第九章 基工程
学目标
掌握：1．基工程概念
2．基工程基程
熟悉：1．基工程常工具酶
2．基工程载体必备条件常载体
解：1．基工程科研床中应
1973年Cohen等首次DNA分子体外进行连接获重组DNA分子肠杆菌中成功表达开创基工程基工程作分子生物学项重技术迅速发展基工程(genetic engineering)称分子克隆技术重组DNA技术目DNA具复制力载体DNA连接形成重组DNA分子然导入受体细胞中进行复制表达相关基产物程利基工程量目DNA分子目基表达产物产物进行分析遗传病心血病肿瘤等种疾病研究治疗提供新方法途径生命科学发展起估量作
第节 基工程工具酶
基工程中需DNA分子进行切割重新连接修饰合成等操作程中需许酶类完成限制性核酸切酶外切酶DNA连接酶DNA聚合酶反转录酶等基工程中常工具酶见表91
表91基工程中常工具酶
工 具 酶
功
限制性核酸切酶
识特异核苷酸序列切割DNA分子
DNA连接酶
催化DNA中相邻5＇磷酸基3＇羟基末端间形成磷酸二酯键DNA切口封闭两DNA分子连接
DNA聚合酶I
具5＇→3＇聚合酶活性5＇→3＇核酸外切酶活性3＇→5’核酸外切酶活性合成双链DNA分子制作DNA探针DNA序列分析
BAL31核酸酶
具单链特异核酸切酶活性时具双链特异核酸外切酶活性
DNase I
适条件双链DNA机产生单链切口缺口移标记DNA探针DNaseI足迹分析法鉴RNA聚合酶等蛋白质DNA结合位点
碱性磷酸酶
切核酸5＇末端磷酸基团重组DNA时防止线性化载体分子发生连接
核酸外切酶III
双链DNA3＇羟基末端单核苷酸双链DNA分子产生单链区
T4聚核苷酸激酶
催化聚核苷酸5＇羟基末端磷酸化常标记核酸分子5＇末端寡核苷酸磷酸化
末端转移酶
催化5＇脱氧核苷三磷酸5＇→3＇方进行聚合逐脱氧核苷酸分子加线性DNA分子3＇羟基末端3＇羟基末端进行聚物加尾
反转录酶
催化RNA模板合成DNA反应合成CDNA代DNA聚合酶I进行填补标记DNA序列分析
Taq DNA聚合酶
催化PCR反应
限制性核酸切酶
限制性核酸切酶(restriction endonuclease)简称限制酶类够识双链DNA分子部特异DNA序列部周围通水解3′5′磷酸二酯键DNA链断核酸切酶绝数限制性核酸切酶源细菌相伴存甲基化酶构成细菌限制修饰体系（restriction modification systerm）限制外源DNA保护身DNA
（）命名原分类
限制酶命名根首次发现该酶类细菌属名种名相结合原通常三斜体字母缩略语表示第字母取产生该酶细菌属名写第二第三字母取该细菌种名写细菌株系第四字母代表株菌株含种限制酶罗马数字表示发现分离先序
例：
EcoR I ：E 代表Escherichia属
co代表coli种
R代表RY13株
I代表该菌株发现分离出第种酶
限制酶根结构作方式分三类：I型II型III型反应均需Mg2+参I型限制性切酶类兼限制性切酶修饰酶活性亚基蛋白复合体远离识序列意处切割DNA链产生特异性限制片段明确凝胶电泳条带III型限制性切酶类兼限制修饰两种功酶识序列外附切开DNA链求DNA分子中存两反识序列完成切割类酶少产生完全切割片段I型III型酶特异性强具备实价值基工程
通常说限制酶指II型限制性核酸切酶识序列部附特异切开DNA链切割位点序列知固定产生确定限制性片段凝胶电泳条带II型限制性核酸切酶基工程中广泛应重工具酶
（二）II型限制性核酸切酶作特点
1．识序列碱基数 II型限制性核酸切酶识核苷酸序列4bp6bp8bp例Not I识序列GCGGCCGC EcoR I识序列GAATTC果DNA中碱基序列机排列识4bp限制酶出现识切割位点频率隔256bp(44bp）会出现次类推识6bp8bp出现间隔分46bp48bp段特定DNA言限制酶识序列越短切割位点数越切割产生片段越相反识序列越长切割位点数越少切割产生片段越
2．识序列回文结构 II型限制性核酸切酶识核苷酸序列具回文结构(palindrome)称二元旋转称结构反重复序列指两条核苷酸链中5′→3′方核苷酸序列致EcoR I识序列两条核苷酸链中5′→3′方5＇GAATTC3＇
3．切割产生粘性末端端 限制酶切割双链DNA方式相数酶交错切开DNA产生带5＇3＇单链突出末端称粘性末端(sticky end)
EcoRI切割DNA产生5＇粘性末端：
→
5＇G↓AATTC3＇
3＇CTTAA↑G5＇
5＇G
3＇CTTAA
AATTC3＇
G5＇
+
部分限制性核酸切酶切开DNA产生5＇3＇端齐末端称端(blund end)钝端Sam I切割产生端：
→
5＇CCC↓GGG3＇
3＇GGG↑CCC5＇
5＇CCC
3＇GGG
GGG3＇
CCC5＇
+
（三）异源工酶尾酶
1．异源工酶 限制酶源识切割序列称异源工酶（isoschizomers）裂酶Bst IBamH I识序列相位点切割 (G↓GATCC)产生相粘性末端
2．尾酶 限制酶识序列切割DNA序列产生相粘性末端称尾酶（isoaudamers)BamH I(G↓GATCC)Sau3AI(N↓GATCN）产生相粘性末端称配伍末端（compatible end)配伍末端相互进行连接连接序列原先酶识切割
（四）影响限制性核酸切酶作素
影响限制性切酶作素包括DNA纯度结构DNA甲基化程度缓液反应温度作时间等酶单位数切割线性DNA标准规定消化类型DNA时应根DNA分子形状等适增加减少需酶量
1．DNA纯度结构 DNA样品中残留蛋白质RNA机溶剂等杂质高分子量DNA超螺旋DNA均会降低切酶消化效率
2．DNA甲基化 限制性核酸切酶识切割DNA序列甲基化识切割DNA序列中甲基化程度位置均会影响限制性核酸切酶作
3．反应缓液 限制性核酸切酶反应缓液成分包括TriHCl氯化镁氯化钠氯化钾β巯基乙醇二硫苏糖醇牛血清白蛋白甘油等限制性切酶缓液盐浓度求相般配制低盐（10mmolL NaCl)中盐（50mmolL NaCl）高盐（100mmolL NaCl）3种缓液满足酶消化反应两种酶消化DNA时种酶需盐浓度相消化时进行需盐浓度相必须先低盐浓度限制性切酶消化调整高盐缓系统加入高盐浓度限制性切酶继续消化限制性切酶消化反应中甘油浓度超5％（VV）会抑制切酶作20μl反应体系中甘油浓度应少1μl
4．反应温度时间 限制性切酶适温度数酶适反应温度37℃例外Sma I25℃Bcl I50℃反应时间根酶底物量加调整时间太长酶产生非特异性切割太短消化完全
5．限制性核酸切酶纯度量 酶纯度酶量酶切反应定影响
二T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）单链肽分子量68kD催化双链DNA3＇羟基双链DNA5＇磷酸基团形成3＇5＇磷酸二酯键具相黏性末端端DNA片段连接起
三DNA聚合酶I
DNA聚合酶I（DNA polymerase I）第肠杆菌中发现DNA聚合酶单条肽链构成分子量109kD该酶具三种酶活性：5＇→3＇DNA聚合酶活性5＇→3＇核酸外切酶活性3＇→5＇核酸外切酶活性DNA探针缺口移标记3＇粘性末端标记等
DNA聚合酶I枯草杆菌蛋白酶裂解产生片段称klenow片段（klenow fragment）保留5＇→3＇DNA聚合酶活性3＇→5＇核酸外切酶活性Klenow片段：① 补齐双链DNA3＇末端② 补齐时3＇末端进行标记③ 合成cDNA第二条链④ DNA序列测定
四反转录酶
反转录酶（reverse transcriptase）催化RNA模板合成cDNA反应合成方5＇→3＇反转录酶缺乏3＇→5＇核酸外切酶活性具RNaseH活性5＇3＇末端特异降解RNADNA杂交分子RNA链构建cDNA文库反转录PCR等技术中关键工具酶
五末端转移酶
末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferaseTdT）称末端脱氧核苷酰转移酶二价阳离子存末端转移酶需引物催化dNTP5＇→3＇方逐加DNA分子3＇羟基末端该酶种非特异性酶4种dNTP中种均作底物DNA 3＇末端标记聚尾加尾制备便重组连接工粘性末端者载体克隆片段形成聚物尾便进行基克隆
六碱性磷酸酶
碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）DNARNA链5＇末端磷酸基团载体目DNA重组程中碱性磷酸酶水解载体5＇端磷酸基团防止身连接环化提高重组效率DNARNA片段进行5＇端标记前需该酶处理常碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）牛肠碱性磷酸酶（CIP）两种CIP1 SDS溶液中68℃加热15分钟失活较常
七工具酶
基工程中常会工具酶例TaqDNA聚合酶耐高温DNA聚合酶核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶T4聚核苷酸激酶等
第二节 基工程载体
目DNA片段具备复制力导入宿细胞宿细胞增殖复制表达达外源DNA片段扩增目目DNA必须助载体DNA分子进入宿细胞进行复制表达载体（vector）携带外源目DNA进入宿细胞进行扩增表达类DNA分子数载体环状双链DNA少数线性目DNA片段载体体外连接构成重组分子然导入宿细胞进行扩增表达
载体功分克隆载体（cloning vector）表达载体（expressing vector）前者克隆扩增外源DNA片段者表达外源基载体兼备克隆表达两种功
理想载体必须具备条件：① 包含复制起始点宿细胞独立进行复制② 易宿细胞中分离提纯③ 具备筛选标记利筛选克隆重组子④ 包含限制酶切点克隆位点（multiplecloningsiteMCS)便目基插入⑤ 具较高遗传稳定性
肠杆菌宿细胞载体：质粒λ噬菌体粘粒M13噬菌体年发展系列新载体系统细菌中扩增真核细胞中表达着基治疗研究深入构建系列病毒载体系统
常克隆载体
（）肠杆菌克隆载体
肠杆菌宿细胞载体质粒λ噬菌体粘粒
1．质粒 质粒（plasmid）常克隆载体独立存细菌染色体外复制闭合环状双链DNA分子天然质粒通常缺乏高质量克隆载体必须元件需通工构建应基工程中质粒般具特征：① 分子相较2～200kb等细菌稳定存② 具松弛型复制子③ 具遗传标志便宿细胞进行选择例抗生素抗性基AmprTetr等④ 具限制性切酶切点便外源基插入⑤ 较高拷贝数
(1) pBR322质粒 pBR322质粒较早构建种质粒载体分子相较仅4363bp具氨苄青霉素抗性（Ampr）四环素抗性（Tetr）两基许重单限制酶位点密集AmprTetr区便外源DNA插入筛选见图91
图91 pBR322质粒物理图谱
（2）pUC系列质粒 pUC系列质粒pBR322质粒载体基础改造成长度约27kb包含氨苄青霉素抗性基（Ampr）肠杆菌β半乳糖苷酶基（lacZ基）α片段lacZ基α片段编码β半乳糖苷酶N端氨基酸序列（146氨基酸残基）Puc质粒结构见图92
图92 Puc18质粒物理图谱
