PCR反应预混液
4 仪器设备
41实时荧光PCR仪
42微量紫外分光光度计
43恒温水浴锅
44高速冷冻离心机：离心力18000 g
45微量移液器（05 μL 10 μL10 μL 100 μL20 μL 200 μL100 μL 1000 μL）
46 涡旋振荡器
47 天：感量0001 g
5 分析步骤
51 样品前处理
（1）样品单块鱼肉组成：灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉
（2）样品五块鱼肉组成：灭菌剪刀适量剪取组成部分中心部位鱼肉
（3）样品五块鱼肉组成：机挑选5块鱼肉灭菌剪刀适量剪取组成部分中心部位鱼肉
取鱼肉灭菌离子水洗涤离心清液剪碎混匀
注：速冻鳕鱼产品应完全解冻取样
52 DNA提取
商业化DNA提取试剂盒说明书中求取样量称取样品样品设置两行商业化DNA提取试剂盒说明书操作
53 DNA浓度测定
取1 μL DNA溶液微量紫外分光光度计dsDNA（双链DNA）计算方式检测浓度
54 实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系见表1
表1 实时荧光PCR反应体系
PCR预混液（2 ×）
10 μL
10 μmolL游引物
04 μL
10 μmolL游引物
04 μL
10 μmolL 探针
02 μL
DNA
2050 ng
灭菌离子水
补充总体积20 μL
PCR反应程序：95 ℃ 15 s 95 ℃ 5 s 60 ℃ 34 s（读取荧光）40循环
55 实验
分设置阳性阴性PCR空白空白提取
阳性：含相应物种DNA
阴性：含相应物种DNA
PCR空白：灭菌离子水代DNA加入实时荧光PCR反应体系
空白提取：灭菌离子水代样品进行DNA提取
6 结果判断表述
61 质量控制
条件中条满足求时结果视效：
阳性：荧光通道出现典型扩增曲线相应Ct值＜300
阴性：Ct值≥350
PCR空白：Ct值≥350
空白提取：Ct值≥350
参反应：荧光通道出现典型扩增曲线相应Ct值＜300
样品行反应：Ct值62结果判定应致
62 结果判定
（1）Ct值＜300质量控制符合求判定检出相应物种源性成分
（2）Ct值≥300质量控制符合求判定未检出相应物种源性成分
63 结果表述
检出 XXX 源性成分
未检出 XXX 源性成分
7 防污染措施
检测程中放置交叉污染措施GBT 27403中规定执行
8 方法检出限
裸盖鱼引物探针检出限范围01 ~5 油鱼引物探针检出限范围1 ~10 南极犬牙鱼引物探针检出限范围1 ~2
注：设备试剂盒检出限差异
方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院
验证单位：河南省产品质量监督检验院天津市食品安全检测技术研究院重庆市食品药品检验检测研究院福建省食品药品质量检验研究院广东省食品检验
起草：林霖张世伟吴佳辉王坤杨国武杨俊
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BJS 201907
1 范围
方法规定鳕鱼制品中裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）油鱼（Lepidocybium flavobrunneumRuvettus pretiosus）南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoidesDissostichus mawsoni）源性成分实时荧光PCR检测方法
方法适鳕鱼鳕鱼片鳕鱼扒等生鲜速冻鳕鱼产品（包含鱼丸鱼糕鱼饼鱼肠鱼豆腐鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼源性成分定性检测
2 原理
商业化DNA提取试剂盒获适实时荧光PCR检测DNA分裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼特异性引物探针通实时荧光PCR反应获Ct值根Ct值判断样品否检出裸盖鱼油鱼南极犬牙鱼源性成分
3 试剂材料
规定外方法中试剂均分析纯水应符合GBT 6682级水求试剂均DNA酶污染容器分装
31引物探针序列
311裸盖鱼源性成分NADH2基
裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’AGGGACCACCCTAACATTCG3 ’
裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’GTGGGTGGTGATGCTGTGCT3 ’
裸盖鱼源性成分探针：5 ’FAMCAGCTCTCACTGACTACTCGCATGABHQ13 ’
312油鱼源性成分Cytb基
油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’TAACTTCGGATGACTCATCCG3 ’
油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT3 ’
油鱼源性成分探针：5 ’FAMCATCCGAAACCTTCATGCAAACGGCBHQ13 ’
313 南极犬牙鱼源性成分CK基
南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’CTGAATATGTAGGTGCATACG3 ’
南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT3 ’
南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’FAMTCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGABHQ13 ’
314参基真核生物18SrRNA
参5 ’端引物：5 ’TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA3 ’
参3 ’端引物：5 ’AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT3 ’
参探针：5 ’FAMCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACBHQ13 ’
32 商业化DNA提取试剂盒
33 商业化PCR反应预混液
4 仪器设备
41实时荧光PCR仪
42微量紫外分光光度计
43恒温水浴锅
44高速冷冻离心机：离心力18000 g
45微量移液器（05 μL 10 μL10 μL 100 μL20 μL 200 μL100 μL 1000 μL）
46 涡旋振荡器
47 天：感量0001 g
5 分析步骤
51 样品前处理
（1）样品单块鱼肉组成：灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉
（2）样品五块鱼肉组成：灭菌剪刀适量剪取组成部分中心部位鱼肉
（3）样品五块鱼肉组成：机挑选5块鱼肉灭菌剪刀适量剪取组成部分中心部位鱼肉
取鱼肉灭菌离子水洗涤离心清液剪碎混匀
注：速冻鳕鱼产品应完全解冻取样
52 DNA提取
商业化DNA提取试剂盒说明书中求取样量称取样品样品设置两行商业化DNA提取试剂盒说明书操作
53 DNA浓度测定
取1 μL DNA溶液微量紫外分光光度计dsDNA（双链DNA）计算方式检测浓度
54 实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系见表1
表1 实时荧光PCR反应体系
PCR预混液（2 ×）
10 μL
10 μmolL游引物
04 μL
10 μmolL游引物
04 μL
10 μmolL 探针
02 μL
DNA
2050 ng
灭菌离子水
补充总体积20 μL
PCR反应程序：95 ℃ 15 s 95 ℃ 5 s 60 ℃ 34 s（读取荧光）40循环
55 实验
分设置阳性阴性PCR空白空白提取
阳性：含相应物种DNA
阴性：含相应物种DNA
PCR空白：灭菌离子水代DNA加入实时荧光PCR反应体系
空白提取：灭菌离子水代样品进行DNA提取
6 结果判断表述
61 质量控制
条件中条满足求时结果视效：
阳性：荧光通道出现典型扩增曲线相应Ct值＜300
阴性：Ct值≥350
PCR空白：Ct值≥350
空白提取：Ct值≥350
参反应：荧光通道出现典型扩增曲线相应Ct值＜300
样品行反应：Ct值62结果判定应致
62 结果判定
（1）Ct值＜300质量控制符合求判定检出相应物种源性成分
（2）Ct值≥300质量控制符合求判定未检出相应物种源性成分
63 结果表述
检出 XXX 源性成分
未检出 XXX 源性成分
7 防污染措施
检测程中放置交叉污染措施GBT 27403中规定执行
8 方法检出限
裸盖鱼引物探针检出限范围01 ~5 油鱼引物探针检出限范围1 ~10 南极犬牙鱼引物探针检出限范围1 ~2
注：设备试剂盒检出限差异
方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院
验证单位：河南省产品质量监督检验院天津市食品安全检测技术研究院重庆市食品药品检验检测研究院福建省食品药品质量检验研究院广东省食品检验
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