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第章 流式细胞仪结构原理

第 1 节 流式细胞术发展史

观历史没门科学技术象流式细胞术样凝结众学术背景
科研领域科学家心血流式细胞术发明改进革新天领域应拓展
步诸生物学生物技术计算机科学流体力学激光技术高等数学床医
学分子生物学机化学生物物理学等学科知识综合运结晶现代流式细胞术更
结合单克隆抗体技术定量细胞化学技术定量荧光细胞化学生物学床
医学药物学等等众研究领域中应更加突飞猛进发展床流式细胞术发展趋
势纳：① 流式细胞仪单纯型仪器发展适应种实际应便携式台式高
分辨率高质量分选研究型流式细胞仪② 流式细胞术检测荧光参数采荧光单
色双色分析发展色分析目前时检测 15 种荧光信号③ 检测参数相
定量发展绝定量④ 检测参数手动工分析发展计算机软件动分析⑤
采荧光试剂非配套试剂发展配套试剂盒试剂切求流式细
胞仪者科研员定断意识学述门学科知识样更
流式细胞术应生物医学床实践基础科学研究工作中

流式细胞术发展简史：
1930 年 Caspersson Thorell 开始致力细胞计数
1934 年 Moldaven 世界早设想细胞检测动化试图光电仪记录流
根毛细细胞数量
1936 年 Caspersson 等引入显微光度术
1940 年 Coons 提出结合荧光素抗体标记细胞特定蛋白
1947 年 Guclcer 运层流湍流原理研制烟雾微粒计数器
1949 年 Wallace Coulter 提出悬液中计数粒子方法获专利
1950 年 Caspersson 显微分光光度计方法紫外线（UV）见光光谱区检测细胞：
1953 年 CroslanndTaylor 应分层鞘流原理成功设计红细胞光学动计数器
1953 年 Parker Horst 描述种全血细胞计数器装置成流式细胞仪雏形
1954 年 Beirne Hutcheon 发明光电粒子计数器
1959 年 B型 Coulter 计数器问世
1965 年 Kamemtsky 等提出两设想分光光计定量细胞成份二结合测量值
细胞分类
1967 年 Kamemtsky Melamed Moldaven 方法基础提出细胞分选方法
1969 年 Van DillaFulwyler 事 Los AlamosNM(现 National Flow
Cytometry Resource Labs)发明第台荧光检测细胞计
1972 年 Herzenberg 研制出细胞分选器改进型够检测出荧光标记抗体染色
细胞较弱荧光信号
1975 年 Kochler Milstein 提出单克隆抗体技术细胞研究中量特异免疫试剂
应奠定基础
量厂家断研制生产出具特色流式细胞仪流式细胞术进入空前飞
速发展时代科学家仪器制造商纷纷流式细胞仪研究焦点转染料开发
细胞制备方法提高电子信号处理力进入 21 世纪流式细胞术作门生 2
物检测技术已日臻完善成分析细胞学领域中代重工具

第 2 节 流式细胞仪结构工作原理

流式细胞仪（Flow cytometry FCM）种集激光技术电子物理技术光电测量技术
电子计算机细胞荧光化学技术单克隆抗体技术体新型高科技仪器概括说
流式细胞术处快速直线流动状态中细胞生物颗粒进行参数快速定量分
析分选技术开始设想第台仪器问世科技工作者进行懈努力着
项相关技术迅速发展FCM 技术已成日益完善细胞分析分选重工具
流式细胞仪分三类：
类台式机床型特点：仪器光路调节系统固定动化程度高操作简
便易学易掌握见图 121

















图 121 床型台式流式细胞仪
（左：BD FACSCalibur—2L4F 右：Coulter EPICS XLXLMCL—1L4F
中：ParteccyFlow—1L3F）

第二类型机科研型特点分辨率高快速感兴趣细胞分选出
单细胞指定数细胞分选特定培养孔培养板时选配种波长
类型激光器适更广泛更灵活科学研究应见图 122123







3











图 122 型科研型流式细胞仪
（左：BDFACSDiVa—14Ffoursorting 右：Coulter EPICS ALTRA—4L8F
中：PartecCyFlow SPACE―2L6F）

第三类新型流式细胞仪着激光技术断发展仪器选 24 根激光检
测十三荧光参数加散射光信号达 15 参数时分析实现高速分选
速度达 50000 秒进行遥控分选够满足种科学研究求






图 123 目前新型流式细胞仪

（左：partecCyFlow ML―FSC2xSSCFL1~FL13右：CoulterCytomicsTM FC 500
左：FACSAriaFSCSSCFL1FL13 右：BDBD LSR4L10F） 4
（） 流式细胞仪结构
FCM 结构般分 5 部分：①流动室液流驱动系统② 激光光源光束成形系统
③ 光学系统④ 信号检测存贮显示分析系统⑤ 细胞分选系统见图 124













图 124 流式细胞仪光路结构
1流动室液流驱动系统
流动室（Flow Chamber Flow Cell）仪器核心部件测样品激光相交流
动室石英玻璃钢制成石英玻璃中央开孔径 430×180µm 长方形孔供细胞
单流检测区该孔中心种流动室光学特性良流速较慢细胞受时
间长收集细胞信号光通量配广角收集透镜获高检测灵敏度测量精
度
流动室充满鞘液鞘液作样品流环包鞘液流种稳定流动操作员
法意改变流动速度样品流鞘液环包形成流体力学聚焦样品流会脱离
液流轴线方保证细胞通激光射区时间相等准确细胞荧光
信息见图 125









图 125 FCM 流动室液流系统

细胞流鞘液流驱动般采加正压方法流速压力关系服 Bernoulli 方程
P(12)PV（勿略高度变化）见压力恒定恒定鞘液流流速
确保细胞流激光射区速度变
图 125 知道真空泵产生压缩空气通鞘液压力调节器加鞘液恒定
压力（压力工厂设定）样鞘液均速运动流流动室整系统运行中流
速变改变样进样速率开关提高采样分析速度提高样 5
流速度改变细胞间距离样品流变宽细胞间距离缩短样单位时间流
光射区细胞数增加
种情况应具体实验中引起注意激光焦点处量分布正态分布（见图 125）
中心处量高样速率选择高速（Hi）时处样品流位置细胞颗粒
受激光光量样激发出荧光强度相样会造成测量误差
测量分辨率求高时（ DNA 分析）应选取低速（Low）

2激光光源光束成形系统
目前台式机 FCM采氩离子气体激光器激光（light amplification by stimulated
emission of radiation Laser）种相干光源提供单波长高强度稳定性高光
细胞微弱荧光快速分析理想光源细胞快速流动细胞光区
时间仅 1 微秒左右细胞携带荧光物质激发出荧光信号强弱射时间
激发光强度关细胞必须达足够光强度
激光光束达流动室前先透镜聚焦形成尺寸约 22×66μm 短
轴稍细胞直径光斑（见图 126）种椭圆形光斑激光量分布属正态分布保证
样品中细胞受光强度致须样流激光束正交相交激光量分布峰值处
台式机 FCM 光路调节者封闭安装时工程师调试完毕需者作
调节者操作十分方便
3光学系统
FCM 光学系统干组透镜滤光片孔组成分波长荧光信
号送入电子探测器（见图 126）
FCM 光学系统中光学原件滤光片（Filter）分成 3 类：长通滤片
（longpass filter LP）短通滤片（shortpass filtr SP）带通滤片（bandpass filter BP）
（1）长通滤片：长通滤片特定波长光通特定波长通 LP500
滤片允许 500μm 光通 500μm 光吸收返回
（2）短通滤片：长通滤片相反特定波长光通特定波长光吸收
返回 SP500 滤片允许 500μm 光通 500μm 光吸收返回
（3）带通滤片：带通滤片允许相窄波长范围光通般滤片两数
允许通波长中心值允许通光波段范围 BP500 表示允许通
波长范围 475μm525μm













图 126 流式细胞仪光学系统 6

4信号检测分析系统
细胞携带荧光素标记物通激光射区时受激光激发产生代表细胞物质
波长荧光信号信号细胞中心空间 360 度立体角发射产生散射光荧
光信号
（1）散射光信号：散射光分前角散射（forward scatterFSC）侧角散射（side
scatterSSC）散射光赖细胞样品制备技术（染色）称细胞物理
参数称固参数（见图 127）
① 前角散射：前角散射测细胞关确切说细胞直径方密切相
关通常 FCM 应中选取 FSC 作阈值排样品中种碎片鞘液中颗粒
避免测细胞干扰
② 侧角散射：侧角散射指激光束正交 90o 方散射光信号侧散射光
细胞膜胞质核膜折射率更敏感提供关细胞精细结构颗粒性质信息
两种信号激光原光束波长激光波长相目前采两参数
组合区分裂解红细胞处理外周血白细胞中淋巴细胞单核细胞中性粒细胞三细胞
群体未进行裂解红细胞处理全血样品中找出血板红细胞等细胞群体










图 127 流式细胞仪散射光图

（2）荧光信号：激光光束细胞正交时般会产生两种荧光信号种细胞身
激光射发出微弱荧光信号称细胞发荧光种特异荧光素标记细胞
受激发射荧光信号通类荧光信号检测定量分析解研究细胞
参数存定量(图 128)










图 128 激光作原理

前角散射
侧角散射
激光
Freq
Fl
激光 7
荧光染料选荧光素种样分子结构荧光激发谱发射谱
异选取染料单抗标记荧光素必须考虑仪器配置光源波长目前台式机 FCM
常配置激光器波长 488nm通常采染料碘化丙锭 (propidium iodidePI)藻 红
蛋白 (phycoerythrinPE)异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanateFITC）PECY5 等
① 荧光信号线性测量数测量
荧光信号线性测量数测量电子线路完成携带荧光素细胞激光正
交时受激发发出荧光滤光片分离波长光信号分达光电倍增
（PMT）PMT 光信号转换成电信号厂家采 PMT采线性放光电转换
器优点降低成提高线性度缺点响应速度慢造成仪器分析细胞速度降
低高速度超 3 300 细胞秒果样流速超速度会导致数损失
高档仪器采种方法电信号输入放器放放器分两类：线性放数放
线性放器放器输出输入线性关系细胞 DNA 含量RNA 含量总蛋白质含
量等测量般选线性放测量细胞膜表面抗原等检测时通常数放器
果原输出 1输入增原十倍时输出 2输入增原 100 倍时
输出 3 等免疫样品中细胞膜表面抗原分布时相差十倍甚万倍
线性放器法张图清晰细胞阳性群阴性群时显示出
② 荧光信号面积宽度
谓荧光信号面积采荧光光通量进行积分测量般 DNA 含量测量时采
面积(FL2A)荧光脉面积荧光脉高度更准确反映 DNA 含量
形状差异较 DNA 含量相等两细胞荧光脉高度等荧
光信号积分信号值相等
荧光信号宽度（ FL2W）常区分双联体细胞 DNA 样极易聚集两
G1 期细胞粘连起时测量 DNA 荧光信号（FL2A） G2M 期细胞相等
样测量数 G2M 期细胞率会增高影响测量准确性通设门（gate）方法
双联体细胞排原理双联体细胞荧光宽度信号（FL2W）单 G2M 细
胞设门真正 DNA 含量分布曲线细胞周期通荧光强度
高度峰面积峰做样分析
③ 光谱重叠校正
细胞携带两种荧光素（ PE FITC）受激光激发发射出两种波长荧光时
理选择滤片种荧光仅相应检测器检测会检测种荧光
目前种荧光染料宽发射谱性质然间发射峰值相发射
谱范围定重叠克服种误差效方法荧光补偿电路利标准已知样品
荧光球合理设置荧光信号补偿值采双激光立体光路技术减少种
荧光间相互干扰原理光路光电倍增前放孔作空间滤波器排
杂散光信号确保光源程序间互干扰避免第 1 激光（488nm）激发出
FL1FL2FL3 第 2 激光（635nm）激发出 FL4 间补偿然FL1FL2 FL3
点光源间补偿避免

5FCM 测量数存贮显示分析
目前 FCM 数存贮方式均采列表排队（list mode）方式目前 FCM 采
参数指标荧光参数标记物 4 采 list mode 方式量节约存磁
盘容量细胞测 4 参数获取 10000 细胞占容量 4×10000 （字
双字）时检测 1 参数时（ DNA）灵活关闭 3 参数节省 34
空间数文件然易加工处理分析优点缺乏直观性数显示通常维直 8
方图二维点图等高线图密度图等种
（1）单参数直方图：
细胞单参数测量数整理成统计分布分布直方图（distribution histogram）
显示图中横坐标表示荧光信号散射光信号相强度值单位道数横坐标
线性数坐标般细胞数见图 129










图 129 DNA 含量直方图抗原表达直方图

左图较低道数处细胞峰 G1 期细胞道数 G1 期细胞两倍 G2M 期细胞二者
间 S 期细胞右图 100101（M1）阴性细胞 101 （M2）阳性细胞
（2）双参数数显示
双参数数显示表达细胞两参数细胞数量关系常表达方
法二维点图（dot plot）等高线图（contour plot）二维密度图（density plot）二维图中
X 坐标该细胞参数相含量 Y 坐标该细胞参数含量双参数图形中
细胞亚群区分开时获细胞相关重信息左图 FSC SSC 组成
点图图中容易全血样中淋巴细胞单核细胞中性粒细胞区分开
分分析细胞亚群统计数右图通设门’分析（gating analysis）
FL1 FL2 散点图设门’单参数设门’双参数设门’通设门
调出参数相关信息调出信息样单参数双参数图 1210(左)
通细胞前角侧角散射光双参数点阵图设门圈出标中淋巴细胞群体
调出免疫荧光散点图图 1210（右）