（3）穿梭质粒 穿梭质粒(shuttle plasmid)工构建具两种复制起点筛选标记两种种属受体细胞中存活复制质粒克隆类载体外源基必更换载体直接种受体细胞转入种受体细胞中复制遗传例肠杆菌酵母菌穿梭质粒（YEp13)肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒（pBE2）肠杆菌动物细胞穿梭质粒（pBPVBV1）肠杆菌植物细胞穿梭质粒（Ti质粒）等穿梭质粒仅肠杆菌中复制扩增相应枯草杆菌酵母动物植物细胞中扩增表达数真核载体构建成穿梭质粒肠杆菌酵母菌穿梭质粒YEp13结构中包含pBR322完整序列2μm质粒复制起点酵母选择基LEU2等
质粒般容纳10kb外源DNA片段做亚克隆载体般说外源DNA片段越长越难插入越稳定转化效率越低
2．噬菌体载体 噬菌体（bacteriophagephage）类感染细菌病毒常作克隆载体噬菌体λ噬菌体M13噬菌体两种两者基结构生物学性状途
（1) λ噬菌体载体 野生型λ噬菌体DNA种双链线性DNA分子全长485kb两端带条12碱基组成互补5＇单链粘性末端λ噬菌体肠杆菌中繁殖需序列左右两臂中间约40％区域病毒生活必需λ噬菌体感染肠杆菌线性DNA分子助两端粘性末端互补配形成环状分子连接区域称cos位点(cohesiveendsite)噬菌体包装必需序列含外源DNA重组λDNA野生型λDNA长度75％~105％时体外包装成噬菌体颗粒λ噬菌体载体体外包装见图93
图93 λ噬菌体载体体外包装示意图
野生型λ噬菌体改造已衍生出百种克隆载体分两类：① 插入型载体插入型载体（insertionvectors）般限制性酶切位点供外源DNA插入容许10kbDNA插入通常构建cDNA文库片段DNA克隆λgtl0λgtl1目前应较广插入型载体克隆7kb外源DNA片段λgtl0433Kb含CI基（λ阻遏蛋白基）外源基插入CI基失活肠杆菌形成透明噬菌斑未重组λgt10形成透明斑点λgt ll437Kb含β半乳糖苷酶基α片段（lacZ＇基）外源基插入失活含Xgal培养基产生白色噬菌斑未重组λgt11形成蓝色斑点容易区分重组子非重组子②置换型载体置换型载体（replacement vector）限制性酶切位点酶切两位点间kDNA区段入噬菌体非必需区外源DNA插入取代承受较（9 Kb ~23Kb)外源DNA片段插入适克隆真核生物染色体DNA真核生物基组文库构建目前常EMBL系列Charon系列等噬菌体置换型载体EMBL4结构见图94
图94 EMBL4置换型载体
（2）M13噬菌体载体 载体M13噬菌体种丝状噬菌体感染含F子肠肝菌基组单链闭环DNA分子长度约64kbM13噬菌体感染肠杆菌细菌体单链DNA正链复制出互补负链DNA形成双链环状DNA称复制型(RF)M13DNA感染细胞累计100—200RF DNA时特殊蛋白质参时DNA合成产生子代正链DNA出芽形式释放出新带正链DNA噬菌体颗粒复制型M13DNA作克隆载体M13噬菌体优点细菌释放出颗粒中含单链DNA克隆互补双链中条源该单链作模板进行DNA序列分析作标记探针杂交分析作体外诱变模板受Ml3噬菌体感染细菌生长受定抑制细菌培养基会形成浑浊噬菌斑
野生型M13DNA常限制酶酶切位点需构建DNAIV基II基间插入段lacZ’基包含lacZ调控序列编码β半乳糖苷酶N端146氨基酸DNA序列lacZ’基中插入克隆位点Mp系列克隆载体M13衍生物常见M13mp18M13mp19等二者区仅lacZ’基部克隆位点序恰相反含lacZ’基载体进行DNA重组利否产生蓝白色噬菌斑菌落）进行筛选
3．粘性质粒 粘性质粒(cosmid) 称粘粒种克隆片段DNA设计构建杂合载体质粒DNAλDNAcos位点序列构建成具质粒入噬菌体DNA载体双重性质环状双链DNA载体
粘粒特点表现方面：① 含质粒复制起始点限制酶切点抗药性标记重组粘粒体外包装成病毒颗粒感染肠杆菌质粒复制方式进行扩增② 含λ噬菌体DNA粘性末端（cos位点序列）克隆较长外源DNA(长达40Kb～50kb)体外包装成噬菌体颗粒③ 身分子较kb没插入外源DNA非重组粘粒体外包装利筛选
（二）酵母克隆载体
酵母载体数细菌质粒DNA酵母DNA构造成穿梭质粒目前常酵母克隆载体酵母整合质粒酵母复制质粒酵母附加质粒酵母工染色体等
1．酵母整合质粒 酵母整合质粒（yeast integrative plasmidYIp）肠杆菌质粒pBR322基础插入酵母标记基（URA3LEU2等）含酵母复制起点YIp质粒样复制扩增般单拷贝形式存细胞中产生稳定重组子转化率极低
2．酵母复制质粒 酵母复制质粒（yeast replicating plasmidYRp）段包括复制起始位点（ARS）酵母基（TRP等）酵母染色体DNApBR322组成进行复制独立YRp转化率极高细胞中高拷贝数重组子非常稳定分配均匀母细胞中聚集量重组分子子代中造成拷贝数减少丢失
3．酵母附加质粒 酵母附加质粒（yeast episomal plasmidYEP）含2μm质粒载体YEP含完整2μm质粒含2μm质粒复制起点标记基转化频率细胞中拷贝数稳定性YRp相似
4．酵母工染色体 酵母工染色体（yeast artificial chromosomeYAC）利酵母染色体DNA细菌质粒pBR322改造成DNA分子具备着丝粒（centromereCEN）两端粒（telomereTEL)复制序列（ARS）选择标记（TRP1URA3）肠杆菌复制起点Ampr 基限制酶酶切位点等序列YAC装载容量插入05Mb～2Mb外源DNA片段片段DNA克隆代λ噬菌体载体粘粒载体构建文库类基组计划采该载体构建物理图谱
pYAC3pBR322基础插入酵母基构建成长114kb插入酵母基包含URA3TRP1SUP4标记基复制起点克隆时外源DNA插入SUP4基失活重组YAC导入trplura3双营养缺陷受体酵母菌缺乏色氨酸尿嘧啶培养基长出白色克隆非重组子长出红色克隆容易判断载体中否插入外源基
（三）病毒载体外源DNA带入哺乳动物细胞
年类遗传病恶性肿瘤基治疗研究中常常采逆转录病毒腺病毒腺相关病毒EB病毒等作基转移载体外源基导入受体细胞达纠正遗传缺陷杀死肿瘤细胞目数病毒载体均质粒化病毒载体质粒病毒启动子包装元件选择性遗传标记pBR322复制起始点组成
二常表达载体
表达载体宿细胞中表达（转录翻译）外源基载体DNA该类载体仅具复制起点选择标记克隆位点等克隆载体具备性质包含转录翻译必需DNA序列启动子转录终止序列核糖体结合位点等根受体细胞表达载体分原核表达载体真核表达载体两类
（）原核表达载体
1．原核表达载体结构 典型肠杆菌表达载体例原核表达载体具结构特点：含复制起点克隆位点筛选标记基具核糖体结合位点具强启动子强终止子肠杆菌表达载体常启动子tac启动子lacUV5启动子λ噬菌体PL启动子T7噬菌体启动子等肠杆菌表达载体结构模式见图95
图95肠杆菌表达载体结构模式图
2．原核表达载体分类 原核表达载体功分三类：① 融合蛋白表达载体：目基连接载体启动子原核结构基游载体结构基启动子目基载体结构基融合形式表达通常构建质粒载体原核蛋白包括谷胱甘肽巯基转移酶（GST）分泌蛋白A等pGEX4T1种常见融合表达质粒载体含lacIAmprpBR322复制起点oritac启动子段融合蛋白GST基序列紧接克隆位点便外源目基插入② 非融合型表达载体：该载体表达出外源蛋白N端含原核生物肽段外源基插入载体原核启动子核糖体结合位点游翻译起始位点ATG位外源基片段5＇端样原核宿中表达出非融合蛋白pKK2233载体种非融合型表达载体③ 分泌型表达载体：该载体表达出外源蛋白N端原核信号肽连接起宿菌分泌细胞周质培养基中
（二）真核表达载体
真核表达载体通常含选择标记复制起始位点启动子转录终止序列poly（A）加尾信号克隆位点真核表达载体数穿梭载体两套复制起点选择标记分原核真核细胞中起作常见真核表达载体酵母表达载体哺乳动物细胞表达载体
1．酵母表达载体 酵母表达载体数穿梭质粒酵母肠杆菌中均进行复制扩增通常含复制起始序列启动子筛选标记分泌信号终止子丝分裂稳定区外源基克隆位点
酵母作酵母表达载体宿许优越性：① 作单细胞生物操作生产相简单成低廉② 具蛋白质翻译加工修饰系统表达外源蛋白分泌培养基中便纯化③ 具MOX（Methanol Oxidase)AOX（Alcohol Oxidase)lac4等强启动子
2．哺乳动物细胞表达载体 原核启动子哺乳动物细胞中发挥作动物病毒载体启动子类巨细胞病毒（CMV）启动子Rouse肉瘤病毒基组长末端重复序列（RSV）中启动子等宿范围较广种受体细胞中定活性目前构建许哺乳动物细胞基表达载体源动物病毒基腺病毒载体反转录病毒载体空泡病毒载体（SV40）牛乳头瘤病毒载体等病毒载体相高效安全稳定外源基携带进入宿细胞实现表达
工构建哺乳动物细胞载体应具备条件：① 含原核复制起始位点抗生素抗性基利外源基片段克隆筛选② 具备真核细胞筛选标记基常标记基：胸苷激酶基（thymidinekinaseTK）二氢叶酸原酶基（dihydrofolatereductaseDHFR)氯霉素乙酰转移酶基（chloramphemcolacetyltransferaseCAT)新霉素抗性基（neomycinresistanceNEO）等③ 含转录终止信号polyA加尾信号④ 具哺乳动物细胞启动子增强子 ⑤ 含选择剪切信号⑥ 含限制酶单酶切位点便真核基插入
第三节 基工程基原理步骤
基工程基步骤包括：① 目基获取② 载体选择构建③目基载体连接形成DNA重组体④ DNA重组体导入宿细胞⑤ DNA重组体筛选鉴定⑥ DNA重组体扩增表达基工程基步骤见图96
图96基工程基步骤
目基获取
1．基组DNA文库获取 基组文库(genomic library）指含机体细胞基组DNA全套重组DNA分子集合基组文库中筛选目基通核酸分子杂交方法进行放射性核素标记已知序列DNA片段者基组文库中克隆进行杂交放射显影筛选出阳性克隆获目基
2．cDNA文库获取 cDNA文库（cDNAlibrary）提取组织细胞总mRNA反转录酶催化合成双链cDNA（complementaryDNAcDNA）适载体连接转入受体细胞构建成cDNA文库中获取目基方法DNA文库中获取方法相外 cDNA文库中获取利特异性抗体特异性结合蛋白筛选目基
3．PCR法获取 利PCR直接基组DNAcDNA模板高效快速扩增出目基前提必须知道目基5＇3＇端段核苷酸序列设计合成适引物获特定目基
4．化学工合成法获取 果目基序列已知根蛋白质产物氨基酸序列推导出基核苷酸序列利DNA合成仪通化学方法合成目DNA法适合成较DNA片段（100bp左右）较长链分段合成然连接酶定序加连接
二载体选择构建
目基必须合适载体携带进入宿细胞进行复制表达选择合适载体基工程目操作基性质时考虑载体中否合适限制性酶切位点种常克隆载体性质途见表92
表92 常克隆载体性质途
载体
插入目DNA
受体细胞
质粒
<10kb
细菌酵母
λ噬菌体
<20kb
细菌
粘粒
<50kb
细菌
BAC
<400kb
细菌
YAC
<3Mb
酵母
