ICS
B50
DB21
辽宁省方标准
DB 21 T18611 —2010
水产生物种质检验技术规程
工酶电泳分析法
Isozyme procedure to detect germplasm for aquaculture species
2010 12 31发布
2011 02 01实施
辽宁省质量技术监督局发布
前言
标准GBT112009规起草
标准辽宁省海洋水产科学研究院提出
标准口单位：辽宁省海洋渔业厅
标准起草：刘卫东赫崇波高祥刚李云峰鲍相渤李宏俊苏浩
附录ABC均资料性附录
水产生物种质检验技术规程 工酶电泳法
1范围
规程规定水产动植物工酶电泳分析涉原理试剂仪器设备抽样样品制备电泳染色分析方法等
规程适水产动植物品种群体酶位点等位基分析遗传异质性分析
2术语定义
列术语定义适标准
21
工酶（isozyme）：
工酶生物体催化相反应级结构酶
22
等位基(allele)：
基种变异体二倍体体细胞基两等位基等位基分父母群体中基许等位基
23
均遗传杂合度(average heterozygosity)
H表示群体均座位杂合子例衡量标记方式信息含量程度
3 原理
工酶具样功效酶基表达产物带电荷分子形状电场凝胶中出现种工酶组分迁移率催化染色扫描根酶带迁移距离数目进行分析较判定生物物种种群遗传特性
4 试剂
非说明规程设计试剂均分析纯
41 95乙醇
42 甘油
43 盐酸（HCl）
44 氢氧化钠（NaOH）
45 硼酸
46 柠檬酸
47 乙二胺四乙酸（EDTA）
48 三羟甲基氨基甲烷（Tris）
49 L组氨酸
410 丙烯酰胺（Arc）
411 乳酸
412 N’N’亚甲基双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（Bis）
413 四甲基乙二胺（TEMED）
414 硫酸胺（AP）
415 DL苹果酸
416 α磷酸甘油钠
417 磷酸氢二钠（Na2HPO4）
418 二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）
419 辅酶Ⅰ（NAD）
420 辅酶Ⅱ(NADP)
421 吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）
422 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）
423 山梨醇
424 DL异柠檬酸三钠
425 6磷酸葡萄糖酸钠
426 α–乙酸萘酯
427 β乙酸萘酯
428 丙酮
429 坚牢蓝RR盐
430 氨基黑10B
431 固定液：3份乙醇1份甘油5份蒸馏水混合均匀
432 1molL盐酸：825ml重119浓盐酸加蒸馏水1000ml
433 浓缩胶缓液（TrisHCl pH68）：三羟甲基氨基甲烷60g溶40ml蒸馏水中1molL盐酸调pH值致68定容100ml
434 分离胶缓液（TrisHCl pH88）：三羟甲基氨基甲烷363g480ml 1molL盐酸混合蒸馏水定容100 ml
435 TG电极缓液(Tris甘氨酸 pH83)：三羟甲基氨基甲烷30g甘氨酸144g蒸馏水溶解定容1L
436 ArcBis液：丙烯酰胺30gN’N’亚甲基双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺08g蒸馏水溶解定容100ml02μm微孔滤膜抽滤棕色瓶保存4℃
437 15％硫酸胺：硫酸胺015g溶10ml蒸馏水中4℃保存周
438 连续聚丙烯酰胺凝胶：分离胶浓度25％～4％浓缩胶浓度7％～10％凝胶模具清洗安装根需分离胶浓度附录A配制分离胶混匀立灌注凝胶模具中胶面离板顶3cm处停止立注射器胶面顶部注入05cm高蒸馏水胶面整室温聚合40min水层分离胶呈现出明显界限时表示分离胶聚合完成排胶顶部蒸馏水浓缩胶缓溶液洗分离胶顶部该缓溶液排附录B配制浓缩胶灌入距板顶3mm处立插入试样格（梳子）移余凝胶液室温聚合15h
439 15molLTrisHCl (pH80)：三羟甲基氨基甲烷18171gHCl调节调节pH值80蒸馏水定容1L
440 15molLTrisHCl (pH95)：三羟甲基氨基甲烷18171gHCl调节调节pH值95蒸馏水定容1L
441 01molL磷酸缓溶液：二水磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O） 516g磷酸氢二钠（Na2HPO4）142g蒸馏水定容1L
442 40％蔗糖溶液：40g蔗糖溶100ml蒸馏水中
443 1％溴酚蓝：1g溴酚蓝溶100ml蒸馏水中定性滤纸滤装滴瓶
442 染色液：常工酶染色液配置方法见附录C
5 仪器设备
51 微量匀浆机： 转速4000rmin
52 高速冷冻离心机：转速15000rmin冷冻温度4℃