散射光图 双色标记荧光图
图 1210 双参数免疫荧光点阵图

（二）流式细胞仪技术指标 9

1荧光测量灵敏度：灵敏度高低衡量仪器检测微弱荧光信号重指标般
检测单微球少标 FITC PE 荧光分子数目表示般现 FCM 均达
600 荧光分子
2仪器分辨率：分辨率衡量仪器测量精度指标通常变异系数 CV（coeffeient
of variation）值表示：
CVdm×100(d分布标准误差m分布均值)
果群含量完全相等样 FCM 测量理想情况CV0 FCM 测量曲
线表示图 1211（左）整系统测量中会带入许误差中样含量身
误差样进入流动室时射光微弱变化加仪器身误差等实际曲线
图 1211（右）


图 1211 仪器分辨率显示—CV 值

CV 值越曲线分布越窄越集中测量误差越般 FCM 佳状态时 CV
值<2CD 值计算采计算公式外半高峰宽计算半高峰宽指
峰高半方量峰宽m 代表峰顶部荧光道数 CV 值关系式：
CV半高峰宽m×04236×100
述公式建立正态分布条件实际情况测量数分布常常非称图形
采半高峰宽计算 CV 值明显前公式 CV 值实际工作中应引
起注意
3前角散射光检测灵敏度：前角散射光检测灵敏度指够测颗粒
般目前商品化 FCM 测量 0205μm 左右
4FCM 分析速度：分析速度秒分析细胞数表示细胞流光束速度超
FCM 仪器响应速度时细胞产生荧光信号会丢失段时间称仪器死时间
（dead time）死时间越短说台仪器处理数越快般达 3 000 s6 000 s
型机已达秒万细胞
5FCM 分选指标：分选指标包括：分选速度分选纯度分选收获率分选速度
指秒提取细胞数目前台式带分选仪器分选速度 300 s型机
FCM 高分选速度达秒万细胞分选纯度指分选出细胞占百分
般台式机型机分选纯度均达 99分选收获率指分选出细胞原溶液
中该细胞百分通常情况分选纯度收获率互相矛盾纯度提高收获率降低
反然样品液流中等距离接着序排着队机
旦两细胞挨时强调纯度收获率条件仪器会作出取
舍决定选择模式视具体实验求定图 1212 两种细胞分选原理示
意图 10

















图 1212 细胞分选示意图

（左：通道式分选 右：电荷式分选）

(三) 流式细胞仪补偿设置

众周知流式细胞通置激光器发射激光激发荧光染料通荧光 488nm
波长光转变波长光通光电倍增光信号转变电信号计算
机统计处理变读数

现流式细胞常荧光素：
激发波长 发射波长
FITC 488nm 525nm
PE 488nm 575nm
PETR 488nm 615nm
PECy55 488nm 667nm
PECy7 488nm 767nm
（五种荧光染料 Coulter XL BD Calibur PartecPASCyflowCytomationMoflo
机型）
APC 633nm 660nm
APCCy 633nm 767nm
(二种染料装双激光流式胞仪 CoulterAltra BD Calibur Partec
Cyflow ML Cytomation Moflow)
列出荧光素激发发射波长峰值实际荧光素激发发射波长
正态偏态曲线宽范围图 FTICPE 发射波长两者发
射波长均偏态分布FITC 受激数光源转变 525nm 左右光PE 数转变
575nm 左右光流式细胞仪中 FITC 检测 525nm 附光 PE 检测 575nm 11
左右光果时时两种荧光染料会出现发射光谱相互叠加现象









图 1213 受激光射 FITC PE 分子发射光谱互相干扰图

根图中 FITC PE 发射波长叠加情况流式细胞仪检测光信号时PE 荧光探
测器便会误检 FITC 发射 575 左右波长光时计算机会部分信号计入 PE 荧光
信号中引起错误样 PE 受激会发出部分 525nm 左右光进入 FITC 荧光
探测器中时需进行系列仪器设置该部分干扰
现商业提供荧光直标抗体结合 FITCPE 等荧光分子性状十分相发射
光光谱分布十分稳定通系列调节推算出漏入荧光探测器信号占探
测器信号百分设定该值计算机会探测器中减根探测器信号
百分数值图：










图 1214 FITC PE 荧光检测补偿调节示意图












图 1215 PE FITC 荧光检测补偿调节示意图 12

荧光补偿调节原理图做 FITCPEPECy5 三色荧光分析原需
调节补偿：FITCPEPEFITCPECy5FITCPECy5PEFITC PECy5
PE PECy5 六组补偿 23 种组合
进行补偿前信号已放电路处理 525nm 波长光信号
转化强度电信号时补偿电路放电路面补偿程中百
分数值两部分决定：原荧光探测器信号漏进探测器信号补偿终达
效果：漏进探测器信号原荧光探测器信号 x N0补偿百分数值
着灾光探测器放倍数（电压）变化变化特定电压应特定补偿参数
确定补偿中百分数值需运调节补偿基原理结合特定标实现
现进行 FITCPE 双色分析先准备该试剂阴性：
A：IgGFITCIgGPE通调节电压阴性群体落 FTIC PE 双阴性区（注：
进行调补偿时必须原补偿全部零）










图 1216 PE FITC 分子阴性

阴性处作调节荧光探测器合适放倍数零荧光阴性实
际没特异性抗体蛋白亚型致动物免疫球蛋白化学键生物键分子
间吸引作蛋白会标中细胞结合流式细胞仪检出定信号荧
光特异性抗体标结合时会产生两部分信号：非特异信号（阴性信号）
特异性结合信号认阴性信号特异结合引起信号
入统计范围
B： FITC 标记抗体IgGPE











13
图 1217 未调补偿双参数直方图

图未调补偿双参数直方图理想情况（没荧光干扰）检测中
含 PE 标记 IgG 阴性（ A 样）没信号出现实际情况
PE 坐标出现阳性信号信号 FITC 荧光漏入 PE 探测器中
引起时取合适百分 FITC 信号相抵消 PE 中信号（时电压已通
阴性设定绝变动）
通调节补偿参数图：












图 1218 A FITC 荧光信号补偿调节

方通 A 已 FITCPE 荧光信号设零时检测 FITC 标记抗体 PE
阴性FITC 信号假设 1000漏入 PE 信号 200补偿调节 1 号位时补偿数
字 5通计算出 PE 信号：2001000x5150时 1 号位补偿足理 2 号位
补 15时 PE 信号：2001000x1550补偿显足3 号位补偿 20
PE 信号：2001000x200补偿调节良4 号位补偿 30PE 信号：
2001000x3010时补偿调节头PE 信号会原底低补偿调节足
头会造成准确结果避免两种情况出现
FITC 漏入 PE 信号恰全部减时 PE 信号原底相时时补偿
便正确 FITC 单阳性细胞 PE 均荧光强度双阴性细胞 PE 荧光强度致








图 1219 FITCPE 双阴 FITC 单阳荧光示意图

FITC 阳性细胞通调节补偿需 PE 中信号恢复底图
知调节荧光补偿首先知道双阴性细胞情况通 A 调节电压确定阴性范围
次检测 FITC 标记中必须存阳性细胞阴性细胞样底参 PE 14
信号降底会少调节补偿
理检测 C ：FITC 阴性PE 标记抗体 PE 漏入 FITC 中荧光
前提条件 C 中存 FITCPE 双阴性细胞 PE 单阳性细胞








图 1220 FITCPE 双阴 PE 单阳荧光示意图

流式细胞 PE 单阳性细胞 FITC 均荧光强度双阴性细胞 FITC 均荧光
强度致时补偿便调节完毕
做色分析时必须做荧光间补偿方法先准备种标记荧光阴性
调节确定合适放电压逐加入种荧光标记特异性抗体荧光然调
节特异性荧光荧光补偿
日常工作中 CD4CD8 CD3CD4CD8 色抗体调节荧光补偿现
原理方法解释
外周血中存 TBNK 等白细胞加入 CD3PECy5CD4FITCCD8PE
三色荧光抗体时会出现种情况：
CD3CD4CD8细胞群： B 细胞
CD3+CD4CD8细胞群： NK 细胞
CD3+CD4+CD8细胞群：辅助型 T 细胞
CD3+CD4CD8+细胞群：杀伤型 T 细胞
知荧光参数存阴性细胞群单阳性细胞群满足调
节补偿基求已知存 CD3CD4+ CD3CD8+阳性细胞已知 PECy5
PE FITC 干扰考虑 CD3PECy5 荧光 CD4FITCCD8PE 荧光干
扰（会假阳性存）补偿调节：













图 1221 CD3PECY5CD4FITC CD8PE 荧光相互干扰补偿 15

许实验中会某标记物进行设门情况时终观察单参数结果非双
参数会忽略中补偿问题种情况调节补偿方法略清
楚理解补偿形成调节原理便解决问题详细方法见关章节涉设门实验
方案
16
第二章 流式细胞术样品制备分析技术

第 1 节 样单细胞悬液制备方法

新鲜实体组织样制备

FCM 单细胞快速进行种参数分析必须基单细胞基础根种组织成分特
点选择分散细胞方法期达单细胞产额高损伤少目标制备已
形成标准化程序实际操作中总会出现样样问题实体组织分散单细
胞程中解离方法瞬间持久影响细胞性质形态结构功等
种组织进行分散选择方法时应量减少细胞种影响现已专门样
制备仪（见图 211）标需工进行细胞分散目前常分散组织细胞
方法 3 种












图 211 流式细胞术动细胞分离器（BDMedmachine）

（） 酶消化法

1作原理：
实体组织分散作原理 3 方面：① 破坏组织间胶原纤维弹性纤维
等② 水解组织间粘糖等物质③ 水解组织细胞间紧密联结装置蛋白质
物质酶消化法实体瘤培养细胞分散单细胞方法常酶类试剂：蛋
白酶类——胃蛋白酶木瓜蛋白酶链酶蛋白酶中性蛋白酶等解离组织中细胞
胰蛋白酶水解脂键肽键胶原酶降解种分子类型胶原溶菌酶水解糖蛋白肽
糖苷键弹性蛋白酶消化连接组织糖蛋白弹性蛋白纤维酶细胞细胞
间组分特异作根分散组织类型确定酶类
2注意事项：
① 酶需溶解适溶液中溶液致造成酶效价降低② 注意酶
浓度消化时间③ 注意酶活性 pH 值胃蛋白酶碱性环境中失活性胰蛋
白酶中性溶剂中活性佳等④ 时注意影响酶活性素酶生产批号等
3方法学程序
（1）适合酶消化组织置离心中 17
（2）选酶溶液 12ml 加入盛消化组织试中
（3）般消化 2030 min（恒温 37℃室温）消化期间间断振荡吹
（4）终止消化收集细胞悬液 300 目尼龙网滤细胞团块低速离心
细胞碎片
（5）制备单细胞悬液进行进步荧光染色机检测保存备

（二） 机械法
机械法分散实体组织手术剪刀剪碎组织锋利解剖刀剁碎组织匀浆器制成
组织匀浆细注射针头抽吸细胞 300 目尼龙网滤出单细胞悬液采搓网法获
量细胞机械法易造成细胞碎片细胞团块机械法常方法配合
1剪碎法：
（1）组织块放入皿中加入少量生理盐水
（2）剪刀组织剪匀浆状
（3）加入 10ml 生理盐水
（4）吸吸取组织匀浆先 100 目尼龙网滤试中
（5）离心沉淀 1000 rpm35min生理盐水洗 3 遍次低速（500800 rpm）短时
离心沉淀细胞碎片
（6） 300 目尼龙网滤细胞团块
（7）细胞固定液固定低温保存备
2网搓法
（1） 100 目300 目尼龙网扎烧杯
（2）剪碎组织放网眼科镊子轻轻搓组织块边搓边加生理盐水洗直
组织搓完
（3）收集细胞悬液500800 rpm 离心沉淀 2min
（4）固定细胞低温保存备
3研磨法
（1）先组织剪成 12 mm3 组织块
（2）放入组织研磨器中加入 12 ml 生理盐水
（3）转动研棒研匀浆
（4）加入 10ml 生理盐水洗研磨器
（5）收集细胞悬液 300 目尼龙网滤离心沉淀 500800 rpm12 min生
理盐水洗 3 遍离心沉淀
（6）固定低温保存细胞悬液备

（三） 化学处理法
1作原理
化学处理法组织细胞间起粘着作钙镁离子置换出细胞分散开
2试剂配制
（1） 02EDTA 配制：称 EDTA 02g加入 Hankˊs 液 100ml封装高压消毒置 0℃4
℃保存
（2） 胰酶加 EDTA 配制：胰酶 025g 加 PBS（pH70）200ml浓度 0125EDTA 02g
加 PBS（pH70）100ml浓度 02取 40ml 混合分装置冰箱保存时滤

3实验方法 18
（1）组织切成薄片置入试中
（2）首先加入 EDTA 液 5ml室温 05h离心弃
（3）加入胰酶EDTA 液 5ml 37℃恒温水浴振荡器 30min
（4） 300 目尼龙网滤离心沉淀 1000 rpm5min生理盐水洗 23 次
（5）细胞固定低温保存备
种分散细胞方法目前实体组织解聚常方法实验证明化学试
剂方法处理组织导致细胞成活率低细胞产额低细胞碎片细胞聚集量稳定化学试
剂单独方法结合机械法常常造成严重细胞损伤单细胞产量低
酶学法化学法实体组织分散解聚较理想测化学成分良影响根
实验目选择合适单细胞悬液制备方法获理想样更 FCM 检测结果