选种载体首先获载体分子分离纯化入噬菌体DNA制备粘性质粒关质粒DNA获载体DNA采适限制性核酸切酶载体DNA进行切割质粒粘性质粒M13噬菌体复制型DNA分子酶切单线性分子λ噬菌体DNA获左臂右臂两线性分子获线性DNA分子碱性磷酸酶处理掉5＇端磷酸便目基片段进行连接
三目基载体连接
途径获目基构建载体分限制性核酸切酶消化DNA连接酶催化两DNA片段体外连接形成重组DNA分子体外连接方式四种：
（）粘性末端连接
目DNA载体DNA种限制酶切割产生相粘性末端限制酶切割形成互补黏性末端（配伍末端）两者起退火时粘性末端单链间进行碱基配然DNA连接酶连接末端缺口成环状重组DNA分子种方法适合DNA片段连接种限制酶处理载体两端碱基序列互补发生身环化形成空白载体降低重组效率目基筛选带困难避免方法碱性磷酸酶处理酶切载体防止环化
（二）工接头连接
工接头（linker）指工设计合成含限制酶识位点段双链脱氧核苷酸片段末端DNA先工接头连接产生新限制性酶切位点切割粘性末端连接方式进行连接
（三）末端连接
DNA限制酶切割产生末端粘性末端特殊酶处理突出末端削补齐变端均T4 DNA连接酶催化连接端连接效率远低粘性末端连接避免载体DNA身环化目基插入载体会出现正反两种方性种连接方法适合DNA片段连接提高连接效率连接样DNA片段时适提高连接反应中ATPT4 DNA连接酶浓度
（四）聚物加尾连接
加入聚物（homopolymer)尾处理易连接DNA片段种效方法基克隆中应十分广泛目DNA核酸外切酶消化产生3＇粘性末端限制酶（Pst I）消化产生具3＇羟基单链末端暴露出3＇羟基末端末端转移酶催化某种单脱氧核苷酸底物逐加3＇羟基末端形成相应脱氧核苷酸聚物尾（聚G)载体DNA加目DNA聚物尾互补脱氧核苷酸聚物尾（聚C）两者混合两种DNA分子通互补聚物尾互补配形成氢键末端间空隙导入宿菌DNA聚合酶I行修复连接
四重组DNA导入受体细胞
重组DNA分子必须导入宿细胞进行复制表达扩增宿细胞称受体细胞分原核细胞真核细胞两类原核细胞包括肠杆菌枯草杆菌链球菌等中肠杆菌常真核细胞包括酵母植物细胞哺乳动物细胞昆虫细胞
重组DNA导入宿细胞方式转化感染转染转化(transformation)质粒DNA载体构建重组DNA导入受体细胞获新表型程常宿菌肠杆菌转染(transfection)指表达载体导入真核细胞程感染噬菌体病毒载体重组DNA分子体外包装成具感染力噬菌体病毒颗粒然感染适宿细胞重组DNA导入宿细胞
作基工程宿细胞应具备特征：① 安全性高感染寄生缺陷原核细胞常肠杆菌K12改造安全宿菌肠道存活率存活率极低② 易转化③ 限制—修饰系统缺陷型重组DNA导入宿细胞（肠杆菌）宿限制酶消化遭破坏须选R(restriction negative)菌株④ 重组缺陷型避免重组DNA发宿染色体DNA发生重组应选择Rec（recombination negative)菌株⑤ 遗传表型具互补功便转化细胞筛选量选择目基功缺陷宿细胞
（） 转化法
氯化钙转化法处数生长期肠杆菌悬浮冰冷氯化钙低渗溶液中细胞发生膨胀细胞膜磷脂层形成液晶结构解离细胞外膜膜间部分核酸酶促细胞成具摄取外源DNA力细胞感受态细胞(competent cell)Ca2+DNA分子结合成抗DNA酶羟基—磷酸钙复合物粘附细胞膜表面42℃热休克处理1分钟细胞膜液晶结构发生改变通透性增加形成间隙外源DNA进入细胞
（二）转染法
转染转化感染两单词构成新词指真核细胞动摄取导入外源DNA片段获新遗传表型程常方法电穿孔法磷酸钙沉淀法脂质体融合法等进入宿细胞DNA整合宿细胞基组中宿细胞染色体外存表达
1．脂质体转染法 阳离子脂质体(cationicliposome)中性磷脂阳离子脂质组成种磷脂双分子层膜性结构利脂质体外源基导入真核细胞种常简单快速基导入方法原理阳离子脂质体试剂DNA混合形成种稳定脂质双层复合物DNA包裹脂质体中间种脂质双层复合物直接加培养细胞中脂质体粘附细胞表面细胞膜融合DNA释放胞质中进入细胞基细胞中酶作进行表达整合脂质体转染法宿细胞损伤转移效率高种温基转移方法适种类型核酸分子导入培养细胞
种新型脂质体Lipofection阳离子脂质（DOTMA）中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）合成作机制传统脂质体非核酸包入脂质体囊阳离子脂质体通静电引力作带负电荷DNA发形成DNA脂质体复合物净电荷正复合物容易吸附带负电荷细胞膜表面细胞融合通细胞吞作进入胞法适DNA转染入悬浮贴壁培养细胞转染时需加入血清抗生素瞬时转染稳定转染转染效率高稳定性年广泛DNARNA蛋白质导入活细胞
2．DNA磷酸钙转染法 转化DNA氯化钙磷酸缓液混合形成包含DNA微磷酸钙颗粒磷酸钙DNA复合物粘附细胞膜表面细胞通胞饮作摄入外源DNA法DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达长期转化研究转化效率较低
3．电穿孔法 电穿孔法（electroporation）通短暂高压脉电场细胞膜产生瞬时逆性微孔通道重组DNA分子导入细胞方法法转化效率受细胞状态电压（022kV)电容（251000μF）DNA浓度脉时间（055毫秒）等素影响适悬浮培养细胞肠杆菌转化操作稳定性较基工程中应普遍
4．显微注射法 制备转基动物时外源基通毛细玻璃显微镜直接注射受精卵细胞核种基转染方法称显微注射法（microinjection)
外DEAE葡聚糖转染法等种转染方法
（三）感染法
法模拟病毒感染细胞生物程病毒DNA载体外源基直接转染特定受体细胞该方法具定性导入效率高等优点例重组λ噬菌体DNA体外包装成完整噬菌体然感染肠杆菌重组DNA导入细胞具感染力噬菌体颗粒包装方法重组λDNA含量噬菌体尾部蛋白λ噬菌体突变株宿溶菌物含量噬菌体头部蛋白突变株Dam宿溶菌物混合包装成具感染力噬菌体颗粒
重组反转录病毒载体体外包装需辅助细胞（ϕ2细胞）参ϕ2细胞表达反转录病毒全部基产物缺乏包装位点（ϕ位点）包装病毒RNA产生新辅助病毒颗粒果重组反转录病毒载体感染ϕ2细胞RNA中含位点ϕ2细胞提供蛋白质包装成新反转录病毒感染宿细胞反转录双链DNA整合入宿基组中
种感染方法目前较常包装逆转录病毒直接感染宿细胞进行逆转录整合入宿细胞基组表达外源基
利述种种方法外源基导入真核宿细胞极少数细胞外源基整合基组稳定表达便鉴定稳定转染细胞株常选择标记基目基连接重组载体进行转染表达特定选择标记基重组体够筛选鉴定出
五重组体筛选鉴定
筛选（screening）转化细胞群中鉴出真正含目基转化子外源基导入宿细胞首务筛选含目基阳性克隆加扩增筛选方法遗传学方法免疫学方法核酸杂交法PCR等
（）抗生素抗性筛选
利克隆载体携带某种抗生素抗性基种抗生素抗性基应受体菌细胞缺陷性基含种完整抗性基转化菌含该抗生素培养基生存形成菌落非转化菌杀死种遗传学选择方法数目庞细胞群体中筛选特定细胞效方法
质粒带两种抗生素抗性基外源DNA插入中抗性基中时该基会失活重组质粒转化细菌含该抗生素培养基生长含外种抗生素培养基中生长非重组质粒含两种抗生素培养基均生长法常区分质粒重组体非重组体
（二）蓝白筛选
蓝白筛选称α互补筛选筛选法功互补筛选带β半乳糖苷酶N端长146氨基酸α片段载体带β半乳糖苷酶C端序列（ω片段）受体细胞互补单独存β半乳糖苷酶α片段ω片段均β半乳糖苷酶活性二者存时产生β半乳糖苷酶酶活性IPTG诱导色工底物Xgal水解生成蓝色产物形成蓝色菌落（噬菌斑）β半乳糖苷酶活性菌落（噬菌斑）呈现白色种筛选方法称蓝白筛选
含LacZ’基（α片段）载体（PUC系列质粒λgt11等）筛选鉴定载体中LacZ’基编码产物β半乳糖苷酶α片段转化表达β半乳糖苷酶ω片段宿菌（突变型lacEcoli）果外源基插入LacZ’基克隆位点LacZ’基失活产生α片段丧失α互补力菌落（噬菌斑）呈现白色克隆位点没成功插入目基载体转化表达β半乳糖苷酶ω片段宿菌生长菌落（噬菌斑）成蓝色载体时具抗生素抗性基没成功转化载体受体菌生长种颜色标志重组克隆非重组克隆区分目然
（三）核酸杂交筛选
核酸杂交筛选直接针克隆目基筛选常杂交方法菌落原位杂交Southern杂交菌落原位杂交先硝酸纤维膜尼龙膜覆盖生长琼脂板菌落噬菌斑定位轻轻揭起膜样部分细菌噬菌体吸附膜处理膜DNA变性烘干固定然DNARNA探针杂交X光片曝光筛选找阳性菌落进行克隆表达培养Southern杂交筛选程培养菌落噬菌斑中提取重组DNA琼脂糖凝胶电泳分离进行变性转膜然探针进行杂交筛选出阳性克隆进步进行培养扩增
（四）限制酶酶切图谱筛选
常规方法提取重组DNA直接进行琼脂糖凝胶电泳果插入载体目基片段较重组体迁移率明显载体直接筛选阳性克隆明确区分迁移率重组体选择适限制性酶进行酶切切出目基片段克隆琼脂糖凝胶电泳图谱中观察目基条带阳性克隆
（五）PCR筛选
根目基两端序列设计引物克隆DNA模板进行PCR扩增扩增出量目基克隆阳性克隆PCR阳性克隆筛选十分效需提取DNA分子进行筛选
（六）DNA序列分析筛选
直接培养克隆DNA进行序列分析含目基序列克隆阳性克隆时筛选方法鉴定出阳性克隆终插入目基进行序列分析进步验证准确性
（七）免疫学方法筛选
免疫学方法应特异性抗体目基表达产物相互作进行筛选属间接选择法果克隆基表达产物已知菌落噬菌斑中表达免疫法特异性强灵敏度高相应抗血清单克隆抗体通放射免疫化学发光显色反应进行筛选适筛选宿菌提供标志基
六重组体表达
基工程目获量目基表达产物—蛋白质目基正确位置方表达载体连接然导入相应宿细胞培养含重组体宿细胞目基表达蛋白表达体系原核表达体系真核表达体系
（）原核表达体系
肠杆菌前采原核表达体系外源基插入原核启动子游肠杆菌RNA聚合酶识该启动子外源基转录出mRNA进翻译成蛋白质
原核表达体系中表达目基需具备特点：① 含子肠杆菌缺乏真核转录加工系统剪切含子表达真核cDNA表达基组DNA② 强启动子翻译调控序列表达载体具调控转录产生量mRNA强启动子（tacPLT7等）翻译调控序列（翻译起始位点SD序列等）③ 正确阅读框架外源基插入表达载体必须形成正确阅读框架正确编码蛋白质④ 含信号肽等相应DNA序列肠杆菌缺乏真核细胞特蛋白质翻译加工修饰体系糖基化磷酸化信号肽剪切等编码分泌性蛋白真核基必须删信号肽编码序列
外目基插入载体DNA位置宿选择表达蛋白稳定性具重作表达外源蛋白够稳定易细菌蛋白酶降解通表达融合蛋白方式选缺乏相应蛋白酶宿菌提高稳定性
融合蛋白指表达蛋白质肽链N端原核基特殊DNA序列编码肽段（融合标签）C端真核外源DNA编码常融合标签包括GST6His标签GFP等融合蛋白方便表达产物分离纯化般常常利生物分子特异性相互作选择合适亲层析分离融合蛋白特异性相互作常见酶底物诱导契合受体配体间相互作抗原抗体间特异性结合作方式（Ni2+6His标签结合）等果设计融合基时目基融合标签序列间加入适裂解位点融合蛋白化学处理（CNBr)特异蛋白酶（凝血子X胶原酶肠激酶等）水解容易目蛋白融合蛋白中释放出