53 电泳仪
54 垂直版电泳槽
55 pH计：读数值001
56 微量进样器
57 制胶模具
58 染色缸
59 低温冰箱冰室温度30℃
510 恒温培养箱
511电子天：感量00001g
512相机
513扫描仪
6 抽样
61 活体体抽样
样应活体体群体样数少30
62 取样
工酶仅具种特异性体组织组织发育阶段具特异性取样应采取发育阶段体组织组织样品取1~2g血液样品应分离出血清样品应立放入低温冰箱中保存
7 分析步骤
71 分析样品制备
取03g样品1份样品加入3份体积例加入01molL磷酸缓溶液匀浆机4000rmin匀浆2min吸匀浆移入15ml离心中 4℃15000rmin离心清液澄清清液移入新离心中加入等体40％蔗糖溶液1滴1％溴酚蓝溶液分装15ml离心中75℃保存备
72 凝胶制备
凝胶制备438述方法进行
73电泳步骤
次电泳前先开恒温循环仪冷4℃左右
预电泳：试样格（梳子）拔出凝胶版安装电泳槽TG电极缓液注入电泳槽中50mA电流电泳30min
前电泳：预电泳结束点样孔中残留水分吸干微量进样器10μl～30μl分析样品加加样孔底部25mA电流电泳10min
正式电泳：200V恒压电泳4～5h溴酚蓝距胶板 lcm时停止
74 染色脱色固定
染色：凝胶放入预先配制37℃恒温箱中保温需检测酶染色液中染色酶带全部显示清晰时停止染色
脱色：25冰乙酸中脱色背景清晰透明
固定：脱色凝胶放入乙醇冰醋酸甘油水混合液中混合例3：1：1：5固定2h夜
75 制干胶片
取凝胶板适中玻璃纸浸泡湿润铺凝胶板排空气泡四周包紧室温然风干制成透明干胶
76 摄影扫描
镜头凝胶谱带相激光扫描仪谱带进行扫描
8 结果分析
81 酶位点等位基分析：根酶结构组成工酶组织中表现酶谱特征确定种工酶编码基位点态位点等位基频率
82 群体遗传异质性态座位例（P）均杂合度(H)度量分式计算：
式中
P——态座位例
n1——态座位数
n——测基总座位数
H——均杂合度
Xi——等位基i频率
附录A
（资料性附录）
分离胶配制例
储备溶液
分离胶浓度（）a
70
75
80
85
90
95
10
ArcBis液 （ml）
70
75
80
85
9．0
95
10
分离胶缓液 （ml）
2146
2094
2044
1994
1944
1894
1844
15％硫酸胺（ml）
15
15
15
15
15
15
15
TEMED （μl）
40
40
40
40
40
40
40
注a：凝胶体积30ml
附录 B
（资料性附录）
浓缩胶配制例
储备溶液
浓缩胶浓度（）a
25
3
35
4
ArcBis液 （ml）
08
10
12
13
浓缩胶缓液 （ml）
08
10
12
13
15％硫酸胺（ml）
05
05
05
05
蒸馏水（ml）
79
75
71
69
TEMED （μl）
15
15
15
15
注a：凝胶体积10ml
附录C
种常见工酶染色配制方法
(资料性附录)
工酶
染色缓液
辅酶Ⅰ
NAD(mg)
辅酶Ⅱ
NADP(mg)
1mgml
NBT(ml)
PMS
(mg)
试剂
醇脱氢酶
ADH
025molL TrisHCl pH80 140ml
22
—
105
105
95乙醇45ml
酯酶
EST
01 molL磷酸缓液 150ml
—
—
—
—
α–乙酸萘酯20mg
β乙酸萘酯20mg
丙酮1ml
坚牢蓝RR100
甘油3磷酸脱氢酶
α–GPDH
025molL TrisHCl pH95 114ml
45
—
21
105
1molL 甘油磷酸钠15ml
山梨醇脱氢酶
SDH
025molL TrisHCl pH80 140ml
22
—
105
105
山梨醇3g
异柠檬酸脱氢酶
IDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
—
10
30
105
异柠檬酸钠400mg
MgCl2 150mg
蒸馏水105ml
乳酸脱氢酶
LDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
30
—
30
105
1molL乳酸钠10ml
蒸馏水95ml
苹果酸脱氢酶
MDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
30
—
30
105
1molL苹果酸钠15ml
蒸馏水90ml
苹果酸酶
ME
15 molL TrisHCl pH80 15ml
—
40
30
105
1molL苹果酸钠15ml
蒸馏水90ml
6磷酸葡萄糖脱氢酶
6PGDH
025 molL TrisHCl pH80 140ml
—
15
105
105
6磷酸葡萄糖酸钠75ml
超氧化物歧化酶
SOD
05 molL TrisHCl pH95 118ml
40
—
315
315
—
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DB21