（四）注意事项
1新鲜组织标应时进行处理保存免组织室温放置时间长产生中心组织
坏死细胞溶影响 FCM 测定结果
2根实验目选择隹固定方法免固定剂原造成 FCM 检测结果
稳定
3酶学法注意条件选择影响素注意酶溶剂消化时间pH 值浓度等方
面酶消化法影响
4需注意组织选择相应方法富细胞组织——淋巴肉瘤视神母细胞
瘤脑瘤未分化瘤髓样癌软组织肉瘤等定采酶学法化学法
单纯机械法获量高质量单分散细胞
5酶学方法时重视酶选含量结缔组织肿瘤——食癌乳腺
癌皮肤癌等选胶原酶较胶原酶具 Ca2+Mg2+存血清状态
发生活性降低特性

二组织活检窥镜取材标单细胞悬殊液制备

正常组织瘤组织淋巴结等活检组织窥镜（胃镜食镜等）取材标
材料较少制备起较麻烦制备方法实体组织基相似
1取材立放入盛少许 PBS 液青霉素瓶中
2取烧杯杯口 300 目尼龙网盖住线绳固定 PBS 液湿润取新
鲜组织标置尼龙网标量较少尤窥镜取材少取 3 块
3操作前先剪刀 PBS 液浸润然开始剪碎组织
4先剪视基组织块存时原装标青霉素瓶中 PBS 液洗细
胞均浆滤烧杯中果时见组织块剪刀剪碎加适量该 PBS
液洗直网组织块止样量收集细胞
5细胞加固定液低温保存备

三石蜡包埋组织样制备
石蜡包埋组织单细胞分散方法建立扩流式细胞术应范围量床访
资料通病理包埋组织流式细胞术分析重新深入研究利现常石蜡
包埋组织制备单细胞方法介绍

1实验方法： 19
（1）石蜡包埋组织切成 4050um 厚组织片 35 片乳钵研成 05mm 直径颗粒
状放入 10ml 试中
（2）加入二甲苯 58ml 室温脱蜡 12 天视石蜡脱净否更换 12 次二甲苯石
蜡脱净弃二甲苯
（3）水化：次加入 100957050梯度乙醇 5ml步 10 min乙醇加
入蒸馏水 35 ml10 min 弃
（4）消化：加入 2 ml 05 胰蛋白酶（pH 1520）消化液置 37℃恒温水浴中消化 30 min
消化期间隔 10min 振荡器振荡 1 次
（5）消化 30 min 立加生理盐水终止消化
（6） 300 目尼龙网滤未消化组织做第 2 次消化
（7） 收集细胞悬液离心沉淀 1500 rpm 生理盐水漂洗 12 次离心沉淀 500800 rpm
碎片
（8）保存细胞备

2注意事项
（1） 定石蜡组织中脱干净般脱蜡第 1 遍应 12 时左右第 2 遍 30min 左
右检测否石蜡已脱净方法弃二甲苯加入水乙醇果絮状物浮
起视蜡已脱净反蜡尚未脱净
（2） 消化时间长免造成已释放出细胞核消化
（3） 切片薄厚薄细胞碎片影响分析结果厚造成脱蜡理想
（4） 消化组织应先眼科剪刀剪碎然加胃蛋白酶消化30min37℃然
尖吸吹成悬液状
（5） 消化组织悬液滤细胞数少样组织片放 300 目尼
龙网底部圆滑试磨碎 PBS 液洗反复较
单细胞悬液

四外周血单核细胞样制备

血液天然单细胞分散细胞悬液血细胞生理状态呈分散游离状态
流式细胞分析理想样品血液中细胞成分白细胞红细胞血板中白细
胞成分分淋巴细胞单核细胞粒细胞血细胞中般检测单核细胞较
见
1外周血细胞样制备方法选择
般检测细胞分子成分——DNARNA蛋白质含量基表达蛋白等采淋
巴细胞分离液分离法制备单核细胞悬液样血液中分离出单核细胞——淋巴细
胞单核细胞幼稚血细胞肿瘤细胞等外周血免疫细胞细胞子某基蛋白细
胞表面标志检测采溶红细胞法
2单核细胞样品制备程序
（1） 取外周血 2ml肝素抗凝生理盐水血稀释成 4 ml 混匀
（2） 稀释血液试壁徐徐加入 4ml 淋巴细胞分离液液面勿力免
造成血液分离液混合保持清晰分层状态
（3） 离心 2000rpm30min室温 1820℃离心见试血液清楚分 4 层
层血浆层中层分离液层（单核细胞处血浆层分离液层中间）底层
红细胞层红细胞层粒细胞层 20
（4） 吸层中层间淋巴细胞层吸出收集 1 试中生理盐水洗 2 遍
次均 1500 rpm 10 min 弃清高纯度单核细胞悬液
（5） 适固定液固定置低温冰箱保存

五骨髓细胞单细胞悬液制备

1制备方法
（1） 菌抽取骨髓液 05 ml
（2） 骨髓标滴入 1000uml 肝素抗凝 1 ml PBS 液中
（3） 加入 PBS 液稀释 10ml
（4） 吸吸取 5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛 4 ml 类淋巴细胞分离液液面
（5） 条件骨髓核细胞分层 PBS类淋巴细胞分离液间形成界面
（6） 吸取核细胞层加入 10 ml PBS 液中混匀
（7） 1000 rpm 离心 5 min 弃清收集骨髓细胞加固定液置低温冰箱备

2注意事项
（1） 抽骨髓液时先注射器针头针筒针栓肝素浸润抽取时力量适中
（2） 吸取淋巴细胞层时量少吸分离液量应掌握 300 ul 左右样利洗
余分层液
（3） 溶红细胞方法：等量蒸馏水加入沉淀中轻轻摇动片刻见粉红色出现
立加入量生理盐水混匀离心清

六培养细胞单细胞悬液制备

1培养细胞特征
般细胞培养分悬浮培养贴壁培养细胞增殖形成等细
胞团块连接成片果两细胞粘连块细胞碎片影响 FCM 结果
进导致实验失败制备合格培养细胞单细胞悬液十分重
2培养细胞样品制备程序：
（1）培养细胞 004乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na） 029胰酶消化 37min（根
室温情况定）光镜见贴壁细胞间出现筛状间隙止）弃消化液加
PBS 液
（2） 吸细胞瓶壁轻轻吹移入离心中
（3） 短时低速离心 8001000 rpm5 min
（4） 弃清加 pH 74 PBS 液 58ml低速短时离心8001000prm35 min 重复
2 3 次细胞悬液中细胞碎片
（5） 加少许 PBS 液沉淀细胞轻轻吹均匀加固定液低温保存

七脱落细胞样品单细胞悬液制备

床工作中收集量然脱落细胞细胞标简单处理便成
较单细胞悬液提供流式细胞术分析包括脱落细胞胸腹水细胞尿液镜刷
检细胞等
21
1食拉网细胞单细胞悬液制备
(1) 食拉网器细胞洗脱 20 ml PBS 液中 1500 rpm 离心 PBS 液洗
2 次离心 500800 rpm 12 min弃清
(2) 加入 PBS 液 5 ml 300 目尼龙滤网滤离心沉淀清
(3) 加少许 PBS 液混匀沉淀细胞加固定液低温保存备
2尿液脱落细胞单细胞悬液制备
（1） 清洁器皿收集 24 时尿液置 4℃ 冰箱中然沉淀 2 时轻轻倒清液
留少许带细胞沉淀物吸移 1020 ml 离心中
（2） 500 rpm 离心 10min 清
（3） 加 PBS 液 810 ml 1000 rpm 离心 10 min 清重复洗 1 次
（4） 加 5 ml PBS 液混匀 300 目尼龙滤网滤离心沉淀清
（5） 加少许 PBS 液混匀加固定液低温保存备
3胸腹水脱落细胞制备
（1） 抽取胸腹水 50100 ml 加入 1000 IUml 肝素液 1 ml 放盐水瓶中置 4℃冰箱
中静置 612 h弃清
（2） 底部 1020ml 长吸移入试中 PBS 液洗 3 次 1500 rpm 离心沉淀 5
min
（3） 加 5 ml PBS 液混匀 300 目尼龙滤网滤离心沉淀清
（4） 加少许 PBS 液混匀加固定液低温保存备
4洗液细胞样品制备
（1） 300500 ml 生理盐水洗膀胱洗定时间吸出洗液放入容器中冰箱
置 612 h
（2） 取沉淀液 2040 ml 离心沉淀生理盐水洗 2 次 吸清
（3） 加 10 mlPBS 液混匀 300 目尼龙滤网滤离心沉淀清
（4） 滤 1000 rpm10 min离心沉淀清加固定液低温保存备


第 2 节 样品荧光标记检测分析

荧光标记原理
定量细胞荧光染色求细胞成分染色均匀性保证染色做染料分子数染某
种参量成定量效关系流式定量分析中掌握荧光染色液浓度非常重更
说明问题式表示：
FQ(IeεCL)
式中 F 表示荧光强度 Q表示光量子产额I 表示激发光强度ε表示消光系数C 表示染
色浓度L 表示浓度厚度激发光增强时荧光强度相应例增加荧光强度达
10 时继续增强光密度荧光仅会增加会造成结合细胞荧光素发生猝灭现
象荧光分子发射荧光邻分子吸收淬灭种淬灭现象果
增加荧光染料浓度会荧光强度增

1荧光染料细胞参量结合方式
（1）价键结合：DNA 链连结间开形成荧光染料分子价键结合种结合
方式十分稳固洗易造成荧光分子丢失例异硫氢酸盐荧光素(fluorescein
isothiocyanate FITC)藻红蛋白（phycoerythrin PE）等荧光染料 22
（2）嵌入性结合：荧光染料分子直接嵌入核酸分子碱基间种方式结合紧密
稳固易造成荧光分子丢失碘化丙啶（Propidium iodide PI）溴化乙啶（Ethidium
bromide EB）等
（3）结构亲合结合：静电力结合带正电核荧光分子带负电核核酸结构中磷
酸基相互吸引结合种方式结合极弱易造成荧光分子丢失例吖啶橙核酸单链结
合时派宁 Y 单链核酸结合均系静电力结合方式

2荧光素发射荧光基原理
应流式细胞术细胞表面部抗原进行检测时必抗体外种荧光素
必少包括：单标记抗体荧光素双标记抗体荧光素三标记抗体荧光素……
等荧光素发射荧光基原理：荧光素受定波度（激发波长）激光激发原子
核外电子吸收激光量原运动处基础态轨道跃迁激发态轨道运动
然电子激发态重新回基础态时释放出量发射出定波长（发射波长）荧光
荧光素激发光波长激发光激发选择正确激光器例ascade blu
需紫外线激光器FITC PE 等激发波长均 488nm产生见光氩离子
激光器 APC PC5 等激发波长红光范围需发射 630nm 波长红光氦氖激
光器
外种荧光素发射波长十分重确定检测需光电倍增性质
FITC激光激发发射绿光检测时第光电倍增（ PMT1）PE 发射
橙色光需第二光电倍增（ PMT2）PC5 PerCP 等发射深红色光时需
选择第三甚第四光电倍增（ PMT3 PMT4）等等

3常荧光素基生物学特性：
荧光素包括：PIEBFITCPEPC5PerCPCy5Cy7APC 等单色双
色分析时常荧光素 FITC PE
(1) PI EB：具嵌入双链 DNA RNA 碱基中碱基结合特异性
获特异 DNA 分布染色前必须 RNA 酶处理细胞排双链 RNA 干扰PI
EB 进入完整细胞膜检测死活细胞PI EB 种理化性质相似
PI EB 发射光光谱峰长波方移动作 DNA 蛋白质双参数测量时PI
红色荧光 FITC 绿色荧光更易区分测量外PI EB 测 DNA 分布变
异系数（CV 值）低 PI 更广泛应
（2） FITC ：种分子荧光素效率荧光强度取决溶液 pH 值
FITC 时应注意溶液酸碱度
（3） PE：分子量较 240KD会探针产生空间位阻 PE 化
学结构非常稳定高荧光效率易抗体分子结合里需注意 PE 作天
然染料源程序造成荧光素结构微差导致特征致
公司生产 PE 会结果
（4） 荧光素 单激光束三色荧光分析时求单激光激发选择三种荧光素发
射光波长应该 FITC（发射绿光）PE（发射橙光）外应选择发射红光深
红光藻红蛋白花青素（phycoerythin and Texes Red tandemPC5）叶绿素蛋白（Peridinin
Chorophyll proteinPerCP）藻红蛋白德克萨斯红（Phycoerythin and Texes Red tandem
ECD）荧光素受 488nm 蓝光激发均发射出红色光深红色发射光
① PC5 ECD 空间结构互补两荧光素分子通价键结合成组成荧
光分子PC5 PE Cyanin 5 组成ECD PE Texes Red 组成前分子发 23
射光波谱分子激发光波谱相重合样前分子受激光激发产生发射
光直接激发分子分子发射光体现出整组合荧光特性
组成说两分子表现分子物理性质② PerCp 种生活深海区域
鞭毛虫中发现色素功渗透入深海蓝光传递鞭毛虫叶绿素发色集团
进发出红光需注意 PerCP 单分子③ 藻蓝蛋白（allophycocyaninAPC）
花青素 5（cyaninCy5）两种荧光素激发光波长求 630nm 左右需第二激光束
激发种荧光标记抗体细胞结合原理模式见图 221常染料激发光发射
光波长见表 221：
