原核表达体系融合蛋白表达优点：① 融合蛋白较稳定易细菌蛋白酶水解② 果载体携带肠杆菌结构基片段编码段信号肽产生分泌型产物③ 利针融合蛋白中原核部分单抗进行亲层析便纯化④ 原核蛋白部分蛋白酶切掉释放出天然真核蛋白质
选择适受体菌株诱导条件选择提高原核表达体系表达效率非常重特定蛋白质说菌株中获相表达效率时需试种菌株选择种菌株
表达产物检测鉴定方法：① SDSPAGE电泳鉴定转化菌诱导表达提取菌体蛋白SDSPAGE电泳染色脱色观察否出现目蛋白相应蛋白条带② Western杂交鉴定果SDSPAGE初步证实存目蛋白条带进步鉴定特异性常常利特异结合抗体进行蛋白质杂交③ 蛋白质生物活性测定 蛋白质生物活性测定判断外源基否表达力证④ 蛋白质序列分析 目蛋白进行氨基酸序列分析获准确终结果
（二）真核表达体系
结构复杂蛋白质原核细胞中正确折叠修饰具生物学活性目基真核基组DNA时必须采真核表达体系克隆基哺乳动物细胞中进行表达必须先基插入适真核表达载体中首先重组表达载体肠杆菌中进行扩增肠杆菌中提取纯化重组表达载体然导入真核表达体系进行表达
哺乳动物细胞中表达基基组DNAcDNA质粒载体DNA脂质体介导电穿孔技术DEAE葡聚糖磷酸钙沉淀等方法直接导入宿细胞病毒载体DNA须先进行病毒颗粒包装获假病毒颗粒感染受体细胞终筛选出转染细胞持续培养便清中表达产物转染细胞培养中持续添加抗生素逐渐加药物浓度增加选择压力样提高阳性克隆拷贝数提高表达效率
表达系统相哺乳动物表达系统优势够指导蛋白质正确折叠提供复杂准确糖基化等种翻译加工功表达产物分子结构理化性质生物学活性方面接天然高等生物蛋白质目前采受体细胞COS细胞（猿猴肾细胞）CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）COS细胞源SV40病毒转化非洲绿猴肾细胞中COS7常细胞系组成性表达SV40T抗原带SV40复制起始位点转染质粒够高拷贝数进行复制进行外源基瞬时表达时途广宿COS7般病毒转染研究细胞基转录研究CHO细胞利外源基目稳定整合易规模培养血清蛋白条件生长真核生物基表达较成功宿细胞
酵母简单真核生物具遗传背景清楚操作简单易发酵成低廉等特点哺乳动物细胞样表达蛋白进行折叠翻译修饰种酵母菌株表达分析真核蛋白非常哺乳动物细胞相酵母表达系统易操作价格便宜酵母表达系统适规模表达重组真核蛋白理想工具
昆虫表达系统理想重组真核蛋白表达系统昆虫高等真核生物哺乳动物类似进行翻译加工修饰昆虫细胞生长速度快培养条件简单易悬浮培养基工程中规模表达蛋白质两类：果蝇表达系统杆状病毒表达系统
知识拓展
电子克隆体系
电子克隆（insilicocloning)基克隆效辅助手段着类基组计划种模式生物全基组测序完成基数库断完善种计算机分析软件开发互联网广泛应生物信息学已成非常重种研究方法通基数库进行序列搜索分析拼接整合预测新假定全长基然通分子生物学实验方法加证实相应组织细胞中获种基电子克隆
进行基克隆时传统基克隆方法相电子克隆加快新基发现速度提高工作效率提供种基存性种基数库目前日趋十分完善囊括量基信息数库种分析预测软件辅助成新型技术方法
第四节 基工程应
着基工程诞生技术发展目前基工程已成生物科学核心技术已广泛应医药卫生农牧业等众领域取巨成
基定点诱变
工业生产常常希酶具更长半衰期更高稳定性够适应更广酸碱度范围床医学方面希蛋白质肽药物疗效更高副作更代谢半衰期更长显然天然蛋白质完全满足述种需需然界存蛋白质进行改造进步分析功者通基改变修饰改造某已知蛋白质研究蛋白质结构功关系蛋白质分子间相互作基工程重手段例现已发展起种体体外基诱变方法中具重意义Michael smith1982年发明寡核苷酸介导定点诱变技术简称定点诱变技术site directed mutagenesis)利分子生物学技术体外通核苷酸取代插入删基DNA序列中（）特定核苷酸发生改变技术
基工程定点诱变基原理：① 首先制备单链模板利体外DNA重组技术诱变目基插入复制型双链M13噬菌体载体转化细菌制备含目基M13单链DNA作诱变模板② 根需设计合成带诱变核苷酸序列寡核苷酸引物带目DNA单链M13模板进行杂交③ 加入DNA聚合酶4种脱氧核糖核苷酸杂交寡核苷酸引物延伸④ DNA连接酶新合成异源双链DNA连接成闭合环状分子⑤ 转化宿细菌断复制获诱变DNA分子⑥ 筛选带诱变DNA重组噬菌体提取单链DNA进行序列分析⑦ 重组噬菌体中提取含诱变DNA复制型DNA进步诱变DNA进行研究扩增
二基诊断基治疗
基诊断基水检验基存状态缺陷疾病作出诊断方法特定DNA片段制成探针利DNA分子杂交原理鉴定检测标遗传信息达检测疾病目目前已利基工程技术发现种类疾病（包括遗传病恶性肿瘤感染性疾病等）致病基疾病诊断治疗提供坚实理基础
基治疗20世纪80年代发展起预防治疗疾病具革命性生物医学医疗技术原理动物正常基治疗作基通定方式导入体靶细胞纠正基缺陷发挥治疗作达治疗疾病目
三遗传病预防
疾病基克隆仅遗传病诊断治疗提供力手段更重手段应产前诊断症状前诊断时结合早期预防积极治疗等措施效预防遗传病患出生遗传疾病发生般表型诊断方法胎出生前疾病发生前遗传病进行诊断 基分析技术检测胎异常基遗传病预防效手段
知识拓展
血红蛋白病诊断
基诊断发展程中早采基诊断疾病遗传病发展现仅发病机制清楚已找致病基疾病进行基诊断发生分子机制明遗传性疾病通连锁分析进行基诊断 血红蛋白病苯丙酮尿症杜氏肌营养良症等基诊断典型例子
血红蛋白病血红蛋白结构合成异常致遗传性血液病惯分异常血红蛋白中海贫血两类前者珠蛋白基突变引起珠蛋白肽链结构改变致者珠蛋白肽合成速率降低α链β链合成衡引起称中海贫血
目前较普遍采PCR扩增法检测两基缺失情况基水中海贫血患者进行基型分型应定量RTPCR技术测定β珠蛋白mRNA含量根改变作出诊断该方法仅诊断中海贫血准确诊断β中海贫血杂合子
四基工程制药
许药物生产生物组织中提取获受材料源限制产量限价格昂贵利基工程技术生产应价值药物仅解决产量问题降低生产成世界第种基工程药物美国Lllly公司1982年率先利基工程技术生产市重组胰岛素诞生标志着基工程药物时代基工程生产药物效率高成低品质迄止已开发出数百种基工程药物包括胰岛素干扰素凝血子促红细胞生成素生长激素种单抗预防乙型肝炎伤寒霍乱疟疾疫苗等中部分已投入市场部分处床试验阶段
床应
基工程重组胰岛素
基定点诱变技术应典胰岛素蛋白质工程例基工程重组胰岛素作首基工程产品已1982年投放市场
胰岛素治疗糖尿病特效药物胰岛素分子AB两条肽链组成含51氨基酸残基第测序蛋白质第工合成蛋白质床已种利蛋白质工程制造性优良胰岛素突变体
例种定点诱变制备长效胰岛素胰岛素B链27位Thr改ArgB链羧端氨基化A链21位Asn改Gly血浆中半衰期延长35时胰岛素作定点诱变等电点改变延迟吸收实际延长吸收半衰期种胰岛素类似物已具较床效果天注射次种长效胰岛素天然胰岛素分泌水相
种定点诱变制备胰岛素快速吸收正常生理情况胰岛素体断分泌进餐立引起体胰岛素水升高时达高峰胰岛素调血液中血糖水约3时恢复基础水样维持血液中血糖始终处正常水胰岛素治疗糖尿病时连续断进行注射时皮注射胰岛素时吸收非常慢会导致高血糖35时胰岛素水继续升会导致低血糖状态克服缺点利蛋白质工程方法制备单体胰岛素注射单体胰岛素快速吸收
实际血液中循环胰岛素活性状态胰岛素单体注射胰岛素溶液（103mo1L）中性情况数锌结合六聚体改进注射时胰岛素吸收速度换氨基酸残基例二聚体接触面换具相反电荷残基插入具侧链氨基酸等方法减少六聚体形成样制备出胰岛素类似物吸收速度溶性野生型胰岛素快
五基靶转基
DNA重组基靶技术转基技术重手段目前已迅速广泛应生物学医学基础研究动物育种植物品种改良转基药物等领域研究目前利基工程方法已获转基抗虫棉晚熟保鲜番茄抗寒番茄抗草剂玉米油菜豆品质优良抗病产转基动物等时利外源基哺乳动物体表达获类需种物质激素抗体疫苗等
（张竞文）
题
选择题
A型选择题
1．列项中说明外源目基完成受体细胞中表达（ ）
A．棉花二倍体细胞中检测细菌抗虫基
B．肠杆菌中检测胰岛素基mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测生长激素DNA系列
D． 酵母菌中提取干扰素蛋白
E． PCR技术白血病中检测微量残留癌细胞
2．列关基工程错误（ ）
A．目基受体细胞均动植物微生物
B．限制性核酸切酶DNA连接酶两类常工具酶
C．胰岛素原基肠杆菌中表达胰岛素原生物活性
D．载体抗性基利筛选含重组DNA细胞核促进目基表达
E．目前条件基治疗限体细胞
3． 关PCR说法正确（ ）
A．PCR项生物体外复制特定DNA片段核酸合成技术
B．PCR技术原理DNA双链复制
C．PCR技术获取目基前提段已知目基核苷酸序列 D．PCR扩增中必须解旋酶解开双链DNA
E．PCR发展日新月异衍生PCR技术
4．列关蛋白质工程说法正确（ ）
A．蛋白质工程师分子水蛋白质分子直接进行操作
B．蛋白质工程产生出然界存新型蛋白质分子
C．蛋白质改造通直接改造相应mRNA实现
D．蛋白质工程流程天然蛋白质合成程相
E．蛋白质定性定量分析揭示全基组表达活性
5．列关质粒说法正确（ ）
A．质粒广泛存细菌酵母等种微生物中
B．质粒种双链环状DNA分子
C．具限制性切酶位点
D．质粒便外源基插入
E．质粒具遗传标准宿细胞进行选择
6．列项基克隆需工具酶（ ）
A．DNA聚合酶I B． 逆转录酶 C． 碱性磷酸酶
D． 限制性切酶 E．胰蛋白酶
7．关常克隆载体正确（ ）
A．质粒常载体 B．噬菌体重组携带外源DNA
C．粘性质粒克隆较DNA片段 D．M13噬菌体适合克隆mRNA片段
E．病毒载体常外源DNA带入哺乳动物细胞
8．真核细胞转染方法包括（ ）
A．RTPCR B．电穿孔法 C．脂质体介导法
D．DEAE葡聚糖法 E．显微注射法
9．关cDNA文库 正确（ ）
A．目基cDNA文库中获 B．mRNA模板合成互补DNA
C．特定状态特定细胞全部cDNA克隆 D．必须高质量DNA模板
E．cDNA文库基组文库
10．列项重组DNA筛选鉴定关（ ）
A．采抗性标记筛选细菌克隆 B．采特定抗性基失活进行筛选
C．磷酸钙沉淀法筛选 D．酶切鉴定法 E．DNA测序法
X型选择题
1．目基克隆需载体常载体（ ）
A．质粒 B．噬菌体 C．粘性质粒 D．病毒 E．酵母菌
2．克隆基体外表达系统包括（ ）
A．肠杆菌 B．哺乳动物细胞 C昆虫 D．病毒 E酵母菌
3．基工程步骤包括（ ）
A．制备目基相关载体 B．目基载体连接
C．重组DNA导入受体细胞 D．DNA重组体筛选鉴定 E．DNA重组体扩增
4．做克隆载体噬菌体包括：
A．λ噬菌体 B．肠杆菌 C．M13噬菌体 D．逆转录病毒 E．粘性质粒
5．合适策略DNA片段进行连接（ ）
A．粘性末端适合DNA片段连接 B．工接头处理易连接DNA片段
C．加入聚物尾 D．DNA片段导入感受态细胞
E．端DNA片段连接酶连接
二思考题
1．请举例说明利重组DNA基进行定点诱变改造实例
2．简述基克隆基程步骤
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学目标