辽宁省方标准
DB 21 T18611 —2010
水产生物种质检验技术规程
工酶电泳分析法
Isozyme procedure to detect germplasm for aquaculture species
2010 12 31发布
2011 02 01实施
辽宁省质量技术监督局发布
前言
标准GBT112009规起草
标准辽宁省海洋水产科学研究院提出
标准口单位：辽宁省海洋渔业厅
标准起草：刘卫东赫崇波高祥刚李云峰鲍相渤李宏俊苏浩
附录ABC均资料性附录
水产生物种质检验技术规程 工酶电泳法
1范围
规程规定水产动植物工酶电泳分析涉原理试剂仪器设备抽样样品制备电泳染色分析方法等
规程适水产动植物品种群体酶位点等位基分析遗传异质性分析
2术语定义
列术语定义适标准
21
工酶（isozyme）：
工酶生物体催化相反应级结构酶
22
等位基(allele)：
基种变异体二倍体体细胞基两等位基等位基分父母群体中基许等位基
23
均遗传杂合度(average heterozygosity)
H表示群体均座位杂合子例衡量标记方式信息含量程度
3 原理
工酶具样功效酶基表达产物带电荷分子形状电场凝胶中出现种工酶组分迁移率催化染色扫描根酶带迁移距离数目进行分析较判定生物物种种群遗传特性
4 试剂
非说明规程设计试剂均分析纯
41 95乙醇
42 甘油
43 盐酸（HCl）
44 氢氧化钠（NaOH）
45 硼酸
46 柠檬酸
47 乙二胺四乙酸（EDTA）
48 三羟甲基氨基甲烷（Tris）
49 L组氨酸
410 丙烯酰胺（Arc）
411 乳酸
412 N’N’亚甲基双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（Bis）
413 四甲基乙二胺（TEMED）
414 硫酸胺（AP）
415 DL苹果酸
416 α磷酸甘油钠
417 磷酸氢二钠（Na2HPO4）
418 二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）
419 辅酶Ⅰ（NAD）
420 辅酶Ⅱ(NADP)
421 吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）
422 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）
423 山梨醇
424 DL异柠檬酸三钠
425 6磷酸葡萄糖酸钠
426 α–乙酸萘酯
427 β乙酸萘酯
428 丙酮
429 坚牢蓝RR盐
430 氨基黑10B
431 固定液：3份乙醇1份甘油5份蒸馏水混合均匀
432 1molL盐酸：825ml重119浓盐酸加蒸馏水1000ml
433 浓缩胶缓液（TrisHCl pH68）：三羟甲基氨基甲烷60g溶40ml蒸馏水中1molL盐酸调pH值致68定容100ml
434 分离胶缓液（TrisHCl pH88）：三羟甲基氨基甲烷363g480ml 1molL盐酸混合蒸馏水定容100 ml
435 TG电极缓液(Tris甘氨酸 pH83)：三羟甲基氨基甲烷30g甘氨酸144g蒸馏水溶解定容1L
436 ArcBis液：丙烯酰胺30gN’N’亚甲基双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺08g蒸馏水溶解定容100ml02μm微孔滤膜抽滤棕色瓶保存4℃
437 15％硫酸胺：硫酸胺015g溶10ml蒸馏水中4℃保存周
438 连续聚丙烯酰胺凝胶：分离胶浓度25％～4％浓缩胶浓度7％～10％凝胶模具清洗安装根需分离胶浓度附录A配制分离胶混匀立灌注凝胶模具中胶面离板顶3cm处停止立注射器胶面顶部注入05cm高蒸馏水胶面整室温聚合40min水层分离胶呈现出明显界限时表示分离胶聚合完成排胶顶部蒸馏水浓缩胶缓溶液洗分离胶顶部该缓溶液排附录B配制浓缩胶灌入距板顶3mm处立插入试样格（梳子）移余凝胶液室温聚合15h
439 15molLTrisHCl (pH80)：三羟甲基氨基甲烷18171gHCl调节调节pH值80蒸馏水定容1L
440 15molLTrisHCl (pH95)：三羟甲基氨基甲烷18171gHCl调节调节pH值95蒸馏水定容1L
441 01molL磷酸缓溶液：二水磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O） 516g磷酸氢二钠（Na2HPO4）142g蒸馏水定容1L
442 40％蔗糖溶液：40g蔗糖溶100ml蒸馏水中
443 1％溴酚蓝：1g溴酚蓝溶100ml蒸馏水中定性滤纸滤装滴瓶
442 染色液：常工酶染色液配置方法见附录C
5 仪器设备
51 微量匀浆机： 转速4000rmin
52 高速冷冻离心机：转速15000rmin冷冻温度4℃