图 221 荧光标记抗体细胞结合原理模式图



APC 24
表 221 常荧光染料激发光发射光波长分布

荧光染料 激发光 发射光 应
Indo1 (unbound) 335 490 Calcium Flux
Indo1 (Bound to Calcium) 335 405 Calcium Flux
Hoechst 33342 350 470 DNA analysis
DAPI 359 462 DNA analysis
Alexa350 350 442 Phenotyping
PerCP 470 670 Phenotyping
RPhycoerythrin 480 578 Phenotyping
Green Fluorescent Protein (GFP) 488 510 Reporter molecule
YOPRO1 488 510 Apoptosis analysis
FITC 488 525 Phenotyping
Fluorescein diacetate 488 530 Cell viability
Alexa488 488 530 Phenotyping
Sytox Green 488 530 DNA analysis
SNARF1 488 530640 pH measurement
Fluo3 488 530 Calcium flux
dsRED 488 588 Reporter molecule
PECy5 (TriColor Cychrome) 488 670 Phenotyping
PECy7 488 770 Phenotyping
ECD 488 620 Phenotyping
Propidium Iodide 495 637 DNA analysis
Rhodamine 123 515 525 Membrane potential
Yellow Fluorescent Protein (YFP) 519 534 Reporter molecule
LDS751 543 712 Nucleated cell detection
7Aminoactinomycin D 546 655 DNA analysis
Alexa 546 546 573 Phenotyping
Cy3 550 565 Phenotyping
CMXRos (Mitotracker Red) 560 610 Mitochondrial membrane potential
Texas Red 596 615 Phenotyping
TOPRO3 643 661 DNA analysis
Alexa 647 647 667 Phenotyping
APCCy7 647 774 Phenotyping
Allophycocyanin (APC) 650 660 Phenotyping 25
4定量荧光染色评价标准
⑴ 特异性荧光染料否研究细胞成分特异性结合
⑵ 相实验条件荧光强度检测细胞成分呈严格正相关关系
⑶ 荧光显微镜检查荧光分布否具核形态结构荧光分布否致
粗荧光颗粒
⑷ FCM 分析评价 DNA 含量分析例组方图第峰（G01 细胞峰）第
二峰（G2M 期细胞）否成倍数关系

5影响样品荧光标记素：定量细胞学荧光染色易受种素影响导致正确
实验结果素：
⑴ 温度影响：般情况荧光染色环境温度结果明显影响温度升高
造成溶液粘滞性增加溶剂荧光染料分子动力加荧光猝灭（荧光染料浓度增加
荧光分子邻分子吸收荧光量子产额降低种现象）性加
荧光分子分子间相互碰撞机率明显增加影响荧光分子发光量子产额温
度升高时荧光量减弱般 20℃荧光分子发光产额变化明显基保持恒
定
⑵ pH值影响：荧光分子溶剂中基处离子化状态溶剂中氢离子浓
度荧光强度影响极荧光染料发光条件溶剂中处离子化极化状态
种荧光染料分子发光量产额高时均适 pH 值保持荧光分子溶剂间电离
衡果 pH 值发生改变造成荧光光谱改变造成荧光强度降低
⑶ 荧光染料浓度影响：荧光染色程中必须保证荧光染料浓度荧光强度
呈严格正相关关系种荧光染料溶液中浓度增加发光功存种猝
灭现象缔合分子形成缔合分子身具猝灭作缔合分子中电子
振作消耗激发分子量参猝灭作溶剂稀释荧光染料分子间
相互作完全消失时荧光量子产额发射荧光强度强溶液浓度增加时
荧光分子间发生碰撞效应缩短电子处激发状态时间非辐射跃迁率增加
引起荧光量子产额降时荧光染料分子浓度高容易产生滤光效应
选择合适荧光染料浓度荧光定量检测技术十分重
⑷ 杂质细胞荧光染色影响：杂质荧光猝灭作溶剂中含发光
物质物质存荧光分子受光激发分子相互作荧光分光量子产额
减少造成猝灭现象杂质荧光分子结合形成新化合物吸收光谱发生改
变荧光量子产额降低
⑸ 细胞固定剂细胞荧光染色影响：插入性荧光染料应中需固
定剂时固定剂细胞某物质结合干扰插入性荧光染料细胞成分结合造成
荧光发射强度改变染色细胞 DNA 时应醛类（戊二醛甲醛等）固定剂荧光
强度降低 50左右醇类固定剂相影响较荧光定量检测中细胞固定
剂选择十分重
⑹ 影响素：溶剂性质浓度荧光猝灭定影响例光神霉素
盐水溶剂中NaCl 19时荧光强度明显影响0918浓度时荧光强度相似
<09浓度时荧光强度减弱
利荧光染色技术检测细胞某种成分含量时正确测量值必须
影响荧光强度众素进行严格控制满意结果

二细胞破膜剂应 26

1细胞破膜剂应意义：流式细胞仪检测细胞 DNA抗原细胞凋亡关
p53 蛋白Bcl2 蛋白细胞子 IL4IFNr 等均需首先流动完整细胞膜
产生通透抗体孔谓破膜程破膜坏直接影响荧光染色效果结果
分析特细胞外抗原时检测时尤重
2细胞破膜剂种类：
（1）选择破膜剂原：① 保持细胞形态前角(FSC)侧角(SSC)分析时
准确定位细胞种类② 细胞膜表面抗原抗体结合力保持良细胞表面抗原检
测性高③ 时准确检测细胞外抗原
（2）种常见细胞破膜剂：① 005 皂角素（saponin）② 01曲拉通（triton X100）
③ 70乙醇（ethanol）
3种破膜剂细胞形态影响：① 3 种破膜剂处理外周血细胞散射光
图发现皂角素破膜淋巴细胞单核细胞粒细胞 3 群细胞清晰分辨相百
分未处理血细胞相似 triton X100 乙醇处理者淋巴细胞单核细胞群难
分开尤乙醇处理时单核细胞粒细胞已完全重合起皂角素较
保持细胞形态两种破膜剂会细胞皱缩结果② 破膜剂影响抗原表达：
CD8 抗体标记例较 CD8 标记破膜破膜标记 CD8结果发现：表面抗原标
记细胞破膜种破膜剂 CD8 表面抗原表达均明显影响果先破膜标
记triton X 100 乙醇破膜表达CD8抗原细胞例细胞抗原表达量急剧降
皂角素两指标均明显影响 CD45RO Fas 研究发现triton X100 乙
醇表达显著影响表达率降三种破膜剂细胞 IL2 检测结果影响
检测 IFNr 时皂角素乙醇相似 tirton X100表达率显著降低检测 TNFα
时皂角素敏感性显著高外两种总皂角素 Triton X 100 乙醇更理想细胞
破膜剂

三溶血剂应

溶血裂解红细胞流式细胞术分析白细胞先决条件溶血白细胞群
分开溶血坏直接影响检测结果必须溶红细胞程进行全面解严格
控制溶解红细胞条件
1溶解红细胞基原理：首先溶血剂进入血细胞包括红细胞白细胞然加
入溶血剂渗透压低溶液样细胞外渗透压等渗透压低溶液充分进入细
胞白细胞膜抗性较保持细胞完整形态红细胞膜抗性较差低渗透溶
液进入红细胞红细胞膜涨破达溶解红细胞目
2溶血剂注意问题：① 溶血剂血细胞充分混匀② 溶血时间宜短长
般 515 min见血液完全透明方③ 采厂家溶红细胞液严格厂家说明
书步骤进行操作

3溶红细胞液制备方法
红细胞溶解液 核细胞表面标志性蛋白抗原检测目前应广泛
制备单核血细胞悬液重方法厂家均商品市联科生物公司生产
caltagcallyse 溶血剂时实验室行配制具体配制方法
碳酸氢钾（KHCO3）10g
氯化铵（NH4 CL） 83g 27
EDTANa2 0037g
加双水 1000ml工作液


第三节 免疫细胞样品制备分析

基原理：
机体免疫状态机体否罹患疾病重指标目前采流式细胞术监测机体免
疫状态中重指标 TB NK 淋巴细胞水中 T 细胞包括 Th
Ts 细胞亚群CD3 细胞代表外周血中总成熟 T 细胞理应约等 CD4+细胞 CD8+
细胞总检测患者 T 细胞亚群时出现 CD4+加 CD8+细胞 CD3
情况 CD4+细胞实包括两面部分：CD3+CD4+细胞（真正 Th 细胞）
CD3CD4+细胞（非 Th 细胞）CD8 细胞包括两部分细胞：CD3+CD8+细胞（真正 Ts 细
胞） CD3CD8+细胞（非 Ts 细胞）者分两组：组 CD3CD8+CD（16+56）
+细胞（ NK 细胞部分）组 CD3CD8+CD（16+56）（群未知细胞）
见真正 Th 细胞 CD3+CD4+细胞真正 Ts 细胞 CD3+CD8+细胞 CD4
CD8 单标单抗 CD4 CD8 双标抗体检测 Th Ts CD3 抗体进行限定测
出结果必然会偏离真实值尤患者 NK 细胞明显增加时会 CD4 细胞 CD8 细胞
总远 CD3+细胞定三色荧光标记分析真正辅助性 T 细胞抑制性
T 细胞首先淋巴细胞中识出 CD3 细胞然 CD3 细胞中区分 CD4+ CD8+细胞
然杀伤细胞（NK）称裸细胞表面没类似 T 细胞 B 细胞表面标志
着免疫力学发展发现 NK 细胞表面标志 CD16CD56 等单 C 先
CD56 抗体法正确鉴定出 NK 细胞必须 CD（16+56）抗体里点必
须引起足够重视 NK 细胞定 CD3 阴性表达细胞 CD3CD（16+56）+细胞
真正 NK 细胞根否表达 CD8 NK 细胞分 CD3+C 左+C 先+56）+
细胞（前面已提部分细胞 NK 细胞中占例较般会影响 CD8
例） CD3CD8？参政+56）+细胞（ NK 细胞成分）B 细胞表面标志 CD19
理 CD3CD19+细胞真正 B 淋巴细胞实际检测中CD3+CD19+细胞少
忽略计 CD19+细胞 B 淋巴细胞`
利抗原抗体特异性反应原理单克隆抗体设法带种荧光染料作荧光标记
（荧光探针）种荧光探针单克隆抗体牢牢结合细胞激光器发射激光射
细胞膜抗原抗体复合物荧光探针发射出光谱继发荧光带荧光探针
单克隆抗体细胞表面相应抗原结合继发荧光量转换成电信号代表细胞表面
抗原量荧光通流式细胞仪识分辨实现细胞表面抗原定量检测细
胞免疫反应般分两种：直接免疫反应细胞表面抗原带荧光探针单克隆抗体特异结
合免疫反应间接免疫反应细胞表面抗原单克隆抗体结合带荧光第二抗体
抗体结合抗原抗体复合物带荧光探针
28

图 231 型设定十字门位置

求：双参数直方图左区域 R3 区细胞需总细胞数 9899图
271 1a R3 区中包含细胞(9995) 图 1b 细胞少(9752)图 1c 十字
门位置适时右区域(R2 区)角线位置处会出现额外细胞群通常说
火箭峰时十字门交叉点应该设 R3 区中接阴性细胞群位置(图 1d)
种情况允许 R3 区中细胞群例低 98

二淋巴细胞亚群分析：

1双色分析方案：见表 231
CD45FITCCD14PE
CD3TCCD4PE CD8FITC
CD3FITC CD16+56PE
CD19TC
CalLyse
Control IgG2aFPT


表 231 双色法检测外周血 TBNK 细胞试剂组合

Tube Number FITC PE Use
1 CD45 CD14 光散射坐标设门
2 CD3 CD19 总 T B 淋巴细胞
3 CD3 CD4 总 T CD4 阳性 T 淋巴细胞
4 CD3 CD8 总 T CD8 阳性 T 淋巴细胞
5 CD3 CD16 and CD56 总 T NK 细胞


2三色分析方案：见表 232
A：CD45CD14 确定 FS Cvs SSC 中淋巴细胞门位置 （详见）配溶
血剂户必做质控
B：阴性设置 PMT 电压阴性区域
C：CD3CD4CD8 三色检测监调节荧光补偿
D：CD3CD16+56CD19 三色检测
29
表 232 三色法检测外周血 TBNK 细胞试剂组合

Tube
Number FITC PE PECy5 Use
1 CD45 CD14 X 光散射坐标设门
2 CD8 CD4 CD3 T 细胞亚群
3 CD3 CD16 and CD56 CD19 NK 细胞 B 细胞

CD45 CD14 白细胞着表达固光散射坐标区分淋巴细
胞群体细胞适分型方案应够提供精确明确区分出类细胞亚群
方案中选抗体应够限度反应出整标中细胞信息提供样间质
控保证测定间结果致性方案设计中仅检测阳性标包括阴性
群体作阳性标荧光强度美国疾病控制中心制定套检测 T 淋巴细胞亚群
方案作参检测样

3 CD3CD19 区分 T 淋巴细胞 B 淋巴细胞
色免疫分型分型中阴性细胞群体仅区分阳性细胞群体双阳性
细胞中区分出单阳性细胞鉴简单型细胞完全作设定荧光阳性界线
参考细胞群 CDC 推荐淋巴细胞分型方案中细胞群体运相互没交叉
TB 淋巴细胞
① CD3 T 细胞特异性抗原CD19 识 B 细胞运 CD3CD19 双标试剂
应没 CD3 CD19 双阳性细胞群体存运 CD3CD19 双染色时会出现单
阳性细胞通设定机器设制续观察双阳性细胞检测作
② CD3CD19 阳性表达独立阳性细胞群体出现双阳性细胞均视假象样
型设定阴性阳性界线中单阳性细胞群体提供设定阳性界线标准
外 CD3CD19 检测时会双阳性细胞群体存 NK 细胞细胞提
供双阴性群体（时检测时会出现双阳性细胞 T 细胞 B 细胞粘附时
时通仪器检测区造成双阳性结果）
③ CD3CD19 仅设定标荧光阴性阳性界线检查仪器补
偿设置非特异性结合组合进行检测时会出现三群彼独立细胞群细胞
分群清位置发生偏差样进行仔细分析