掌握：1．基工程概念
2．基工程基程
熟悉：1．基工程常工具酶
2．基工程载体必备条件常载体
解：1．基工程科研床中应
1973年Cohen等首次DNA分子体外进行连接获重组DNA分子肠杆菌中成功表达开创基工程基工程作分子生物学项重技术迅速发展基工程(genetic engineering)称分子克隆技术重组DNA技术目DNA具复制力载体DNA连接形成重组DNA分子然导入受体细胞中进行复制表达相关基产物程利基工程量目DNA分子目基表达产物产物进行分析遗传病心血病肿瘤等种疾病研究治疗提供新方法途径生命科学发展起估量作
第节 基工程工具酶
基工程中需DNA分子进行切割重新连接修饰合成等操作程中需许酶类完成限制性核酸切酶外切酶DNA连接酶DNA聚合酶反转录酶等基工程中常工具酶见表91
表91基工程中常工具酶
工 具 酶
功
限制性核酸切酶
识特异核苷酸序列切割DNA分子
DNA连接酶
催化DNA中相邻5＇磷酸基3＇羟基末端间形成磷酸二酯键DNA切口封闭两DNA分子连接
DNA聚合酶I
具5＇→3＇聚合酶活性5＇→3＇核酸外切酶活性3＇→5’核酸外切酶活性合成双链DNA分子制作DNA探针DNA序列分析
BAL31核酸酶
具单链特异核酸切酶活性时具双链特异核酸外切酶活性
DNase I
适条件双链DNA机产生单链切口缺口移标记DNA探针DNaseI足迹分析法鉴RNA聚合酶等蛋白质DNA结合位点
碱性磷酸酶
切核酸5＇末端磷酸基团重组DNA时防止线性化载体分子发生连接
核酸外切酶III
双链DNA3＇羟基末端单核苷酸双链DNA分子产生单链区
T4聚核苷酸激酶
催化聚核苷酸5＇羟基末端磷酸化常标记核酸分子5＇末端寡核苷酸磷酸化
末端转移酶
催化5＇脱氧核苷三磷酸5＇→3＇方进行聚合逐脱氧核苷酸分子加线性DNA分子3＇羟基末端3＇羟基末端进行聚物加尾
反转录酶
催化RNA模板合成DNA反应合成CDNA代DNA聚合酶I进行填补标记DNA序列分析
Taq DNA聚合酶
催化PCR反应
限制性核酸切酶
限制性核酸切酶(restriction endonuclease)简称限制酶类够识双链DNA分子部特异DNA序列部周围通水解3′5′磷酸二酯键DNA链断核酸切酶绝数限制性核酸切酶源细菌相伴存甲基化酶构成细菌限制修饰体系（restriction modification systerm）限制外源DNA保护身DNA
（）命名原分类
限制酶命名根首次发现该酶类细菌属名种名相结合原通常三斜体字母缩略语表示第字母取产生该酶细菌属名写第二第三字母取该细菌种名写细菌株系第四字母代表株菌株含种限制酶罗马数字表示发现分离先序
例：
EcoR I ：E 代表Escherichia属
co代表coli种
R代表RY13株
I代表该菌株发现分离出第种酶
限制酶根结构作方式分三类：I型II型III型反应均需Mg2+参I型限制性切酶类兼限制性切酶修饰酶活性亚基蛋白复合体远离识序列意处切割DNA链产生特异性限制片段明确凝胶电泳条带III型限制性切酶类兼限制修饰两种功酶识序列外附切开DNA链求DNA分子中存两反识序列完成切割类酶少产生完全切割片段I型III型酶特异性强具备实价值基工程
通常说限制酶指II型限制性核酸切酶识序列部附特异切开DNA链切割位点序列知固定产生确定限制性片段凝胶电泳条带II型限制性核酸切酶基工程中广泛应重工具酶
（二）II型限制性核酸切酶作特点
1．识序列碱基数 II型限制性核酸切酶识核苷酸序列4bp6bp8bp例Not I识序列GCGGCCGC EcoR I识序列GAATTC果DNA中碱基序列机排列识4bp限制酶出现识切割位点频率隔256bp(44bp）会出现次类推识6bp8bp出现间隔分46bp48bp段特定DNA言限制酶识序列越短切割位点数越切割产生片段越相反识序列越长切割位点数越少切割产生片段越
2．识序列回文结构 II型限制性核酸切酶识核苷酸序列具回文结构(palindrome)称二元旋转称结构反重复序列指两条核苷酸链中5′→3′方核苷酸序列致EcoR I识序列两条核苷酸链中5′→3′方5＇GAATTC3＇
3．切割产生粘性末端端 限制酶切割双链DNA方式相数酶交错切开DNA产生带5＇3＇单链突出末端称粘性末端(sticky end)
EcoRI切割DNA产生5＇粘性末端：
→
5＇G↓AATTC3＇
3＇CTTAA↑G5＇
5＇G
3＇CTTAA
AATTC3＇
G5＇
+
部分限制性核酸切酶切开DNA产生5＇3＇端齐末端称端(blund end)钝端Sam I切割产生端：
→
5＇CCC↓GGG3＇
3＇GGG↑CCC5＇
5＇CCC
3＇GGG
GGG3＇
CCC5＇
+
（三）异源工酶尾酶
1．异源工酶 限制酶源识切割序列称异源工酶（isoschizomers）裂酶Bst IBamH I识序列相位点切割 (G↓GATCC)产生相粘性末端
2．尾酶 限制酶识序列切割DNA序列产生相粘性末端称尾酶（isoaudamers)BamH I(G↓GATCC)Sau3AI(N↓GATCN）产生相粘性末端称配伍末端（compatible end)配伍末端相互进行连接连接序列原先酶识切割
（四）影响限制性核酸切酶作素
影响限制性切酶作素包括DNA纯度结构DNA甲基化程度缓液反应温度作时间等酶单位数切割线性DNA标准规定消化类型DNA时应根DNA分子形状等适增加减少需酶量
1．DNA纯度结构 DNA样品中残留蛋白质RNA机溶剂等杂质高分子量DNA超螺旋DNA均会降低切酶消化效率
2．DNA甲基化 限制性核酸切酶识切割DNA序列甲基化识切割DNA序列中甲基化程度位置均会影响限制性核酸切酶作
3．反应缓液 限制性核酸切酶反应缓液成分包括TriHCl氯化镁氯化钠氯化钾β巯基乙醇二硫苏糖醇牛血清白蛋白甘油等限制性切酶缓液盐浓度求相般配制低盐（10mmolL NaCl)中盐（50mmolL NaCl）高盐（100mmolL NaCl）3种缓液满足酶消化反应两种酶消化DNA时种酶需盐浓度相消化时进行需盐浓度相必须先低盐浓度限制性切酶消化调整高盐缓系统加入高盐浓度限制性切酶继续消化限制性切酶消化反应中甘油浓度超5％（VV）会抑制切酶作20μl反应体系中甘油浓度应少1μl
4．反应温度时间 限制性切酶适温度数酶适反应温度37℃例外Sma I25℃Bcl I50℃反应时间根酶底物量加调整时间太长酶产生非特异性切割太短消化完全
5．限制性核酸切酶纯度量 酶纯度酶量酶切反应定影响
二T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）单链肽分子量68kD催化双链DNA3＇羟基双链DNA5＇磷酸基团形成3＇5＇磷酸二酯键具相黏性末端端DNA片段连接起
三DNA聚合酶I
DNA聚合酶I（DNA polymerase I）第肠杆菌中发现DNA聚合酶单条肽链构成分子量109kD该酶具三种酶活性：5＇→3＇DNA聚合酶活性5＇→3＇核酸外切酶活性3＇→5＇核酸外切酶活性DNA探针缺口移标记3＇粘性末端标记等
DNA聚合酶I枯草杆菌蛋白酶裂解产生片段称klenow片段（klenow fragment）保留5＇→3＇DNA聚合酶活性3＇→5＇核酸外切酶活性Klenow片段：① 补齐双链DNA3＇末端② 补齐时3＇末端进行标记③ 合成cDNA第二条链④ DNA序列测定
四反转录酶
反转录酶（reverse transcriptase）催化RNA模板合成cDNA反应合成方5＇→3＇反转录酶缺乏3＇→5＇核酸外切酶活性具RNaseH活性5＇3＇末端特异降解RNADNA杂交分子RNA链构建cDNA文库反转录PCR等技术中关键工具酶
五末端转移酶
末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferaseTdT）称末端脱氧核苷酰转移酶二价阳离子存末端转移酶需引物催化dNTP5＇→3＇方逐加DNA分子3＇羟基末端该酶种非特异性酶4种dNTP中种均作底物DNA 3＇末端标记聚尾加尾制备便重组连接工粘性末端者载体克隆片段形成聚物尾便进行基克隆
六碱性磷酸酶
碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）DNARNA链5＇末端磷酸基团载体目DNA重组程中碱性磷酸酶水解载体5＇端磷酸基团防止身连接环化提高重组效率DNARNA片段进行5＇端标记前需该酶处理常碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）牛肠碱性磷酸酶（CIP）两种CIP1 SDS溶液中68℃加热15分钟失活较常
七工具酶
基工程中常会工具酶例TaqDNA聚合酶耐高温DNA聚合酶核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶T4聚核苷酸激酶等
第二节 基工程载体
目DNA片段具备复制力导入宿细胞宿细胞增殖复制表达达外源DNA片段扩增目目DNA必须助载体DNA分子进入宿细胞进行复制表达载体（vector）携带外源目DNA进入宿细胞进行扩增表达类DNA分子数载体环状双链DNA少数线性目DNA片段载体体外连接构成重组分子然导入宿细胞进行扩增表达
载体功分克隆载体（cloning vector）表达载体（expressing vector）前者克隆扩增外源DNA片段者表达外源基载体兼备克隆表达两种功
理想载体必须具备条件：① 包含复制起始点宿细胞独立进行复制② 易宿细胞中分离提纯③ 具备筛选标记利筛选克隆重组子④ 包含限制酶切点克隆位点（multiplecloningsiteMCS)便目基插入⑤ 具较高遗传稳定性
肠杆菌宿细胞载体：质粒λ噬菌体粘粒M13噬菌体年发展系列新载体系统细菌中扩增真核细胞中表达着基治疗研究深入构建系列病毒载体系统
常克隆载体
（）肠杆菌克隆载体
肠杆菌宿细胞载体质粒λ噬菌体粘粒
1．质粒 质粒（plasmid）常克隆载体独立存细菌染色体外复制闭合环状双链DNA分子天然质粒通常缺乏高质量克隆载体必须元件需通工构建应基工程中质粒般具特征：① 分子相较2～200kb等细菌稳定存② 具松弛型复制子③ 具遗传标志便宿细胞进行选择例抗生素抗性基AmprTetr等④ 具限制性切酶切点便外源基插入⑤ 较高拷贝数
(1) pBR322质粒 pBR322质粒较早构建种质粒载体分子相较仅4363bp具氨苄青霉素抗性（Ampr）四环素抗性（Tetr）两基许重单限制酶位点密集AmprTetr区便外源DNA插入筛选见图91
图91 pBR322质粒物理图谱
（2）pUC系列质粒 pUC系列质粒pBR322质粒载体基础改造成长度约27kb包含氨苄青霉素抗性基（Ampr）肠杆菌β半乳糖苷酶基（lacZ基）α片段lacZ基α片段编码β半乳糖苷酶N端氨基酸序列（146氨基酸残基）Puc质粒结构见图92
图92 Puc18质粒物理图谱
