微粒体提取酶促
1 挑取单克隆(菌斑)10 mL SDHis（2 Glucose）中30℃250 rpm48 hstationary phase
2 取10mL4000rpm离心5 min
3 10mlddH2O重悬菌体4000rpm离心5min
4 重复步骤3两次
5 加入50 mL诱导表达培养基YPL（1yeast extract2peptone2galactose半乳糖）30℃1216 h
6 4000g离心5min5mL TE+KCl（01M KCl溶TE）重悬细胞（110 YPL体积）室温放置5min
7 离心收集细胞500uL 冰浴TESB（06 M山梨醇溶TE）（1mL TES B100mL YPL体积）重悬转入15ml离心
8 心加入玻璃珠刚接触细胞悬浮液表面4度力摇破碎细胞（离心体积少细胞悬浮液4倍）直细胞完全破碎（约半时）
9 破碎细胞置冰加入1mLTESB洗玻璃珠回收清重复24次收集清新4度12 000rpm离心15min
10 取清加入2倍体积(TESB+0225M NaCl+015gml PEG4000)冰浴15min
11 4度12 000rpm离心15min弃清
12 加入300500uL TEG溶解沉淀
13 500ug蛋白加入50 mM TrisHCl (pH 74) 1 mM NADPH 5 μM flavin adenine dinucleotide (FAD) 5 μM flavin mononucleotide (FMN) 5 mM glucose6phosphate 1 unit glucose6phosphate dehydrogenase）加底物100μM30℃反应少1h
14 加入等体积乙酸乙酯混匀12000rpm离心2min取层氮气吹干50ul乙酸乙酯溶解HPLC分析
TE50mM TrisHCl(pH 75) 1 mM EDTA
TESB06M山梨醇溶TE
TEK01M KCl 50mM TrisHCl(pH 75) 1 mM EDTA
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2 取10mL4000rpm离心5 min
3 10mlddH2O重悬菌体4000rpm离心5min
4 重复步骤3两次
5 加入50 mL诱导表达培养基YPL（1yeast extract2peptone2galactose半乳糖）30℃1216 h
6 4000g离心5min5mL TE+KCl（01M KCl溶TE）重悬细胞（110 YPL体积）室温放置5min
7 离心收集细胞500uL 冰浴TESB（06 M山梨醇溶TE）（1mL TES B100mL YPL体积）重悬转入15ml离心
8 心加入玻璃珠刚接触细胞悬浮液表面4度力摇破碎细胞（离心体积少细胞悬浮液4倍）直细胞完全破碎（约半时）
9 破碎细胞置冰加入1mLTESB洗玻璃珠回收清重复24次收集清新4度12 000rpm离心15min
10 取清加入2倍体积(TESB+0225M NaCl+015gml PEG4000)冰浴15min
11 4度12 000rpm离心15min弃清
12 加入300500uL TEG溶解沉淀
13 500ug蛋白加入50 mM TrisHCl (pH 74) 1 mM NADPH 5 μM flavin adenine dinucleotide (FAD) 5 μM flavin mononucleotide (FMN) 5 mM glucose6phosphate 1 unit glucose6phosphate dehydrogenase）加底物100μM30℃反应少1h
14 加入等体积乙酸乙酯混匀12000rpm离心2min取层氮气吹干50ul乙酸乙酯溶解HPLC分析
TE50mM TrisHCl(pH 75) 1 mM EDTA
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