4运 CD3CD4 鉴定 CD4+T 淋巴细胞
许单克隆抗体样抗 CD4 抗体完全辅助诱导性 T 细胞发生反
应会单核细胞结合鉴 CD4+辅助诱导性 T 细胞需加入第二种
抗体区分辅助诱导性 T 细胞单核细胞
(1) 首先 CD3 区分全部 T 细胞CD3CD4 双阳性真正辅助诱导性 T 细胞
细胞 HIV 病毒感染象 HIV 感染着疾病发展出现免疫抑制群
细胞会明显降床中 HIV 鉴测检测群细胞数量
(2) CD3CD4+细胞群体单核细胞组成细胞相 CD4+ T 细胞说弱表
达 CD4光散射参数位置分布较广CD3CD4 抗体组合完全区分 CD4 阳性辅助
诱导性 T 细胞 CD4 阳性单核细胞相区分开 CD4+T 细胞单核细胞完全分
离固光散射坐标设淋巴细胞门时门设包含单核细胞
细胞会影响检测值 30
(3) 检测补偿非特异性结合情况CD3+CD4细胞群体应明显 CD3CD19
中 CD3+细胞群位置相重合

5运 CD3CD8 鉴定 CD8+T 淋巴细胞
CD8 表达限 T细胞毒性抑制细胞种抗原部分 NK 细胞检测
CD8 必须 CD3 起鉴定 T细胞毒性抑制细胞
（1） 时表达 CD3CD8 细胞群真正 CD8+T 淋巴细胞CD8 表达
包括弱阳性强阳性部分CD8 表达常阴性细胞群体相延续 CD8 阳性细胞检
测群赖仪器灵敏度正确补偿建立恰设定阴性细胞群体
CD3CD8+细胞包括部分 NK 细胞少数粒细胞细胞弱表达 CD8+
缺少 CD3易 CD3+CD8+ T 淋巴细胞相区
（2）双标试剂检查补偿设制非特异性结合情况双阴性细胞视作部阴
性CD3 阳性群体应 CD3CD19CD3CD4 中 CD3 阳性群体处位置

6NK 细胞
（1） CD16(FcRIII)表达 NK 细胞表达中性粒细胞种抗原 NK 细胞
表达较弱 NK 细胞活化时丢失
（2） CD56 表达数（全部）NK 细胞 表达 T 淋巴细胞
CD3 联合区分 CD3+CD56+ T 淋巴细胞 CD3CD56+NK 细胞
（3）联合三种单抗完全鉴定 NK 细胞 NK 细胞表达 CD16 表达
CD56表达 CD3CD16 CD56 联合根荧光强度 NK 双阴性细胞
中区分出样运该组试剂NK 细胞形成独立群体细胞相区分

7样检测中部质控：CD3 检测数量
选 CDC 推荐方案检测淋巴细胞亚群方案中检测够提供批间
质控：
（1） 测定中含 CD3中 CD3 数量差异应超出实验室中
接受 CV 值范围实验室 CV 影响测定中 CD3 高值低值应相差 3
差值 3数作进步分析找出原
（2）般说测定中 CD3 数量极相出现偏差着重检查形态
学门（FSC vs SSC）中位置中细胞数量形态否致极偏差门
位置致造成外确保加试剂量前致阴性界线设置正确
（3） 排述原差异 3标弃

8淋巴细胞亚群数分析质量控制
试剂供区出 TBNK 细胞：
（1）T 细胞 B 细胞 NK 细胞百分总应等 100淋巴细胞实际中
FSCvs SSC 中淋巴细胞设门中会混入细胞碎片单核粒细胞难达 100
例
（2） 运 CD14CD45 设门确定淋巴细胞门 CD3 细胞百分+CD19 细胞百分
+CD3（CD16+56+）细胞百分应等 CD45CD14 中淋巴细胞百分±5
超±10

9外周血免疫细胞检测实验程序 31
（1） 取 100μl 1000uml 肝素抗凝静脉全血置 FCM 测量中
（2） 直接标记法：加入带荧光标记鼠抗目单克隆抗体试剂 10μl充分混匀
4℃冰箱中反应 30 min
间接标记法：加入带荧光标记鼠抗目单克隆抗体试剂 10μl充分混匀
反应 30 min加入带荧光标记羊抗鼠抗体反应 30 min
（3） 加入 2 ml 溶红细胞液充分混匀 4℃冰箱中反应 510 min
（4） 1500prm 离心 5min清
（5） 生理盐水洗 1 遍收集细胞机检测

10外周血免疫细胞检测注意事项
体免疫细胞检测通细胞表面标志——血细胞表面分化抗原免疫分析实
现分析免疫细胞时注意点：
（1）细胞分化抗原——细胞表面标志表达方式：采两种方式表达细胞荧光
强度阳性细胞百分① 细胞荧光强度表达细胞分布直方图细胞巅峰处
荧光道数② 阳性细胞百分表达检测细胞中标记阳性细胞占检测细胞百
分
（2）样品检测型正常：设型正常增加样品检测结
果准确性客观性型指：应单克隆荧光标记抗体(染色试剂)——携带
特异性单克隆荧光抗体免疫球蛋白空白带荧光标记相免疫球蛋白
作分析样品时减型阳性结果样品正常指：未加处理
正常组织细胞作实验样品分析细胞时正常相出检测细胞
异常程度处理样品变化趋势

第四节 DNA含量检测样品染色分析

DNA 含量检测流式细胞仪早目前然广泛应指标恶变肿瘤
细胞般出现异倍体研究证明 DNA 含量分析肿瘤诊断预高价值
DNA 含量分析提供细胞周期信息作细胞生物学种工具尤
细胞毒性药物研究价值DNA 含量常某种细胞周期相关蛋白时检测分析细胞
处某特定周期阶段
核酸染料 DNA 结合 DNA 进行定量分析反映细胞周期中某
静态情况 BrdUrd 脉标记（pulselabelling）细胞抗体结合连续标记
BrdUrd Hoechst33258 染料观察细胞循环程中动态变化程
生物细胞中DNA 含量较恒定参量 DNA 含量着细胞增殖周期时相
发生明显变化G0 期细胞认参增殖周期循环群细胞静止细胞
细胞 DNA 含量较恒定 2C 值G1 期细胞 G0 期细胞 DNA 值相均二倍体 DNA
含量细胞 DNA 倍增结束进入 G2 期终进入 M 期 M 期分裂两子细胞
前G2 M 期细胞 DNA 含量均恒定 4C 值四倍体细胞群

DNA 含量样品制备：
PI EB 荧光染色方法目前市场已试剂盒出售十分方便行配制试剂
PI 综合染液做细胞 DNA 含量步法染色程序：① PI综合染液配制：（100ml）
PI 5mgRNAas 2mg10 Triton X 100 05ml 生理盐水 5 ml枸橼酸钠 100mg加
蒸馏水 100ml调 pH 72～76 置 4℃冰箱中避光保存备② 单细胞悬液加固 32
定液细胞悬液离心沉淀弃 PBS 洗涤 2 次调细胞浓度 1×106加 2 ml PI 综合染
液③ 置 4℃冰箱染色 30 min④ 离心洗 PI 染液加少许 PBS 液机检测

二细胞 DNA 含量分析(ModiFit LT 20)细胞周期分析软件)

1DNA 倍体分析理：
生物细胞中DNA 含量较恒定参量DNA 含量着细胞增殖周期时相
发生变化G0 期细胞认参增殖周期循环 1 群细胞静止细胞细胞
恒定二倍体 DNA 含量（2C）G1 期细胞具增殖活性参细胞周期循环G1 期细胞
G0 期细胞 DNA 含量相均 2C细胞进入 S 期DNA 含量逐渐增加 2C→
4C直细胞 DNA 倍增结束进入 G2 期终进入 M 期 M 期分裂 2 子细胞
前G2 M 期细胞 DNA 含量均恒定 4C四倍体细胞
荧光染料细胞 DNA 分子具特异性结合定量效关系：① DNA 含量少
荧光染料结合成正② 荧光强度 DNA 分子结合荧光素少成正③ 荧光脉直
方图通道值成正FCMDNA 定量分析 1 细胞增殖群时二倍体 DNA 含量分
布组方图分三部分 G01SG2MG01 G2M 细胞峰 DNA 分布均正态分布S 期
认加宽正态分布
癌组织应该含定例正常二倍体细胞：① 癌组织源正常组织残存
源组织正常细胞② 癌组织血液供应支持组织正常组织延伸存
纤维母细胞血皮细胞血细胞等③ 机体免疫监视功量浸润淋巴细
胞巨噬细胞等癌组织 DNA 直方图（见图 241）异倍体峰前总见 1
二倍体峰位 G01 细胞峰外显微图象分析仪做倍体检测时采组织中淋
巴细胞做










图 241 肿瘤组织细胞 DNA 直方图
（DNA 异倍体 G01 细胞峰前 1 DNA 二倍体细胞峰）

2DNA 倍体命名原：
流式细胞术分析肿瘤细胞 DNA 倍体时应根 DNA 直方图G01 峰峰位 DNA 指数
（DNA index DI）确定 DNA 倍体类型DNA 倍体分单干系干系单细胞
突变肿瘤发展 DNA 单干系肿瘤二倍体者单异倍体肿瘤细
胞突变形成肿瘤者肿瘤发展程中出现克隆 DNA 干系细胞肿瘤克隆肿
瘤外肿瘤区域原发肿瘤继发转移灶肿瘤病程发展
治疗肿瘤灶 DNA 倍性变化种倍体类型差异称 DNA 倍体异
质性 33

3DNA 倍体分类分析参数：
① DNA 指数（DNA indexDI）

分析细胞 G01 期细胞峰顶荧光道数
DI
正常二倍体 G01 期细胞峰顶荧光道数

② 细胞周期时相细胞例：静止期DNA 合成前期（G01 期）DNA 合成期（S 期）
DNA 合成期丝分裂期（G2M 期）
③ 增殖活性：包括 S 期细胞例（Sphase fractionSPF）增殖指数（proliferous index
PI）：
S
SPF ×100
G01+S+G2M

S+G2M
PI ×100
G01+S+G2M

④ 细胞凋亡指数(Apoptosis Index AI)：DNA 二倍体细胞 G01 峰前亚二倍体峰细胞占
分析细胞百分（）

4 细胞 DNA 倍体具体分类方法：
FCM 检测肿瘤细胞 DNA 含量时肿瘤组织中 DNA 二倍体细胞作部参考细胞
计算肿瘤细胞 DNA 指数（DI） DI 值 DNA 干系数量肿瘤组织 DNA 倍体分
类：

二倍体

DNA 倍体 二倍体 单克隆
单异倍体 四倍体 肿瘤起源学说
异倍体 非整倍体
异倍体 克隆

图 242 DNA 倍体分类肿瘤克隆起源

（1） 二倍体（diploid D）：组织细胞中 1 DNA 干系细胞DI100
（2） 二倍体(neardiploid ND)：组织细胞中 2 DNA 干系细胞中 1 干系细
胞 G01 峰峰位 DNA 二倍体细胞峰位DI100 DNA 干系细胞DI≠100
090110 间该细胞峰二倍体细胞
（3） 四倍体(tetraploid T)：组织细胞中 2 DNA 干系细胞中 1 DNA 干系细
胞 G01 峰峰位 DNA 二倍体细胞峰位DI100 DNA 干系细胞DI 值
190210 间该细胞峰四倍体细胞
（4） 非整倍体(aneuploid AN)：组织细胞中 2 DNA 干系细胞中 1 干系细胞
G01 峰峰位 DNA 二倍体细胞峰位DI100 DNA 干系细胞 DI <090
>110外 T 细胞该细胞峰非整倍体细胞
（5） 异倍体(multiploid M)：组织细胞中 3 3 DNA 干系细胞 1 34
DNA 干系细胞 G01 峰峰位 DNA 二倍体细胞峰位DI100 外 2 2
DNA 异倍体干系细胞细胞群称异倍体细胞

5DNA 倍体异质性分析
（1） 基概念：肿瘤 DNA 倍体异质性指恶性肿瘤部位组织中DNA 克隆
干系分布明显者存 DNA 倍体异质性该肿瘤 DNA 异质体肿瘤肿瘤部位
组织 DNA 克隆干系相者 DNA 质体肿瘤然DNA 倍体异质性分析适
肿瘤原发灶浸润灶肿瘤原发灶转移灶肿瘤原发灶复发灶间 DNA 倍体关
系分析 DNA 倍体异质性分析
（2） DNA 倍体克隆干系判断标准：肿瘤组织中细胞 DNA 直方图原
异倍体 G01 期细胞 DI 值差≧02 时 DI 值差然 02分明显
2 细胞峰者均克隆细胞 DI 值差 02 时克隆细胞DNA 倍体
质体包括：DNA 二倍体质体肿瘤DNA 二倍体质体肿瘤DNA 四倍体质体肿
瘤DNA 非整倍体肿瘤 DNA 异倍体质体肿瘤 DNA 异质体肿瘤包括：DNA
二倍体种 DNA 异倍体组合种异倍体类型间组合
（3） DNA 倍体异质性分析床意义：DNA 倍体异质性恶性肿瘤重生物学特性
果患者 DNA 异质性肿瘤表明克隆起源肿瘤恶性度更高
肿瘤治疗时增加治疗难度复杂性肿瘤预增加肿瘤危险性