（3）穿梭质粒 穿梭质粒(shuttle plasmid)工构建具两种复制起点筛选标记两种种属受体细胞中存活复制质粒克隆类载体外源基必更换载体直接种受体细胞转入种受体细胞中复制遗传例肠杆菌酵母菌穿梭质粒（YEp13)肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒（pBE2）肠杆菌动物细胞穿梭质粒（pBPVBV1）肠杆菌植物细胞穿梭质粒（Ti质粒）等穿梭质粒仅肠杆菌中复制扩增相应枯草杆菌酵母动物植物细胞中扩增表达数真核载体构建成穿梭质粒肠杆菌酵母菌穿梭质粒YEp13结构中包含pBR322完整序列2μm质粒复制起点酵母选择基LEU2等
质粒般容纳10kb外源DNA片段做亚克隆载体般说外源DNA片段越长越难插入越稳定转化效率越低
2．噬菌体载体 噬菌体（bacteriophagephage）类感染细菌病毒常作克隆载体噬菌体λ噬菌体M13噬菌体两种两者基结构生物学性状途
（1) λ噬菌体载体 野生型λ噬菌体DNA种双链线性DNA分子全长485kb两端带条12碱基组成互补5＇单链粘性末端λ噬菌体肠杆菌中繁殖需序列左右两臂中间约40％区域病毒生活必需λ噬菌体感染肠杆菌线性DNA分子助两端粘性末端互补配形成环状分子连接区域称cos位点(cohesiveendsite)噬菌体包装必需序列含外源DNA重组λDNA野生型λDNA长度75％~105％时体外包装成噬菌体颗粒λ噬菌体载体体外包装见图93
图93 λ噬菌体载体体外包装示意图
野生型λ噬菌体改造已衍生出百种克隆载体分两类：① 插入型载体插入型载体（insertionvectors）般限制性酶切位点供外源DNA插入容许10kbDNA插入通常构建cDNA文库片段DNA克隆λgtl0λgtl1目前应较广插入型载体克隆7kb外源DNA片段λgtl0433Kb含CI基（λ阻遏蛋白基）外源基插入CI基失活肠杆菌形成透明噬菌斑未重组λgt10形成透明斑点λgt ll437Kb含β半乳糖苷酶基α片段（lacZ＇基）外源基插入失活含Xgal培养基产生白色噬菌斑未重组λgt11形成蓝色斑点容易区分重组子非重组子②置换型载体置换型载体（replacement vector）限制性酶切位点酶切两位点间kDNA区段入噬菌体非必需区外源DNA插入取代承受较（9 Kb ~23Kb)外源DNA片段插入适克隆真核生物染色体DNA真核生物基组文库构建目前常EMBL系列Charon系列等噬菌体置换型载体EMBL4结构见图94
图94 EMBL4置换型载体
（2）M13噬菌体载体 载体M13噬菌体种丝状噬菌体感染含F子肠肝菌基组单链闭环DNA分子长度约64kbM13噬菌体感染肠杆菌细菌体单链DNA正链复制出互补负链DNA形成双链环状DNA称复制型(RF)M13DNA感染细胞累计100—200RF DNA时特殊蛋白质参时DNA合成产生子代正链DNA出芽形式释放出新带正链DNA噬菌体颗粒复制型M13DNA作克隆载体M13噬菌体优点细菌释放出颗粒中含单链DNA克隆互补双链中条源该单链作模板进行DNA序列分析作标记探针杂交分析作体外诱变模板受Ml3噬菌体感染细菌生长受定抑制细菌培养基会形成浑浊噬菌斑
野生型M13DNA常限制酶酶切位点需构建DNAIV基II基间插入段lacZ’基包含lacZ调控序列编码β半乳糖苷酶N端146氨基酸DNA序列lacZ’基中插入克隆位点Mp系列克隆载体M13衍生物常见M13mp18M13mp19等二者区仅lacZ’基部克隆位点序恰相反含lacZ’基载体进行DNA重组利否产生蓝白色噬菌斑菌落）进行筛选
3．粘性质粒 粘性质粒(cosmid) 称粘粒种克隆片段DNA设计构建杂合载体质粒DNAλDNAcos位点序列构建成具质粒入噬菌体DNA载体双重性质环状双链DNA载体
粘粒特点表现方面：① 含质粒复制起始点限制酶切点抗药性标记重组粘粒体外包装成病毒颗粒感染肠杆菌质粒复制方式进行扩增② 含λ噬菌体DNA粘性末端（cos位点序列）克隆较长外源DNA(长达40Kb～50kb)体外包装成噬菌体颗粒③ 身分子较kb没插入外源DNA非重组粘粒体外包装利筛选
（二）酵母克隆载体
酵母载体数细菌质粒DNA酵母DNA构造成穿梭质粒目前常酵母克隆载体酵母整合质粒酵母复制质粒酵母附加质粒酵母工染色体等
1．酵母整合质粒 酵母整合质粒（yeast integrative plasmidYIp）肠杆菌质粒pBR322基础插入酵母标记基（URA3LEU2等）含酵母复制起点YIp质粒样复制扩增般单拷贝形式存细胞中产生稳定重组子转化率极低
2．酵母复制质粒 酵母复制质粒（yeast replicating plasmidYRp）段包括复制起始位点（ARS）酵母基（TRP等）酵母染色体DNApBR322组成进行复制独立YRp转化率极高细胞中高拷贝数重组子非常稳定分配均匀母细胞中聚集量重组分子子代中造成拷贝数减少丢失
3．酵母附加质粒 酵母附加质粒（yeast episomal plasmidYEP）含2μm质粒载体YEP含完整2μm质粒含2μm质粒复制起点标记基转化频率细胞中拷贝数稳定性YRp相似
4．酵母工染色体 酵母工染色体（yeast artificial chromosomeYAC）利酵母染色体DNA细菌质粒pBR322改造成DNA分子具备着丝粒（centromereCEN）两端粒（telomereTEL)复制序列（ARS）选择标记（TRP1URA3）肠杆菌复制起点Ampr 基限制酶酶切位点等序列YAC装载容量插入05Mb～2Mb外源DNA片段片段DNA克隆代λ噬菌体载体粘粒载体构建文库类基组计划采该载体构建物理图谱
pYAC3pBR322基础插入酵母基构建成长114kb插入酵母基包含URA3TRP1SUP4标记基复制起点克隆时外源DNA插入SUP4基失活重组YAC导入trplura3双营养缺陷受体酵母菌缺乏色氨酸尿嘧啶培养基长出白色克隆非重组子长出红色克隆容易判断载体中否插入外源基
（三）病毒载体外源DNA带入哺乳动物细胞
年类遗传病恶性肿瘤基治疗研究中常常采逆转录病毒腺病毒腺相关病毒EB病毒等作基转移载体外源基导入受体细胞达纠正遗传缺陷杀死肿瘤细胞目数病毒载体均质粒化病毒载体质粒病毒启动子包装元件选择性遗传标记pBR322复制起始点组成
二常表达载体
表达载体宿细胞中表达（转录翻译）外源基载体DNA该类载体仅具复制起点选择标记克隆位点等克隆载体具备性质包含转录翻译必需DNA序列启动子转录终止序列核糖体结合位点等根受体细胞表达载体分原核表达载体真核表达载体两类
（）原核表达载体
1．原核表达载体结构 典型肠杆菌表达载体例原核表达载体具结构特点：含复制起点克隆位点筛选标记基具核糖体结合位点具强启动子强终止子肠杆菌表达载体常启动子tac启动子lacUV5启动子λ噬菌体PL启动子T7噬菌体启动子等肠杆菌表达载体结构模式见图95
图95肠杆菌表达载体结构模式图
2．原核表达载体分类 原核表达载体功分三类：① 融合蛋白表达载体：目基连接载体启动子原核结构基游载体结构基启动子目基载体结构基融合形式表达通常构建质粒载体原核蛋白包括谷胱甘肽巯基转移酶（GST）分泌蛋白A等pGEX4T1种常见融合表达质粒载体含lacIAmprpBR322复制起点oritac启动子段融合蛋白GST基序列紧接克隆位点便外源目基插入② 非融合型表达载体：该载体表达出外源蛋白N端含原核生物肽段外源基插入载体原核启动子核糖体结合位点游翻译起始位点ATG位外源基片段5＇端样原核宿中表达出非融合蛋白pKK2233载体种非融合型表达载体③ 分泌型表达载体：该载体表达出外源蛋白N端原核信号肽连接起宿菌分泌细胞周质培养基中
（二）真核表达载体
真核表达载体通常含选择标记复制起始位点启动子转录终止序列poly（A）加尾信号克隆位点真核表达载体数穿梭载体两套复制起点选择标记分原核真核细胞中起作常见真核表达载体酵母表达载体哺乳动物细胞表达载体
1．酵母表达载体 酵母表达载体数穿梭质粒酵母肠杆菌中均进行复制扩增通常含复制起始序列启动子筛选标记分泌信号终止子丝分裂稳定区外源基克隆位点
酵母作酵母表达载体宿许优越性：① 作单细胞生物操作生产相简单成低廉② 具蛋白质翻译加工修饰系统表达外源蛋白分泌培养基中便纯化③ 具MOX（Methanol Oxidase)AOX（Alcohol Oxidase)lac4等强启动子
2．哺乳动物细胞表达载体 原核启动子哺乳动物细胞中发挥作动物病毒载体启动子类巨细胞病毒（CMV）启动子Rouse肉瘤病毒基组长末端重复序列（RSV）中启动子等宿范围较广种受体细胞中定活性目前构建许哺乳动物细胞基表达载体源动物病毒基腺病毒载体反转录病毒载体空泡病毒载体（SV40）牛乳头瘤病毒载体等病毒载体相高效安全稳定外源基携带进入宿细胞实现表达
工构建哺乳动物细胞载体应具备条件：① 含原核复制起始位点抗生素抗性基利外源基片段克隆筛选② 具备真核细胞筛选标记基常标记基：胸苷激酶基（thymidinekinaseTK）二氢叶酸原酶基（dihydrofolatereductaseDHFR)氯霉素乙酰转移酶基（chloramphemcolacetyltransferaseCAT)新霉素抗性基（neomycinresistanceNEO）等③ 含转录终止信号polyA加尾信号④ 具哺乳动物细胞启动子增强子 ⑤ 含选择剪切信号⑥ 含限制酶单酶切位点便真核基插入
第三节 基工程基原理步骤
基工程基步骤包括：① 目基获取② 载体选择构建③目基载体连接形成DNA重组体④ DNA重组体导入宿细胞⑤ DNA重组体筛选鉴定⑥ DNA重组体扩增表达基工程基步骤见图96
图96基工程基步骤
目基获取
1．基组DNA文库获取 基组文库(genomic library）指含机体细胞基组DNA全套重组DNA分子集合基组文库中筛选目基通核酸分子杂交方法进行放射性核素标记已知序列DNA片段者基组文库中克隆进行杂交放射显影筛选出阳性克隆获目基
2．cDNA文库获取 cDNA文库（cDNAlibrary）提取组织细胞总mRNA反转录酶催化合成双链cDNA（complementaryDNAcDNA）适载体连接转入受体细胞构建成cDNA文库中获取目基方法DNA文库中获取方法相外 cDNA文库中获取利特异性抗体特异性结合蛋白筛选目基
3．PCR法获取 利PCR直接基组DNAcDNA模板高效快速扩增出目基前提必须知道目基5＇3＇端段核苷酸序列设计合成适引物获特定目基
4．化学工合成法获取 果目基序列已知根蛋白质产物氨基酸序列推导出基核苷酸序列利DNA合成仪通化学方法合成目DNA法适合成较DNA片段（100bp左右）较长链分段合成然连接酶定序加连接
二载体选择构建
目基必须合适载体携带进入宿细胞进行复制表达选择合适载体基工程目操作基性质时考虑载体中否合适限制性酶切位点种常克隆载体性质途见表92
表92 常克隆载体性质途
载体
插入目DNA
受体细胞
质粒
<10kb
细菌酵母
λ噬菌体
<20kb
细菌
粘粒
<50kb
细菌
BAC
<400kb
细菌
YAC
<3Mb
酵母