53 电泳仪
54 垂直版电泳槽
55 pH计：读数值001
56 微量进样器
57 制胶模具
58 染色缸
59 低温冰箱冰室温度30℃
510 恒温培养箱
511电子天：感量00001g
512相机
513扫描仪
6 抽样
61 活体体抽样
样应活体体群体样数少30
62 取样
工酶仅具种特异性体组织组织发育阶段具特异性取样应采取发育阶段体组织组织样品取1~2g血液样品应分离出血清样品应立放入低温冰箱中保存
7 分析步骤
71 分析样品制备
取03g样品1份样品加入3份体积例加入01molL磷酸缓溶液匀浆机4000rmin匀浆2min吸匀浆移入15ml离心中 4℃15000rmin离心清液澄清清液移入新离心中加入等体40％蔗糖溶液1滴1％溴酚蓝溶液分装15ml离心中75℃保存备
72 凝胶制备
凝胶制备438述方法进行
73电泳步骤
次电泳前先开恒温循环仪冷4℃左右
预电泳：试样格（梳子）拔出凝胶版安装电泳槽TG电极缓液注入电泳槽中50mA电流电泳30min
前电泳：预电泳结束点样孔中残留水分吸干微量进样器10μl～30μl分析样品加加样孔底部25mA电流电泳10min
正式电泳：200V恒压电泳4～5h溴酚蓝距胶板 lcm时停止
74 染色脱色固定
染色：凝胶放入预先配制37℃恒温箱中保温需检测酶染色液中染色酶带全部显示清晰时停止染色
脱色：25冰乙酸中脱色背景清晰透明
固定：脱色凝胶放入乙醇冰醋酸甘油水混合液中混合例3：1：1：5固定2h夜
75 制干胶片
取凝胶板适中玻璃纸浸泡湿润铺凝胶板排空气泡四周包紧室温然风干制成透明干胶
76 摄影扫描
镜头凝胶谱带相激光扫描仪谱带进行扫描
8 结果分析
81 酶位点等位基分析：根酶结构组成工酶组织中表现酶谱特征确定种工酶编码基位点态位点等位基频率
82 群体遗传异质性态座位例（P）均杂合度(H)度量分式计算：
式中
P——态座位例
n1——态座位数
n——测基总座位数
H——均杂合度
Xi——等位基i频率
附录A
（资料性附录）
分离胶配制例
储备溶液
分离胶浓度（）a
70
75
80
85
90
95
10
ArcBis液 （ml）
70
75
80
85
9．0
95
10
分离胶缓液 （ml）
2146
2094
2044
1994
1944
1894
1844
15％硫酸胺（ml）
15
15
15
15
15
15
15
TEMED （μl）
40
40
40
40
40
40
40
注a：凝胶体积30ml
附录 B
（资料性附录）
浓缩胶配制例
储备溶液
浓缩胶浓度（）a
25
3
35
4
ArcBis液 （ml）
08
10
12
13
浓缩胶缓液 （ml）
08
10
12
13
15％硫酸胺（ml）
05
05
05
05
蒸馏水（ml）
79
75
71
69
TEMED （μl）
15
15
15
15
注a：凝胶体积10ml
附录C
种常见工酶染色配制方法
(资料性附录)
工酶
染色缓液
辅酶Ⅰ
NAD(mg)
辅酶Ⅱ
NADP(mg)
1mgml
NBT(ml)
PMS
(mg)
试剂
醇脱氢酶
ADH
025molL TrisHCl pH80 140ml
22
—
105
105
95乙醇45ml
酯酶
EST
01 molL磷酸缓液 150ml
—
—
—
—
α–乙酸萘酯20mg
β乙酸萘酯20mg
丙酮1ml
坚牢蓝RR100
甘油3磷酸脱氢酶
α–GPDH
025molL TrisHCl pH95 114ml
45
—
21
105
1molL 甘油磷酸钠15ml
山梨醇脱氢酶
SDH
025molL TrisHCl pH80 140ml
22
—
105
105
山梨醇3g
异柠檬酸脱氢酶
IDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
—
10
30
105
异柠檬酸钠400mg
MgCl2 150mg
蒸馏水105ml
乳酸脱氢酶
LDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
30
—
30
105
1molL乳酸钠10ml
蒸馏水95ml
苹果酸脱氢酶
MDH
15 molL TrisHCl pH95 15ml
30
—
30
105
1molL苹果酸钠15ml
蒸馏水90ml
苹果酸酶
ME
15 molL TrisHCl pH80 15ml
—
40
30
105
1molL苹果酸钠15ml
蒸馏水90ml
6磷酸葡萄糖脱氢酶
6PGDH
025 molL TrisHCl pH80 140ml
—
15
105
105
6磷酸葡萄糖酸钠75ml
超氧化物歧化酶
SOD
05 molL TrisHCl pH95 118ml
40
—
315
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