6细胞动力学分析方法进展
（1） 第 1 代细胞周期分析方法：DNA 合成丝分裂确定细胞周期时相细胞动力
学——采步化细胞氚标记胸腺嘧啶核苷掺入法通放射显影技术分析 DNA 合成
期时相时间
（2） 第 2 代细胞周期分析方法：利细胞 G01S G2M 期细胞核糖核酸含量（DNA
RNA）分布特征性差异检测非步化活性分子含量变化—— DNA
DNARNA 荧光探针染色流式细胞术检测细胞周期时相细胞例 BrdU
PCNAKi67 等方法标记进入细胞增殖细胞方法——便细胞复制分期分析
（3） 第 3 代细胞周期分析方法：细胞周期分子调控制机理 （细胞周期检测点等）元
化细胞周期宿（静止分化凋亡增殖）联系起年细胞周期调控基
产物发现（包括：CDKsCyclinsCKls等）细胞周期新理新技术包括：
① 突破典 DNA 合成丝分裂标志细胞周期分析模式转时相性驱
动分子机制基础细胞周期分析（Cyclin E+A 技术）
② 细胞周期检测点分析（Cyclin 域值技术）
③ 真正意义细胞增殖分析（双 Cyclins 技术）
④ 细胞周期时相性细胞凋亡分析（PA 技术）
⑤ 细胞增殖细胞凋亡步分析（调亡增殖率分析）（CyclinSubG1 技术）
⑥ 非时相性 Cyclins 分析（双光源三参数 Cyclin 分析技术分选 Westerm Blot 技术 ）
新代细胞周期分析理方法细胞生物学肿瘤细胞生物学新药研究提供新技
术台揭示生物学里更深科学问题
35

第五节 细胞凋亡检测分析

细胞凋亡（apoptosisApo）称细胞程序性死亡（programmed cell death PCD）
指细胞定生理病理条件遵循身程序结束生命程
动高度序基控制系列酶参程（见图 251）细胞凋亡生物体中
种普遍存现象胚胎形成衰老损伤细胞细胞清身反应性 T 淋巴细胞
清肿瘤发生发展转等细胞凋亡关外干细胞终分化成成熟血
细胞系列程中非细胞够走终点相部分细胞甚绝部分细胞
会中途凋亡胸腺 T 细胞 95％存活成熟 T 细胞阶段相数量原始幼稚红细
胞骨髓中发生原位溶血生理病理程细胞凋亡密切相关


细胞凋亡程中细胞形态学变化










细胞坏死程中细胞形态学变化


图 4855 细胞坏死细胞凋亡形态学较


细胞凋亡形态生化明显特征形态早期细胞核固缩染色体边集
核膜侧显新月体形核碎裂细胞浆细胞器密度增高细胞体积变细胞膜皱折卷
曲早期细胞膜完整性未受破坏明显特征 Ca2+ Mg2+赖骨源性核酸酶
激活细胞核染色体核体间断裂形成约 180～200bp 聚体组成寡
核苷酸片断琼脂糖凝胶电泳形成特征性梯状带 凋亡细胞形态改变影响
光散射特性流式细胞仪前角散射光细胞关侧角散射光反映 36
光细胞折射作细胞颗粒少关细胞凋亡时细胞固缩体积变
前散射光降低特性认凋亡细胞特点





图 251 细胞凋亡调控示意图


外细胞凋亡时染色体降解核破裂形成细胞颗粒增凋亡细胞侧
角散射光常增加细胞坏死时细胞肿胀前角散射光增侧角散射光细
胞坏死时增根前角散射光侧角散射光区凋亡细胞坏死细胞需
注意根前角散射光侧角散射光判断凋亡细胞性受检测细胞形
态均性核胞浆率影响较某淋巴细胞凋亡中光散射特性检测凋亡
性较肿瘤细胞凋亡中性较差根光散射特性检测凋亡细胞
优点光散射特性细胞表面免疫荧光分析结合起区特殊处
理发生选择性凋亡淋巴细胞亚型
检测细胞凋亡方法常见电镜光镜形态观察细胞 DNA 提取物
DNA Ladder 电泳实验细胞核体相关 DNA 片段检测等根细胞凋亡程中时相
变化流式细胞术细胞凋亡检测方法种：

1早早期细胞凋亡流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶 3（caspases3）
Caspases3 称半胱氨酸蛋白酶 3细胞凋亡信号传导通路中 ICE 蛋白酶家族重 37
成员细胞凋亡发生早期激活ICE 家族通两种途径引起细胞凋亡发生：
① 细胞毒 T 细胞（CTL）活化量表达 Fas 配体(Fas L)Fas L 靶细胞表面 Fas 结合
通 Fas 分子胞段死亡结构域激活 Caspase 8激活系列 Caspases引起死亡信
号逐级转导终激活源性 DNA 切酶核体断裂导致细胞结构毁损细胞
凋亡② CTL 细胞颗粒胞吐释放颗粒酶助穿孔素构筑孔穿越细胞膜激活
caspases10 引起 caspases 级联反应靶细胞凋亡 Caspase 8 caspase 10
启动 caspases 级联反应 caspase 3 逐级级联床常 caspase 3
检测早早期细胞凋亡






























图 4816 细胞凋亡信号传递系统示意图


2早期细胞凋亡流式细胞术检测：Annexin VFITCPI 法：
正常细胞膜磷脂分布称膜表面含带负电磷脂（磷脂酰丝氨酸
PS）膜外表面含占绝数中性磷脂细胞凋亡早期细胞表面发生变化细胞
38
膜部磷脂酰丝氨酸（PS）迁移细胞外层表面巨噬细胞通识凋亡细胞表面
细胞磷脂酰丝氨酸凋亡细胞凋亡体吞噬保护机体避免细胞部暴露引起炎症
反应 Annexin V 种 Ca2+赖 PS 高度亲力磷脂结合蛋白作探针
识细胞膜表面否 PS识凋亡细胞坏死细胞细胞膜表面出现磷
脂酰丝氨酸细胞凋亡初始阶段细胞膜完细胞坏死初期凋亡细胞
细胞活性鉴定染料（ PI）拒染性坏死细胞细胞膜损伤细胞
DNA PI 着染产生红色荧光细胞膜保持完细胞会红色荧光产生
细胞凋亡早期 PI 会着染没红色荧光信号正常活细胞相似流式细胞术
双参数散点图左象限显示活细胞（Annexin VPI）右象限非活细胞坏死
细胞 Annexin V +PI+右象限凋亡细胞显现 Annexin V +PI













图 252 细胞凋亡 Annexin VFITCPI 检测法


3晚期细胞凋亡流式细胞术检测：TUNEL 法
TdT 介导 dUTP 缺口末端标记法（TdT mediated XdUP nick ending end labeling
TUNEL） 1992 年 Gavricli 等首先报道实际分子生物学形态学相结合研究方
法完整单凋亡细胞核凋亡体进行原位染色准确反应细胞凋亡典型生
物化学形态特征石蜡包埋组织切片冰冻组织切片培养细胞组织中分离
细胞凋亡测定检测出极少量凋亡细胞灵敏度远般组织化学生物化学测定
法高细胞凋亡研究中已广泛采
细胞凋亡时核酸切酶活化双链 DNA 会出现许称断裂点产生系列
3＇OH末端外源性荧光标记脱氧核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranferase
TdT）够催化外源性荧光素酶标记 dUTP 连接 DNA 3＇OH 末端流式细胞术
检测该方法首先采蛋白酶 K 消化法渗透法标细胞进行孔标 TdT
FITC Biotin 标记 dUTP 起温育温育程中TdT 荧光素生物素标记 dUTP
连接 DNA 片断 3’末端采生物素标记时荧光显微镜直接荧光素标
记 DNA 片断进行观察采生物素标记时需亲合素生物素辣根氧化物酶亲合
素碱性磷酸酶系统显色分析采偶联碱性磷酸酶分子抗荧光素抗体连接
氧化物酶分子抗荧光素抗体作检测试剂
研究证实BrdUTP生物素荧光素标记脱氧核苷酸磷酸盐复合物高辛更
容易掺入凋亡细胞DNA中（图253）BrdUTP强掺入力荧光 39
素标记抗BrdU单克隆抗体检测时会更流式细胞信号未凋亡细胞没
暴露3’未端会检测









图 253 TUNEL 法检测细胞凋亡原理图

4晚晚期细胞凋亡流式细胞术检测：DNA 含量分析法：
细胞凋亡时细胞亚细胞分子水发生系列特征性改变包括细胞核改变
细胞器改变细胞膜成分改变细胞形态改变等1991 年许实验室独立报道
核改变造成种荧光染料凋亡细胞 DNA 染性发生改变
细胞凋亡时核酸切酶激活导致 DNA 广泛断裂细胞凋亡特征性表现
FCM 鉴细胞凋亡奠定物质基础目前检测凋亡细胞 DNA 断裂方法中常
简便 DNA 含量分析细胞染色前首先污剂处理细胞通透性增加
者沉淀固定剂进行固定细胞膜通透性增加固定剂影响降解 DNA
完全封闭细胞中细胞洗染程中 DNA 碎片细胞逸出凋亡细胞 DNA
含量减少加 DNA 降解荧光染料结合减少细胞 DNA 荧光强度降低
DNA 直方图显示 G01 峰前出现 DNA 含量减少亚二倍体称亚 G01 峰称凋
亡细胞峰（见图 254）













图 254 细胞周期法检测细胞凋亡原理图

通 FCM 测定 DNA 含量时分析凋亡细胞周期位置 FCM 测定 DNA
含量时研究凋亡细胞周期特异性Andreff 等 FCM 研究细胞凋亡细胞周期关系
提出凋亡分两阶段：早期凋亡（early apoptosis）发生药物作特定周期时相
细胞凋亡（homophase apoptosis）作 3～8 时延迟凋亡（delayed apoptosis） 40
指发生周期细胞凋亡（homocycle apoptosis）发生分裂期子代细胞称
分裂细胞凋亡（post mitotic apoptosis）指出：化疗药物细胞作药物浓度
作时间赖性分四阶段：（1）亚细胞阻滞阶段时 DNA 迅速修复细胞存活
具克隆性发生细胞分化子代细胞基突变（2）DNA 损伤干扰细胞周期
阶段者 DNA 损伤修复导致子代细胞突变发生延迟凋亡（3）药物浓度进
步加导致早期凋亡延迟凋亡（4）更剂量造成细胞坏死外应 FCM
方法通 DNA RNA 联合检测鉴出 G0 期细胞分析细胞凋亡
G1 G0 期细胞关系FCM DNA 含量测定直观简便迅速实 FCM 判断
细胞凋亡基方法
DNA 降解程度取决细胞凋亡阶段细胞类型凋亡诱发素特性外
染色程中 DNA 逸出量变化影响 FCM 检测结果研究高浓度磷酸枸橼酸缓
液（phosphatecitrate bufferPCB）较 Hank`s 衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution
HBSS）更易凋亡体析出 PCB 加入漂洗液中增高降解 DNA 逸出量亚
峰 G01 峰更清晰提高 FCM 区凋亡细胞正常细胞力
DNA 含量测定检测细胞凋亡程中局限性特异性高：（1）亚
G01 峰细胞数目代表核碎片数目代表凋亡细胞细胞数目（2）亚 G01 峰
非凋亡细胞特非整倍体细胞机械损伤细胞均造成亚 G01 峰FCM DNA 含
量检测方法进行凋亡细胞分析时应注意结合形态学免疫学生物学方法死活细胞计
数标准二倍体免疫标志等参数进行综合分析更准确分析凋亡细胞状态凋亡细
胞 DNA 降解分子 DNA 通透细胞膜逸出细胞外凋亡体带走部分 DNA
凋亡细胞 DNA 含量降导致 DNA 染料染色力降 G01 峰前呈现亚二
倍体细胞峰称 Apo 峰

5细胞凋亡相关基蛋白流式细胞术检测：
（1）FasFasL(Fas 配体)：Fas 抗原 Fas 配体交联淋巴细胞诱导靶细胞凋亡必需途径
异常免疫相关疾病肿瘤移植排斥病毒性肝炎肾球肾炎等种疾病高
度相关
（2）p53：p53 细胞周期中检查点’分子控制着细胞 DNA 损伤法修复时启
动细胞杀’进程p53 缺失突变已证明种肿瘤（：乳腺癌胃肠道
肿瘤 肝细胞癌等）发生重原表达高低肿瘤诊断预重指标
（3）Bcl2：Bcl2 细胞凋亡抑制蛋白肿瘤发生发展治疗等着密切关系
表达调肿瘤诊断指标预参考

第六节 血板血板活化 FCM 分析

流式细胞术血板分析研究方法该法提高检测灵敏度减少素
干扰该法精确检测病血板生成方面情况血板计数低时检测表
面标记
血板表面标记检测方法
全血法荧光单标记检测血板 CD62pCD63CD42bCD41CD61 等指标具体
染色方法步骤：
1 采血枸橼酸盐 EDTA 抗凝
210μl 荧光标记抗体加 100μl PBS加 5μl 全血（样品）
10μl 抗体型加 100μl PBS加 5μl 全血（） 41
轻轻混匀室温孵育 15min
3加 23ml PBS（1 PFA）终止反应机检测分析