选种载体首先获载体分子分离纯化入噬菌体DNA制备粘性质粒关质粒DNA获载体DNA采适限制性核酸切酶载体DNA进行切割质粒粘性质粒M13噬菌体复制型DNA分子酶切单线性分子λ噬菌体DNA获左臂右臂两线性分子获线性DNA分子碱性磷酸酶处理掉5＇端磷酸便目基片段进行连接
三目基载体连接
途径获目基构建载体分限制性核酸切酶消化DNA连接酶催化两DNA片段体外连接形成重组DNA分子体外连接方式四种：
（）粘性末端连接
目DNA载体DNA种限制酶切割产生相粘性末端限制酶切割形成互补黏性末端（配伍末端）两者起退火时粘性末端单链间进行碱基配然DNA连接酶连接末端缺口成环状重组DNA分子种方法适合DNA片段连接种限制酶处理载体两端碱基序列互补发生身环化形成空白载体降低重组效率目基筛选带困难避免方法碱性磷酸酶处理酶切载体防止环化
（二）工接头连接
工接头（linker）指工设计合成含限制酶识位点段双链脱氧核苷酸片段末端DNA先工接头连接产生新限制性酶切位点切割粘性末端连接方式进行连接
（三）末端连接
DNA限制酶切割产生末端粘性末端特殊酶处理突出末端削补齐变端均T4 DNA连接酶催化连接端连接效率远低粘性末端连接避免载体DNA身环化目基插入载体会出现正反两种方性种连接方法适合DNA片段连接提高连接效率连接样DNA片段时适提高连接反应中ATPT4 DNA连接酶浓度
（四）聚物加尾连接
加入聚物（homopolymer)尾处理易连接DNA片段种效方法基克隆中应十分广泛目DNA核酸外切酶消化产生3＇粘性末端限制酶（Pst I）消化产生具3＇羟基单链末端暴露出3＇羟基末端末端转移酶催化某种单脱氧核苷酸底物逐加3＇羟基末端形成相应脱氧核苷酸聚物尾（聚G)载体DNA加目DNA聚物尾互补脱氧核苷酸聚物尾（聚C）两者混合两种DNA分子通互补聚物尾互补配形成氢键末端间空隙导入宿菌DNA聚合酶I行修复连接
四重组DNA导入受体细胞
重组DNA分子必须导入宿细胞进行复制表达扩增宿细胞称受体细胞分原核细胞真核细胞两类原核细胞包括肠杆菌枯草杆菌链球菌等中肠杆菌常真核细胞包括酵母植物细胞哺乳动物细胞昆虫细胞
重组DNA导入宿细胞方式转化感染转染转化(transformation)质粒DNA载体构建重组DNA导入受体细胞获新表型程常宿菌肠杆菌转染(transfection)指表达载体导入真核细胞程感染噬菌体病毒载体重组DNA分子体外包装成具感染力噬菌体病毒颗粒然感染适宿细胞重组DNA导入宿细胞
作基工程宿细胞应具备特征：① 安全性高感染寄生缺陷原核细胞常肠杆菌K12改造安全宿菌肠道存活率存活率极低② 易转化③ 限制—修饰系统缺陷型重组DNA导入宿细胞（肠杆菌）宿限制酶消化遭破坏须选R(restriction negative)菌株④ 重组缺陷型避免重组DNA发宿染色体DNA发生重组应选择Rec（recombination negative)菌株⑤ 遗传表型具互补功便转化细胞筛选量选择目基功缺陷宿细胞
（） 转化法
氯化钙转化法处数生长期肠杆菌悬浮冰冷氯化钙低渗溶液中细胞发生膨胀细胞膜磷脂层形成液晶结构解离细胞外膜膜间部分核酸酶促细胞成具摄取外源DNA力细胞感受态细胞(competent cell)Ca2+DNA分子结合成抗DNA酶羟基—磷酸钙复合物粘附细胞膜表面42℃热休克处理1分钟细胞膜液晶结构发生改变通透性增加形成间隙外源DNA进入细胞
（二）转染法
转染转化感染两单词构成新词指真核细胞动摄取导入外源DNA片段获新遗传表型程常方法电穿孔法磷酸钙沉淀法脂质体融合法等进入宿细胞DNA整合宿细胞基组中宿细胞染色体外存表达
1．脂质体转染法 阳离子脂质体(cationicliposome)中性磷脂阳离子脂质组成种磷脂双分子层膜性结构利脂质体外源基导入真核细胞种常简单快速基导入方法原理阳离子脂质体试剂DNA混合形成种稳定脂质双层复合物DNA包裹脂质体中间种脂质双层复合物直接加培养细胞中脂质体粘附细胞表面细胞膜融合DNA释放胞质中进入细胞基细胞中酶作进行表达整合脂质体转染法宿细胞损伤转移效率高种温基转移方法适种类型核酸分子导入培养细胞
种新型脂质体Lipofection阳离子脂质（DOTMA）中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）合成作机制传统脂质体非核酸包入脂质体囊阳离子脂质体通静电引力作带负电荷DNA发形成DNA脂质体复合物净电荷正复合物容易吸附带负电荷细胞膜表面细胞融合通细胞吞作进入胞法适DNA转染入悬浮贴壁培养细胞转染时需加入血清抗生素瞬时转染稳定转染转染效率高稳定性年广泛DNARNA蛋白质导入活细胞
2．DNA磷酸钙转染法 转化DNA氯化钙磷酸缓液混合形成包含DNA微磷酸钙颗粒磷酸钙DNA复合物粘附细胞膜表面细胞通胞饮作摄入外源DNA法DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达长期转化研究转化效率较低
3．电穿孔法 电穿孔法（electroporation）通短暂高压脉电场细胞膜产生瞬时逆性微孔通道重组DNA分子导入细胞方法法转化效率受细胞状态电压（022kV)电容（251000μF）DNA浓度脉时间（055毫秒）等素影响适悬浮培养细胞肠杆菌转化操作稳定性较基工程中应普遍
4．显微注射法 制备转基动物时外源基通毛细玻璃显微镜直接注射受精卵细胞核种基转染方法称显微注射法（microinjection)
外DEAE葡聚糖转染法等种转染方法
（三）感染法
法模拟病毒感染细胞生物程病毒DNA载体外源基直接转染特定受体细胞该方法具定性导入效率高等优点例重组λ噬菌体DNA体外包装成完整噬菌体然感染肠杆菌重组DNA导入细胞具感染力噬菌体颗粒包装方法重组λDNA含量噬菌体尾部蛋白λ噬菌体突变株宿溶菌物含量噬菌体头部蛋白突变株Dam宿溶菌物混合包装成具感染力噬菌体颗粒
重组反转录病毒载体体外包装需辅助细胞（ϕ2细胞）参ϕ2细胞表达反转录病毒全部基产物缺乏包装位点（ϕ位点）包装病毒RNA产生新辅助病毒颗粒果重组反转录病毒载体感染ϕ2细胞RNA中含位点ϕ2细胞提供蛋白质包装成新反转录病毒感染宿细胞反转录双链DNA整合入宿基组中
种感染方法目前较常包装逆转录病毒直接感染宿细胞进行逆转录整合入宿细胞基组表达外源基
利述种种方法外源基导入真核宿细胞极少数细胞外源基整合基组稳定表达便鉴定稳定转染细胞株常选择标记基目基连接重组载体进行转染表达特定选择标记基重组体够筛选鉴定出
五重组体筛选鉴定
筛选（screening）转化细胞群中鉴出真正含目基转化子外源基导入宿细胞首务筛选含目基阳性克隆加扩增筛选方法遗传学方法免疫学方法核酸杂交法PCR等
（）抗生素抗性筛选
利克隆载体携带某种抗生素抗性基种抗生素抗性基应受体菌细胞缺陷性基含种完整抗性基转化菌含该抗生素培养基生存形成菌落非转化菌杀死种遗传学选择方法数目庞细胞群体中筛选特定细胞效方法
质粒带两种抗生素抗性基外源DNA插入中抗性基中时该基会失活重组质粒转化细菌含该抗生素培养基生长含外种抗生素培养基中生长非重组质粒含两种抗生素培养基均生长法常区分质粒重组体非重组体
（二）蓝白筛选
蓝白筛选称α互补筛选筛选法功互补筛选带β半乳糖苷酶N端长146氨基酸α片段载体带β半乳糖苷酶C端序列（ω片段）受体细胞互补单独存β半乳糖苷酶α片段ω片段均β半乳糖苷酶活性二者存时产生β半乳糖苷酶酶活性IPTG诱导色工底物Xgal水解生成蓝色产物形成蓝色菌落（噬菌斑）β半乳糖苷酶活性菌落（噬菌斑）呈现白色种筛选方法称蓝白筛选
含LacZ’基（α片段）载体（PUC系列质粒λgt11等）筛选鉴定载体中LacZ’基编码产物β半乳糖苷酶α片段转化表达β半乳糖苷酶ω片段宿菌（突变型lacEcoli）果外源基插入LacZ’基克隆位点LacZ’基失活产生α片段丧失α互补力菌落（噬菌斑）呈现白色克隆位点没成功插入目基载体转化表达β半乳糖苷酶ω片段宿菌生长菌落（噬菌斑）成蓝色载体时具抗生素抗性基没成功转化载体受体菌生长种颜色标志重组克隆非重组克隆区分目然
（三）核酸杂交筛选
核酸杂交筛选直接针克隆目基筛选常杂交方法菌落原位杂交Southern杂交菌落原位杂交先硝酸纤维膜尼龙膜覆盖生长琼脂板菌落噬菌斑定位轻轻揭起膜样部分细菌噬菌体吸附膜处理膜DNA变性烘干固定然DNARNA探针杂交X光片曝光筛选找阳性菌落进行克隆表达培养Southern杂交筛选程培养菌落噬菌斑中提取重组DNA琼脂糖凝胶电泳分离进行变性转膜然探针进行杂交筛选出阳性克隆进步进行培养扩增
（四）限制酶酶切图谱筛选
常规方法提取重组DNA直接进行琼脂糖凝胶电泳果插入载体目基片段较重组体迁移率明显载体直接筛选阳性克隆明确区分迁移率重组体选择适限制性酶进行酶切切出目基片段克隆琼脂糖凝胶电泳图谱中观察目基条带阳性克隆
（五）PCR筛选
根目基两端序列设计引物克隆DNA模板进行PCR扩增扩增出量目基克隆阳性克隆PCR阳性克隆筛选十分效需提取DNA分子进行筛选
（六）DNA序列分析筛选
直接培养克隆DNA进行序列分析含目基序列克隆阳性克隆时筛选方法鉴定出阳性克隆终插入目基进行序列分析进步验证准确性
（七）免疫学方法筛选
免疫学方法应特异性抗体目基表达产物相互作进行筛选属间接选择法果克隆基表达产物已知菌落噬菌斑中表达免疫法特异性强灵敏度高相应抗血清单克隆抗体通放射免疫化学发光显色反应进行筛选适筛选宿菌提供标志基
六重组体表达
基工程目获量目基表达产物—蛋白质目基正确位置方表达载体连接然导入相应宿细胞培养含重组体宿细胞目基表达蛋白表达体系原核表达体系真核表达体系
（）原核表达体系
肠杆菌前采原核表达体系外源基插入原核启动子游肠杆菌RNA聚合酶识该启动子外源基转录出mRNA进翻译成蛋白质
原核表达体系中表达目基需具备特点：① 含子肠杆菌缺乏真核转录加工系统剪切含子表达真核cDNA表达基组DNA② 强启动子翻译调控序列表达载体具调控转录产生量mRNA强启动子（tacPLT7等）翻译调控序列（翻译起始位点SD序列等）③ 正确阅读框架外源基插入表达载体必须形成正确阅读框架正确编码蛋白质④ 含信号肽等相应DNA序列肠杆菌缺乏真核细胞特蛋白质翻译加工修饰体系糖基化磷酸化信号肽剪切等编码分泌性蛋白真核基必须删信号肽编码序列
外目基插入载体DNA位置宿选择表达蛋白稳定性具重作表达外源蛋白够稳定易细菌蛋白酶降解通表达融合蛋白方式选缺乏相应蛋白酶宿菌提高稳定性
融合蛋白指表达蛋白质肽链N端原核基特殊DNA序列编码肽段（融合标签）C端真核外源DNA编码常融合标签包括GST6His标签GFP等融合蛋白方便表达产物分离纯化般常常利生物分子特异性相互作选择合适亲层析分离融合蛋白特异性相互作常见酶底物诱导契合受体配体间相互作抗原抗体间特异性结合作方式（Ni2+6His标签结合）等果设计融合基时目基融合标签序列间加入适裂解位点融合蛋白化学处理（CNBr)特异蛋白酶（凝血子X胶原酶肠激酶等）水解容易目蛋白融合蛋白中释放出
