五聚酶链式反应PPT
- 1. Direct pentaplex PCR assay: an adjunct panel for meat species identification in Asian food productsReporters: xxx
- 2. 1.概述2.关于PCR3.实验方法与过程4.结果与讨论CONTENT
- 3. 概述
- 4. 概述step1step2step3现如今世界各地存在故意错帖标签，掺假含肉制品线粒体DNA序列分析通常用于物种鉴定 特点：精确、适用于生肉和其他高降解的样品开发一种多重直接PCR检测方法，用于同时鉴定世界各地，特别是亚洲消费的五种肉类
- 5. 关于PCR
- 6. 关于PCR聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。概念DNA链在高温发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。发现耐高温的DNA聚合酶。 PCR仪：温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制原理引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、耐高温DNA聚合酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。反应体系
- 7. 关于PCR引物的设计 变性-退火-延伸 直接PCR(Direct PCR)无需事先提取DNA即可直接扩增组织样本反应流程又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应NA的半保留复制。 多重PCR(multiplex PCR)
- 8. 实验方法与过程
- 9. 实验方法与过程样品采集寡核苷酸引物设计多重直接扩增Gel电泳用于 DNA分离和检测验证
- 10. 实验方法与过程生肉样品：鸭，水牛，山羊，绵羊 血液样品：狗 用cytochrome C oxidase subunit I (COI，线粒体细胞色素氧化酶1）哺乳动物通用引物，通过DNA扩增和测序确认它们的起源。样品采集
- 11. 实验方法与过程建立了与五种目标肉类的COI序列比对针对每种目标物种设计物种特异性正向引物，基于保守的比对区域设计单个反向通用引物使用OligoCalc和Phire®聚合酶Tm计算器检查候选引物的自身互补性和二级结构。使用AutoDimer检查引物的交叉反应性。寡核苷酸引物设计
- 12. 实验方法与过程切下大约1 mm3的样品组织并加入到20μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后将其在98℃温育2分钟并用于PCR反应代替DNA模板。使用T100 TM Bio-Rad热循环仪在以下条件下进行扩增：98℃初始变性5分钟; 35个循环的98℃变性5秒;在66℃退火5秒;在72°C下延伸25秒;最后在72°C下延伸1分钟。多重直接扩增
- 13. 实验方法与过程 Gel电泳用于 DNA分离和检测分离扩增的片段并通过在含有1x TBE缓冲液（Tris-硼酸 - 二钠EDTA）的2％琼脂糖凝胶中电泳（100V，30分钟）进行检测。使用溴化乙锭对凝胶进行染色，并观察DNA条带，使用Bio-Rad Gel Doc 1000成像系统拍摄。
- 14. 实验方法与过程通过分析1.0 ng的目标物种DNA和其他9种非目标肉类判断特异性特异性使用117个肉类和肉类产品样本来测试稳健性。稳定性测试了泰国各地不同来源的5个物种的62份血液和肉类样本。包括8种狗肉，14种鸭肉，12种山羊，8种水牛肉和20种羊肉。重复性通过分析100000、5000、25000、12500和6250个线粒体拷贝（即单一标准）的来自目标物种的DNA来进行灵敏度测试。灵敏性验 证
- 15. 结果与讨论
- 16. 结果与讨论成功开发了多重直接PCR检测方法，可同时鉴定5种目标物种，特别是狗，鸭，山羊，水牛和绵羊。如所预期的，当用含有这些物种的预PCR溶液测试时，多重测定产生230、283、363、396和477bp的PCR片段（图1，泳道1-5）。还成功扩增了PCR前溶液（图1，泳道6）的等比例（1：1：1：1：1）混合物，并检测了所有相应的DNA条带。没有观察到目标物种之间的交叉反应性，如泳道1至5中的单个条带所示。
- 17. 图1在2％琼脂糖凝胶上分离的5种目标物种的多重直接扩增。 泳道M：100bp DNA梯，1：狗（230bp），2：鸭（283bp），3：山羊（363bp），4：水牛（396bp），5：绵羊（477bp），和6：五种目标物种的混合DNA。直接PCR可以有效地扩增目标肉类中的DNA。因为不需要DNA提取，所以该测定比先前公布的测定更快且更具成本效益。成功扩增和分析1 mm3的样品只需要90分钟。小扩增子大小（230-477 bps）意味着该分析应该能够检测甚至痕量的欺诈成分或生产过程中的污染。
- 18. 结果与讨论特异性检测通过分析来自九种非目标物种（鸵鸟，牛肉，猪肉，马，鸡，松鼠，青蛙和鳄鱼肉和人类DNA）的DNA来确定测定特异性。 没有观察到来自非目标物种的交叉反应。 这表明该测定对目标物种具有高度特异性。通过设计线粒体DNA中COI基因的物种特异性引物来实现特异性。 COI表现出较低的物种内和物种间的高变异，这使其对鉴定非常有用。
- 19. 结果与讨论通过分析从不同个体或来源获得的62个肉和血液样品来确定实验方法的重复性。 结果显示，从所有62个样品中产生了预期的PCR片段，导致100％准确的鉴定。 这意味着该测定具有高度可重复性，并且无论来源如何都能够正确识别目标物种。重复性检测
- 20. 结果与讨论敏感性检测通过分析100000、5000、25000、12500和6250个线粒体拷贝（即单一标准）的来自目标物种的DNA来进行灵敏度测试，以确定可检测的每个物种的mtDNA的最小量。 LOD:检测限(LOD, limit of detection)又称为检出限，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。是方法(方法检测限MDL)和仪器(仪器检测限IDL)灵敏度体现的重要指标之一,指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。所谓检测是指定性检测，即断定样品中确定存在有浓度高于空白的待定物质。 每个物种的检出（LOD）不同;对于狗，鸭和水牛，该测定能够始终检测12,500 mtDNA拷贝。然而，对于山羊和绵羊，分别为25,000和50,000 mtDNA拷贝。
- 21. 结果与讨论商业食品和食品检测对pentaplex试验共检测了117种食品和食品样品，包括生肉和冷冻肉，速溶冷冻食品和来自泰国几个当地市场的街头食品在117个商业样本中，26个（22.2％）被发现也含有非上市肉类，这可能是由于制造不良造成的故意错误标记，替代和/或意外污染。街头食品中的欺诈率最高（45.5％），可能是由于非故意污染造成的，因为欺诈性样本主要与普通肉类混合，如鸡肉，猪肉和牛肉。由于直接PCR，这种测定和之前发表的测定都可以在不到90分钟内完成，并且不需要昂贵的仪器，这使得它们对于发展中国家特别有用，因为发展中国家的食品可追溯性标准不像发达国家那样严格。
- 22. 该表显示了包含目标物种的样品数量测试的商业食品/食品样本总数。 Hexplex text该列显示了这些食物样品上的Hexplex直接PCR测定的结果。 通过将错误描述的样本的数量除以总数来计算每个类别的欺诈比率该类别的样本。 减号（ - ）表示未检测到PCR产物。
- 23. 感谢倾听
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