二流式细胞术计数网织血板(RP)：
血板 RNA 含量血板生成状态相关区分骨髓抑制外周破坏增加引
起血板减少化疗移植网织血板监测巨核细胞血板生成状态
（1）网织血板检测原理：
噻唑橙（thiazol orangeTO）种亲脂性荧光染料迅速通活细胞膜
RNA 结合荧光强度提高 3000 倍利 TO 性质学者建立流式细胞仪检测网织
血板百分率方法尚统标准方法
（2）网织血板检测方法：
① 制备富含血板血浆： EDTA 抗凝全血 500 rpm 离心 8min取出层含血板血
浆2000 rpm 离心 10min弃清液底层血板柠檬酸钠葡萄糖 EDTA 缓液（pH74）
悬浮洗次 Tyrode＇s 缓液（含牛血清白蛋白 EDTA）洗两次悬浮 Tyrode＇s
缓液中调整血板浓度 100×109L 作样品
② 醛化固定标加入 1甲醛 4℃放置 2h 固定血板检测前 Tyrode＇s
缓液洗次
③ 染色计数： 50μl 醛化固定血板悬液加 450μl 噻唑橙染液放室温暗处
1～2h流式细胞仪测定 525nm 波长处荧光强度代表 RP 数量时计数血板总数
计算知 RP 值 RP 半动计数法该法采噻唑橙染色染色血
板称噻唑橙阳性血板（TO+血板）
（3）网织血板检测床意义
① RP 相百分率反映外周血中血板更新状态
② 血板减少症时 RP 百分率均明显增加： ITP肝脏疾病
③ 健康新生 RP 孕龄关孕龄<30 周新生 RP 明显高>36 周新生 RP
30～36 周新生 RP
④ 作骨髓抑制血板恢复造血促进子血板造血监控指标网织
血板作床应血板生成素效果评价指标
⑤ 造血干细胞移植化疗造血功恢复估计作骨髓造血重建血
板生成素指征

三流式细胞术检测血板相关抗体（PAIgG）：
种够通胎盘存血板表面免疫球蛋白称血板相关抗体
（PAIgG）PAIgG 包括 3 种成分：（1）真正抗血板抗体（2）循环免疫复合物（3）
非特异性吸附血板表面血浆免疫球蛋白已确认PAIgG 原发性血板减少性
紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpuraITP）免疫性血板破坏疾病相关血
板结合 PAIgG 数量检测结果作床诊断单检测方法更价值
（1）试剂
洗涤缓液（PBSEDTABSA）：PBS 缓液含 10mM EDTA 05 BSA
抗体：Goat F（ab＼）2AntiHuman IgG（Fc Sp）—RPE （H10104Caltag 克隆抗体）
阴性：Goat F（ab＼）2IgG—PE（11304Caltag）
（2）样
① 正常血样1 血板数值正常范围具体数目详
② 病血样：2 月龄双胞胎（患者 1 患者 2）均贫血血板具体数目 42
详
（3）步骤
① 含 EDTA 抗凝剂血液收集采血三血样均取 2ml 分加三流式标准中
② 离心 500 rpm 15min清（富血板血浆）转外三流式标准中
③ 离心 2500 rpm 3min吸血浆血浆等体积洗涤缓液重悬血板果必
旋涡混合器混匀
④ 洗涤缓液洗涤血板三次次离心 2500 rpm 3min
⑤ 适量洗涤缓液重悬血板血球计数仪测定血板浓度中正常血样血板
数 2000µl患者 1 血板数 6000µl患者 2 血板数 7000µl（稀释浓度）
⑥ 含重悬血板流式标准分成两A 检测B 阴性 6
正常血样分取 250µl 两流式标准（A B ）中血板总数 5
×105 患者 1 血样分取 80µl 两流式标准（A B ）中血板总数
48×105患者 2 血样分取 70µl 两流式标准（A B ）中血板总数
49×105
⑦ 述六流式标准 A 均加 5µl Goat F（ab＼） AntiHuman IgG（Fc Sp）
B 均加 5µl Goat F（ab＼）2IgG
⑧ 室温避光孵育 15min洗涤缓液洗次方法步骤 4
⑨清加 05ml 洗涤缓液重悬机分析结果见图 224

阴性样品

正常样品 43
患者样品

图 261 血板抗体检测结果
（患者样品散点图细胞群直方图峰均显著右移）

四全血中活化血板检测：
活化血板表面会出现新标记两：PAC1 （活化 IIbIIIa）
CD62P （Pselectin） 床活化血板标记外 CD31 （PECAM）
CD63 （a lysosomal antigen）两活化标记已床应血板活化研究全
血标收集求 19 号（更）针头开始吸出 2ml 血注入试（弃）然
续血液轻轻注入 1 试
（1）血板特异性膜糖蛋白检测 先全血中血板膜糖蛋白进行免疫荧光标记血
板血中细胞分开根血板特异性糖蛋白制备荧光单抗全血中特异性
识血板
（2）活化血板标志物检测 活化血板静止血板相膜某糖蛋白常发生显
著变化成活化血板检测标志物 CD62P PAC1 等应特异性糖蛋白制
备荧光单抗便全血中特异性识活化血板血板膜糖蛋白已深入研究
表 261 显示血板膜糖蛋白功膜糖蛋白中仅血板膜表面
表达 GPIbGPIIbGPIIIa 等限种

表 261 活化血板 CD 单抗简介
CD 单抗 代表性单抗 识膜糖蛋白
CD36 5F1CIMeg1ESIVC7 GPIV
CD41 PAC17E3PBM64 GPIIbIIIa GPIIb
CD42a FMC25BLH6GRP GPI
CD42b PHN89AN51GN287 GPI
CD61 Y215CLBthromb1 GPIIIa
CD62 CLBthromb6RUUSP1181 Pselectin GMP140
CD63 RUUSP228CLBgran12 GP53

（3）全血法双标记检测活化血板染色方法： CD62pFITCCD42bPE
① 采血枸橼酸盐水蛭素抗凝
② 10μl CD62pFITC 加 10μl CD42bPE加 5μl 全血（样）
10μl IgG1FITC 加 10μl IgG1PE加 5μl 全血（）
轻轻混匀室温孵育 15min
③加 23 ml PBS（1 PFA）终止反应机 SSCLOGCD42bPE 圈定血板检测分
析

五流式细胞术检测血板注意事项：
（1） 抗体选择：选择 CD workshop 中单克隆抗体单克隆抗体反应特异性高
非特异性结合少血板富含 Fc RⅡ(CD32FcⅡ受体) Fc 受体抗体亚类具
亲合力亚类选择抗体选择 IgG1
（2） 抗凝剂选择：肝素量避免EDTA 室温 2025℃时抗凝效果枸椽酸盐
差 37℃时EDTA 会影响蛋白结构剌激血板活化 44
（3） 标采集：般采少量外周血收集玻璃容器塑料容器中采血中避免组织
液流入血液中防止气泡产生号针头（ 18 号）量减少化学物理激活
素血板活化作标放置温度 1525℃宜410℃血板外形发生改
变
（4） 抗体标记物选择：知道FITC PE 标记常 488nm 激发作
双标记试剂PE 荧光强度 FITC 强单色测定中 CD62p CD63 静
止血板均弱表达检测两抗原时 PE 标记宜 CD62P CD63 配合
高强度表达抗原 CD41CD61 CD42b 作双标记时CD62p CD63 宜 FITC
标记
（5）样品固定：先固定样品减少血板体外活化先固定破坏蛋白质结
构增加非特异染色作体外剌激血板活化研究时处理标外均应先
标记固定固定剂 0510聚甲醛
（6） 缓液：PBS（001MpH72）+BSA 孵育洗涤程中首选分析血
板活化程中洗涤时宜 Tyrodes 缓液该缓液中含 Mg++葡萄糖减
少血板体外活化
（7）仪器设置：首先利微球进行仪器光路光电信号控制仪器保持稳定
灵敏状态数采集散射光荧光均数放调节散射光电压细胞群分布
中央调节荧光电压样品继发荧光强度落数值 1 荧光补尝荧光微球
双色标记单抗做（ CD4FITCCD8PE）标少分析 5000 细胞流速宜
超 10001500 细胞s
（8）数分析：活化血板（CD62pCD63）等少量表达抗原检测中阈值设定
般非特异性染色例控制 12范围非特异性染色进行正确设定
仪器敏感度试剂质量测定抗原身高表达时判断抗原表达高低度
时需均荧光强度宜

第七节 造血干细胞（CD34+细胞）检测

外周血现已广泛作骨髓移植癌症患者接受剂量化疗放疗骨髓重建需血
干细胞（Hemotopoietic Progenitor Cells HPC）源外周血源性干细胞现运体
移植应面逐步拓展异基骨髓移植中外周血代骨髓作造血干细胞
源着优点：易采集供者需全身麻醉减少采集发症发生受者造血系
统重建快费低住院时间缩短部分全部门诊完成操作等发现 CD34 抗体鉴
造血干细胞成功应流式细胞仪定量检测造血干细胞正常外周血中干细胞数量
占核细胞 01发现纯化标记抗 CD34 单克隆抗体开始流式细胞
定量检测外周血骨髓中 CD34 阳性造血干细胞成CD34 抗原存种祖
细胞中包括干细胞间质干细胞某组织皮细胞表达CD34 阳
性细胞运 SSC CD34 双参数流式散点图检测证实 CD34+细胞计数决定干细胞采
集时间效方法流式细胞仪定量检测 CD34+细胞成监测动员干细胞计数移植中
造血干细胞数量效精确工具工作发现 CD34+CD33+双阳性细胞数量早期移
植成功相关性时注意骨髓中提取 CD34+CD38阴性细胞 IL3IL6
GMCSF 刺激够形成原始集落着 CD38 抗原增加CD34 阳性细胞形成种
原始集落力降 CD34+细胞中CD34+CD38表型细胞占 10左右发
现细胞表面抗原识干细胞中起重作绝数床应说计数
CD34+细胞已足够移植提供持久参数 45
计数 CD34+细胞 Milan 方案ISHAGE 方案 ProCOUNT 方案前两者均双台
者单台谓双台法指先流式细胞术检测测样中 CD34+细胞百分
血细胞计数仪测定样白细胞总数两者积样中 CD34+细胞总数样方法结果
源误差两流式细胞仪误差血细胞计数仪误差单台法指时测
CD34+细胞百分绝数方法ProCOUNT 方案事先加入已知数量荧光微球
作参换算出 CD34+细胞绝数样 CD34+细胞进行精确计数缺点成
较高流式细胞仪计数 CD34+细胞百分绝数量方法存较变异性原
(1) 分析方法导致结果误差组已尝试方法标准化单色分析
Milan 方案双色分析 ISHAGE 方案方法非善美Milan 方案
CD34PE 单色分析效排非特异染色造成干扰ISHAGE 方案数处理中忽略
CD45dim造血干细胞ProCOUNT 方法结果均低 ISHAGE 等方案测定数值
采核酸染料CD34PE CD45PreCP 三种试剂染色进行色分析精确确认
造血干细胞充分排非特异染色细胞碎片血板干扰(2) 传统流式细胞仪造
血干细胞计数采双台方法研究表明双台绝计数法实验室间变异性
种变异血细胞计数仪误差致(3) 造血干细胞计数时采溶
血洗涤法常导致样处理程中细胞损失定程度影响实验结果准确性

图 271 健康中国成年外周血 CD34+造血干细胞绝计数参考范围






CD34 检测方案标准化

1米兰方案
第广泛应干细胞计数方案 Istituto Nazionale Tumori in Milan Siena 等
创立米兰方案（Milan Protocol）方案中需准备 3 50 ul 血样 leukapheresis
样（白细胞计数 150ul受者样样抗体均需加倍）中 1 留出
作染色1 加入 15ul 抗 CD34 CD33 抗体第 3 加入 15ul 抗 CD2CD19 抗体
（计数 TB 细胞）细胞 4℃避光孵育 25 分钟加入红细胞溶解液孵育 15 分
钟加入含钙镁离子 PBS 洗液1500 rpm 离心 7 分钟洗涤果红细胞溶解彻底
重复溶解程弃清细胞 4℃保存时机检测光散射参数中分
析细胞设门选定白细胞（排碎片）设立门C 信号 CD34 阳性
表达加区分CD34 弱阳性细胞般分析见图 271
目前米兰方案改进版分：运 CD34 抗体溶血技术
加入抗体提高鉴力变换荧光标记 CD45 抗体核酸染料更方便鉴
白细胞等方面进行改进 46

散射光图 型 CD34+细胞检测

图 271 米兰方案检测外周血 CD34+细胞

2ISHAGE 方案
Sutherland 1994 年研究方案相似手段分析方案 ISHAGE
收录作推荐方案旨确立普遍通排实验室中实验室间差异方案
方法门断累加完成第门基 CD45SSC 双参数图通
设门红细胞碎片聚集物干扰造血细胞样中尤见特
样溶血免洗法处理通步骤计算 CD34 阳性细胞例提供
分母（总白细胞数量） R1门中少包括 75 000 细胞 R4门
计数超 100 CD34 阳性细胞