原核表达体系融合蛋白表达优点：① 融合蛋白较稳定易细菌蛋白酶水解② 果载体携带肠杆菌结构基片段编码段信号肽产生分泌型产物③ 利针融合蛋白中原核部分单抗进行亲层析便纯化④ 原核蛋白部分蛋白酶切掉释放出天然真核蛋白质
选择适受体菌株诱导条件选择提高原核表达体系表达效率非常重特定蛋白质说菌株中获相表达效率时需试种菌株选择种菌株
表达产物检测鉴定方法：① SDSPAGE电泳鉴定转化菌诱导表达提取菌体蛋白SDSPAGE电泳染色脱色观察否出现目蛋白相应蛋白条带② Western杂交鉴定果SDSPAGE初步证实存目蛋白条带进步鉴定特异性常常利特异结合抗体进行蛋白质杂交③ 蛋白质生物活性测定 蛋白质生物活性测定判断外源基否表达力证④ 蛋白质序列分析 目蛋白进行氨基酸序列分析获准确终结果
（二）真核表达体系
结构复杂蛋白质原核细胞中正确折叠修饰具生物学活性目基真核基组DNA时必须采真核表达体系克隆基哺乳动物细胞中进行表达必须先基插入适真核表达载体中首先重组表达载体肠杆菌中进行扩增肠杆菌中提取纯化重组表达载体然导入真核表达体系进行表达
哺乳动物细胞中表达基基组DNAcDNA质粒载体DNA脂质体介导电穿孔技术DEAE葡聚糖磷酸钙沉淀等方法直接导入宿细胞病毒载体DNA须先进行病毒颗粒包装获假病毒颗粒感染受体细胞终筛选出转染细胞持续培养便清中表达产物转染细胞培养中持续添加抗生素逐渐加药物浓度增加选择压力样提高阳性克隆拷贝数提高表达效率
表达系统相哺乳动物表达系统优势够指导蛋白质正确折叠提供复杂准确糖基化等种翻译加工功表达产物分子结构理化性质生物学活性方面接天然高等生物蛋白质目前采受体细胞COS细胞（猿猴肾细胞）CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）COS细胞源SV40病毒转化非洲绿猴肾细胞中COS7常细胞系组成性表达SV40T抗原带SV40复制起始位点转染质粒够高拷贝数进行复制进行外源基瞬时表达时途广宿COS7般病毒转染研究细胞基转录研究CHO细胞利外源基目稳定整合易规模培养血清蛋白条件生长真核生物基表达较成功宿细胞
酵母简单真核生物具遗传背景清楚操作简单易发酵成低廉等特点哺乳动物细胞样表达蛋白进行折叠翻译修饰种酵母菌株表达分析真核蛋白非常哺乳动物细胞相酵母表达系统易操作价格便宜酵母表达系统适规模表达重组真核蛋白理想工具
昆虫表达系统理想重组真核蛋白表达系统昆虫高等真核生物哺乳动物类似进行翻译加工修饰昆虫细胞生长速度快培养条件简单易悬浮培养基工程中规模表达蛋白质两类：果蝇表达系统杆状病毒表达系统
知识拓展
电子克隆体系
电子克隆（insilicocloning)基克隆效辅助手段着类基组计划种模式生物全基组测序完成基数库断完善种计算机分析软件开发互联网广泛应生物信息学已成非常重种研究方法通基数库进行序列搜索分析拼接整合预测新假定全长基然通分子生物学实验方法加证实相应组织细胞中获种基电子克隆
进行基克隆时传统基克隆方法相电子克隆加快新基发现速度提高工作效率提供种基存性种基数库目前日趋十分完善囊括量基信息数库种分析预测软件辅助成新型技术方法
第四节 基工程应
着基工程诞生技术发展目前基工程已成生物科学核心技术已广泛应医药卫生农牧业等众领域取巨成
基定点诱变
工业生产常常希酶具更长半衰期更高稳定性够适应更广酸碱度范围床医学方面希蛋白质肽药物疗效更高副作更代谢半衰期更长显然天然蛋白质完全满足述种需需然界存蛋白质进行改造进步分析功者通基改变修饰改造某已知蛋白质研究蛋白质结构功关系蛋白质分子间相互作基工程重手段例现已发展起种体体外基诱变方法中具重意义Michael smith1982年发明寡核苷酸介导定点诱变技术简称定点诱变技术site directed mutagenesis)利分子生物学技术体外通核苷酸取代插入删基DNA序列中（）特定核苷酸发生改变技术
基工程定点诱变基原理：① 首先制备单链模板利体外DNA重组技术诱变目基插入复制型双链M13噬菌体载体转化细菌制备含目基M13单链DNA作诱变模板② 根需设计合成带诱变核苷酸序列寡核苷酸引物带目DNA单链M13模板进行杂交③ 加入DNA聚合酶4种脱氧核糖核苷酸杂交寡核苷酸引物延伸④ DNA连接酶新合成异源双链DNA连接成闭合环状分子⑤ 转化宿细菌断复制获诱变DNA分子⑥ 筛选带诱变DNA重组噬菌体提取单链DNA进行序列分析⑦ 重组噬菌体中提取含诱变DNA复制型DNA进步诱变DNA进行研究扩增
二基诊断基治疗
基诊断基水检验基存状态缺陷疾病作出诊断方法特定DNA片段制成探针利DNA分子杂交原理鉴定检测标遗传信息达检测疾病目目前已利基工程技术发现种类疾病（包括遗传病恶性肿瘤感染性疾病等）致病基疾病诊断治疗提供坚实理基础
基治疗20世纪80年代发展起预防治疗疾病具革命性生物医学医疗技术原理动物正常基治疗作基通定方式导入体靶细胞纠正基缺陷发挥治疗作达治疗疾病目
三遗传病预防
疾病基克隆仅遗传病诊断治疗提供力手段更重手段应产前诊断症状前诊断时结合早期预防积极治疗等措施效预防遗传病患出生遗传疾病发生般表型诊断方法胎出生前疾病发生前遗传病进行诊断 基分析技术检测胎异常基遗传病预防效手段
知识拓展
血红蛋白病诊断
基诊断发展程中早采基诊断疾病遗传病发展现仅发病机制清楚已找致病基疾病进行基诊断发生分子机制明遗传性疾病通连锁分析进行基诊断 血红蛋白病苯丙酮尿症杜氏肌营养良症等基诊断典型例子
血红蛋白病血红蛋白结构合成异常致遗传性血液病惯分异常血红蛋白中海贫血两类前者珠蛋白基突变引起珠蛋白肽链结构改变致者珠蛋白肽合成速率降低α链β链合成衡引起称中海贫血
目前较普遍采PCR扩增法检测两基缺失情况基水中海贫血患者进行基型分型应定量RTPCR技术测定β珠蛋白mRNA含量根改变作出诊断该方法仅诊断中海贫血准确诊断β中海贫血杂合子
四基工程制药
许药物生产生物组织中提取获受材料源限制产量限价格昂贵利基工程技术生产应价值药物仅解决产量问题降低生产成世界第种基工程药物美国Lllly公司1982年率先利基工程技术生产市重组胰岛素诞生标志着基工程药物时代基工程生产药物效率高成低品质迄止已开发出数百种基工程药物包括胰岛素干扰素凝血子促红细胞生成素生长激素种单抗预防乙型肝炎伤寒霍乱疟疾疫苗等中部分已投入市场部分处床试验阶段
床应
基工程重组胰岛素
基定点诱变技术应典胰岛素蛋白质工程例基工程重组胰岛素作首基工程产品已1982年投放市场
胰岛素治疗糖尿病特效药物胰岛素分子AB两条肽链组成含51氨基酸残基第测序蛋白质第工合成蛋白质床已种利蛋白质工程制造性优良胰岛素突变体
例种定点诱变制备长效胰岛素胰岛素B链27位Thr改ArgB链羧端氨基化A链21位Asn改Gly血浆中半衰期延长35时胰岛素作定点诱变等电点改变延迟吸收实际延长吸收半衰期种胰岛素类似物已具较床效果天注射次种长效胰岛素天然胰岛素分泌水相
种定点诱变制备胰岛素快速吸收正常生理情况胰岛素体断分泌进餐立引起体胰岛素水升高时达高峰胰岛素调血液中血糖水约3时恢复基础水样维持血液中血糖始终处正常水胰岛素治疗糖尿病时连续断进行注射时皮注射胰岛素时吸收非常慢会导致高血糖35时胰岛素水继续升会导致低血糖状态克服缺点利蛋白质工程方法制备单体胰岛素注射单体胰岛素快速吸收
实际血液中循环胰岛素活性状态胰岛素单体注射胰岛素溶液（103mo1L）中性情况数锌结合六聚体改进注射时胰岛素吸收速度换氨基酸残基例二聚体接触面换具相反电荷残基插入具侧链氨基酸等方法减少六聚体形成样制备出胰岛素类似物吸收速度溶性野生型胰岛素快
五基靶转基
DNA重组基靶技术转基技术重手段目前已迅速广泛应生物学医学基础研究动物育种植物品种改良转基药物等领域研究目前利基工程方法已获转基抗虫棉晚熟保鲜番茄抗寒番茄抗草剂玉米油菜豆品质优良抗病产转基动物等时利外源基哺乳动物体表达获类需种物质激素抗体疫苗等
（张竞文）
题
选择题
A型选择题
1．列项中说明外源目基完成受体细胞中表达（ ）
A．棉花二倍体细胞中检测细菌抗虫基
B．肠杆菌中检测胰岛素基mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测生长激素DNA系列
D． 酵母菌中提取干扰素蛋白
E． PCR技术白血病中检测微量残留癌细胞
2．列关基工程错误（ ）
A．目基受体细胞均动植物微生物
B．限制性核酸切酶DNA连接酶两类常工具酶
C．胰岛素原基肠杆菌中表达胰岛素原生物活性
D．载体抗性基利筛选含重组DNA细胞核促进目基表达
E．目前条件基治疗限体细胞
3． 关PCR说法正确（ ）
A．PCR项生物体外复制特定DNA片段核酸合成技术
B．PCR技术原理DNA双链复制
C．PCR技术获取目基前提段已知目基核苷酸序列 D．PCR扩增中必须解旋酶解开双链DNA
E．PCR发展日新月异衍生PCR技术
4．列关蛋白质工程说法正确（ ）
A．蛋白质工程师分子水蛋白质分子直接进行操作
B．蛋白质工程产生出然界存新型蛋白质分子
C．蛋白质改造通直接改造相应mRNA实现
D．蛋白质工程流程天然蛋白质合成程相
E．蛋白质定性定量分析揭示全基组表达活性
5．列关质粒说法正确（ ）
A．质粒广泛存细菌酵母等种微生物中
B．质粒种双链环状DNA分子
C．具限制性切酶位点
D．质粒便外源基插入
E．质粒具遗传标准宿细胞进行选择
6．列项基克隆需工具酶（ ）
A．DNA聚合酶I B． 逆转录酶 C． 碱性磷酸酶
D． 限制性切酶 E．胰蛋白酶
7．关常克隆载体正确（ ）
A．质粒常载体 B．噬菌体重组携带外源DNA
C．粘性质粒克隆较DNA片段 D．M13噬菌体适合克隆mRNA片段
E．病毒载体常外源DNA带入哺乳动物细胞
8．真核细胞转染方法包括（ ）
A．RTPCR B．电穿孔法 C．脂质体介导法
D．DEAE葡聚糖法 E．显微注射法
9．关cDNA文库 正确（ ）
A．目基cDNA文库中获 B．mRNA模板合成互补DNA
C．特定状态特定细胞全部cDNA克隆 D．必须高质量DNA模板
E．cDNA文库基组文库
10．列项重组DNA筛选鉴定关（ ）
A．采抗性标记筛选细菌克隆 B．采特定抗性基失活进行筛选
C．磷酸钙沉淀法筛选 D．酶切鉴定法 E．DNA测序法
X型选择题
1．目基克隆需载体常载体（ ）
A．质粒 B．噬菌体 C．粘性质粒 D．病毒 E．酵母菌
2．克隆基体外表达系统包括（ ）
A．肠杆菌 B．哺乳动物细胞 C昆虫 D．病毒 E酵母菌
3．基工程步骤包括（ ）
A．制备目基相关载体 B．目基载体连接
C．重组DNA导入受体细胞 D．DNA重组体筛选鉴定 E．DNA重组体扩增
4．做克隆载体噬菌体包括：
A．λ噬菌体 B．肠杆菌 C．M13噬菌体 D．逆转录病毒 E．粘性质粒
5．合适策略DNA片段进行连接（ ）
A．粘性末端适合DNA片段连接 B．工接头处理易连接DNA片段
C．加入聚物尾 D．DNA片段导入感受态细胞
E．端DNA片段连接酶连接
二思考题
1．请举例说明利重组DNA基进行定点诱变改造实例
2．简述基克隆基程步骤
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