图 228 CD34+细胞检测（DEFG 实验样品HIJ 样品）



（DEFG 实验HIJ 型）










47







（ ）

图 272 ISHAGE 方案 CD34+细胞检测结果

通 R1门获取细胞显示 CD34SSC 双参数散点图图中设立 R2门
调节位置包含 CD34 强阳性弱阳性 SSC 信号弱中等细胞建立
CD45SSC 双参数散点图 CD34+细胞显示中中设 R3门 CD34+
颗粒中聚集血板淋巴细胞单核细胞 R3门中圈定细胞显示 FSCSSC 图
中检测细胞否落时幼稚淋巴细胞门R4 中通 R4 淋巴细胞
颗粒（注：确定 R4门位置呢？方法： CD45SSC 双参数散点图中设立
R5门圈定 CD45 强阳性 SSC 低信号淋巴细胞群体 R5门中细胞显示
R4门 FSCSSC 双参数直方图中根中淋巴细胞位置调节 R4门确
定 R4门 FSC SSC 轴值低范围）脐血标中会出现 CD45CD34
双阳性血板集聚颗粒侧角散射光弱真正 CD34+细胞处幼稚
淋巴细胞位置 R4门排终 R4门中读取 CD34+干细胞计数数值时
检测 CD45ISOTYPE 双染阴性 ISHAGE 方案设门分析 R4门中
见非特异性染色颗粒存某情况 R4 出现非特异性染色颗粒样计数时
R4门减非特异性染色细胞数
方案争否 CD34 特异性染色颗粒 CD45 弱表达解决
疑问仪器调节设门方面作改进两独立直方图加入述四图型方
案中第 1 直方图中增设 R5门精确圈定淋巴细胞：CD45 强阳性 SSC 低信号
细胞显示第 6 FSCSSC 双参数直方图中确定 R4门圈定幼稚淋
巴细胞范围（第 4 直方图第 6 张拷贝）样限度血板未溶
解红细胞碎片张直方图确定 FSC 预值设置否适FSC SSC
电压设置否足够图中确保 CD45 阳性淋巴细胞够适
FSCSSC 图中显示出建议淋巴细胞 FSC 参数强度 1024 线性坐标位 200
左右位置 FSCSSC 电压阈值设置完毕调整第 1 直方图中 R1门位
置包括 CD45 弱阳性阳性颗粒R1门 CD45 坐标限根直
方图确认：建立第 5 张 CD45CD34 双参数直方图根 CD34 阳性颗粒 CD45 表达
值建立十字门确保 CD34 阳性 CD45 极弱表达细胞全部 CD45 设定界线左
侧然根图 CD45 界线位置确定 R1门值
CD34+细胞百分检测通白细胞决计数转换成 CD34+细胞绝计数原
ISHAGE 方案基础第三第四荧光通道中检测已知数量标准微球便达成
目样法定量单台流式细胞仪变直接绝计数干细胞精确仪器
ISHAGE 方案完全兼容 7AAD 荧光染料进行样品活性检测样样中绝定
量计数活性 CD34+阳性细胞点床检测抽取时间长样时十分意
义 48

三ProCOUNT 分析 CD34 细胞方法
ProCOUNT 三色直接荧光标记快速计数 CD34+细胞动计数系统包括
ProCOUNT 试剂盒 ProCOUNT 动获取分析软件

1ProCOUNT 原理方法：
软件先获取 5μΙ样数 FL1（核酸染料）SSC 设实时门
碎片界限设定阈值门实验报告图显示
然软件获取 1000 微球选定收获界限收获细胞
CD34+细胞相含量较低流式细胞学特征细胞群体相似外
需利已知祖细胞特征参数设门策略通门集合逻辑门
效外粒细胞单核细胞碎片等需细胞群体种分析方法利细胞颗粒
度（SSC）核酸染料表达（FL1）CD45 表达（FL3） CD34 抗原表达（FL2）特点
帮助区分祖细胞细胞群体图 273 ProCOUNT 试剂盒参数设门方法
首先确认微球群体 CD34 细胞太少需细胞群体关系设定 CD45门：
单核细胞群确定门SSC 限 10低 SSC 粒子确定右限门 CD45 强阳
性细胞单核细胞 FL2FL3 FL1FL2 散点图辨 CD34 细胞群分界碎片已
获取全阈值非微球粒子均认核细胞CD45 计数包括 CD45
阴性细胞前两步（ ）通核酸染料（FL1）细胞碎片外 CD45（FL3）
染色较强细胞确定祖细胞位置时属祖细胞高侧角散射光（SSC）
细胞群体排外 FL1（核酸染料） FL2（CD34）双参数散点图中清
楚祖细胞细胞群区围绕祖细胞群体设门定量微粒完成绝数
续步骤

图 273 ProCOUNT 方法分析 CD34+细胞

（绿色细胞群：非 CD34 细胞红色细胞群：CD34+细胞蓝色细胞群：绝计数微球

2ProCOUNT 质控：
（1） CD34 核细胞绝计数差异≤21核细胞绝计数（
控制加样误差试剂误差）
（2） CD34门中细胞数（控制非特异染色） CD34门中
细胞数≤10≤4μΙ≤5CD34 CD34 细胞绝数
（3）CD45SSC门中低 FSC 细胞CD34 绝数应显著改变
（4）CD45SSC 门左右变 10 道左右CD34 绝数应显著改变（检
验 CD45SSC 门设定
49
四DNARNA 染料CD34PECD45PC5+定量荧光微球检测
DNARNA 染料 FL1 中检测识核细胞流式细胞仪分析时作圈定
白细胞基础采标准 ISHAGE 方法进行 CD34PECD45PC5 染色分析绝定量微球
BD 机器 FL4 通道检测Coulter 机器 FL3 通道检测

1样准备
（1） 验证移液枪准确性离子水作标准品（吸取 100ul 离子水1mg）
吸取放精确称量器称量检测吸取量准确性通常新鲜样较容易分析固建
议样保存时间 48 时冷冻保存样推荐标需混匀形成涡流
（2）标量准确吸取关系整实验精确性反吸取法移
液枪时吸样钮
二档轻微吸取微球钮推第档微球排出留残余液体枪头弃
第次吸样时Tip 干会导致部分样粘附壁固建议吸样时先 Tip
头样中吹次吸取样检测试中加入 100ul 标
（3）相应试中加入单克隆抗体轻轻混匀室温避光孵育10分钟室温加
入100ul CalLyseTM(Caltag code #’s CAS010 and GAS010S100)混匀避光室温孵
育10分钟加入1ml离子水（室温）混匀孵育5分钟
（4） 机检测前工仔细Perfect Count微球混匀30~45秒钟（避免形成涡溜）
相移液枪加样方法已溶血样中加入100ul微球（微球量样量相）
（5）流式细胞仪检测前测附盖膜充分混匀30秒机
2仪器设置
（1） 程序色染色标调节仪器项参数建立相应检测方案
首先检测未染色（含标准微球）已溶血样设定前角散射光（FSC）阈值敏
感度检测微球须 FSC SSC 探测器进行额外调整PerfectCount 微球 FSCSSC
双参数散点图 FL1FL2FL3 FL4 中检测
（2） FSCSSC 双参数散点图中设立门包含白细胞亚群二群微球
3数获取
取精确数少收集 1000 微球时计数相应细胞数
4结果分析
（1） FSCSSC 双参数散点图中建立门A R1 圈定微球（AB 两种）
图 274 左图 FL2SSC 双参数散点图中显示 A R1门中颗粒细胞染荧
光 FL2 中微球干扰选 FL1FL3 FL4 荧光通道新建门B R2 圈定
微球时确保碎片图 274 中图
（2） FL2SSC 双参数散点图中显示 B R2门中微球新建门C R3
D R4 根两种微球 FL2 中荧光强度分圈定微球 A（FL2 弱荧光）微球 B
（FL2 强荧光）图 274 右图
检查仪器统计数微球说明书参数否致注明微球计数数量






50


图 274 DNARNA 染料CD34PECD45PC5+定量荧光微球检测造血干细胞


（3）建立新门圈定分析细胞群体注明分析细胞计数数量
（4）计算目标细胞绝数量根公式计算细胞群体绝数量：

流式细胞仪细胞计数数量
细胞绝数量（微升细胞数） ×流式细胞仪微球计数数量
已知微升微球数量

五CD34 计数质量控制：
CD34 计数检测中众素影响着计数准确性素通操作步骤
影响：① 量减少样处理步骤② 适标记抗体③ 选择适阴
性阳性标④ 收集足够细胞数降低变异系数⑤ 采标准设门分析方
案条没国际通标准清楚需 CD34 干细胞计数设立
广泛意标准减少中变异性现标准总结：

1样准备
Ficoll 淋巴细胞提取液富集单核细胞常会出精确评估数单核细胞
分离操作会导致外周血中 26骨髓中 21采集品中 5 CD34+细胞丢失现改
全血进行溶血红细胞

2溶血剂
溶血剂 CD34 阳性细胞明显阴性群体相区分

3样问题
血板会 CD34+ CD34细胞结合影响精确计数聚集血板会
CD34CD45 抗体微弱结合通巧妙设门方案

4CD34 抗体选择
荧光素标记 CD34 抗体 CD34 抗原 IIIIII 类位点结合CD34 抗
原位点根蛋白水解酶敏感性区分 III 类位点特异性抗体限
度提高检测敏感度现普遍推广 III 类位点结合抗体抗体效
种荧光素结合：FITCPEPerCPAPC PECY5

5阴性
选择恰阴性般选型免疫球蛋白作非特异性染色底
CD34 抗体染色标中目标细胞群少总细胞群 01目标细胞群
1时适合型作阴性外采参数设门技术区分特异性结合
群体CD34+细胞时表达 CD45 CD45SSC 双参数图中CD34+细胞淋巴单核
粒细胞相分离独立成群方案检测样中极少数细胞群时显格外重

6阳性
床检测中需检测阳性样检查操作程否正确作质控阳性 51
标般种表达 CD34 抗原细胞株制备够制备出抗原染色稳定适面广
储存方便效期长质控品减少实验室间实验室中变异实验技术许
流式标准微球达成目

7样获取
进行 CD34 干细胞计数时 CD34+细胞般占单核细胞 1固视作
泊松分布曲线变异系数 10左右值采集 100 阳性细胞采集
细胞数量根 CD34 细胞例决定般份样品收集 50000 75000 细胞进行分
析获较精确结果

8数分析
检测阳性细胞需进行双参数参数分析现分析方案目中
基原米兰方案修改通 CD34SSC 设门细胞碎片红细胞
聚集物阳性颗粒需满足：CD34 阳性表达SSC 信号较弱细胞独立成群学者
7AAD 染色死细胞 CD14 单核细胞方法分析首先设门选取 7AAD 阴性
细胞显示 CD34CD14 双参数图中中单核细胞方案中
CD34+细胞次显示 CD34SSC 图中分析相应型作较方案
修改 CD45 代 7AAD 设立白细胞门然进行分析
散射光图 右限：CD14+细胞 R3：CD34+细胞 R3：型

图 275 SIHON 方法分析 CD34+细胞

第八节 白血病细胞免疫分型

国际白血病诊断手段发展迅速单纯细胞形态学发展已形成形态学
(MorphologyM) 免疫学(ImmunologyI)细胞遗传学（CytogeneticsC）分子生
物学(Molecular biologyM)综合诊断尤种抗血细胞表面分化抗原单克隆抗体
研制成功白血病细胞免疫表型分析成单克隆抗体流式细胞仪结合更
短时间量细胞进行参数分析形态学检测难解决问题获满意答案
70 年代起法美英 7 位学者提出 FAB 白血病分型方案急性髓系白血病（AML）
分 7 亚型M1M7中 M1 原始细胞型占 10M2 原始细胞伴成熟分化型细胞占
40M3 早幼粒型占 10M4 粒单细胞型占 15M5 原始单核细胞型占 10M6 红
白血病占 5M7 巨核细胞型>5急性淋巴细胞白血病（ALL）分 B –ALL T –ALL
中 B 系分前 B普通 B 成熟 B 细胞型TALL 预差流式细胞术白血病
免疫分型提供较手段床诊断治疗预观察提供确切指标
52
标收集保存处理：
分型标 EDTA K2 K3 含防腐剂肝素抗凝外周血骨髓抗凝剂
选择视实验需定选肝素抗凝标适宜做遗传学分析 EDTA 抗凝
标保持细胞较形态胸水脑积液等标须抗凝中心实验室检测
标时新鲜标制作涂片
标须送处检测标需 24 时室温条件运送怀疑 Burkitt 淋巴
瘤白血病脑脊液标需时处理保存时间超 24 时（ 24~72 时）
标建议做细胞活性检查胎盼蓝染色做免疫分析标细胞活性度应
80长时间保存标注意会出现弱表达抗原丢失情况
保存 24 时标中加入适细胞培养物（ RPMI1640）
全血骨髓标提取单核细胞通溶血步骤便流式细胞仪检测简
化实验步骤时增加免疫分型危险性受 HIV 感染等标 NH4CL
低渗溶血试剂溶解红细胞该种试剂低限度降低细胞丢失率溶血程中
注意长时间溶血引起细胞 FS SS 信号改变丢失某细胞群溶血时间
够会导致红细胞溶解充分混入碎片造成正确检测结果
流式细胞仪仅检测细胞表面抗原通运商业破膜固定剂流式细胞仪
检测细胞胞浆细胞核抗原破膜固定剂性值信赖特检测
胞浆抗原时特注意确认试剂会影响细胞光散射信号样时检测细胞表
面膜胞浆细胞核抗原注意破膜固定剂适合检测细胞核抗原 TdT
适合检测胞浆抗原项专门评测四种商业破膜固定剂报告指出：FACS
Permeabiliazion solution (Becton Dickinson)Fix and Perm cell permeabilisation kit (Fix and
Perm Caltag) Optilyse B lysing solution (Immunotech) Permeafix (Ortho)细胞光散射信号
影响Fix and Perm Permeafix 两种试剂检测核酶 TdT胞浆抗原 CD3胞
浆免疫球蛋白出结果荧光显微镜出结果相致
阴性（型）处理方法标处理方法样检测细胞分离单
核细胞时加入免疫球蛋白阻断 FC 受体全血样骨髓需检测胞浆
抗体诊断急性白血病偶见源浆细胞淋巴细胞疾病着重意义许
髓系淋系标志性抗原出现胞浆细胞分化前期 CD3 T 细胞标志
物CD79a B 细胞标志物MPO 髓细胞标志物检测细胞抗原通载
固定单核细胞载玻片全血骨髓样涂片进行免疫荧光染色荧光显微镜
进行检测通免疫组化方法现通流式细胞进行检测简单样处理程
化观素出精确结果

二单克隆抗体选择：
（1）急性白血病免疫分型单标记抗体选择
流式细胞检测常单克隆抗体均异硫氰酸荧光素（FITC）藻红蛋白（PE） PerCP
标记直标抗体B 淋巴系统单抗 CD10CD19CD20CD22 等T 淋系单抗 CD2
CD3CD5CD7 等髓细胞系统（髓系）单抗 CD13CD14CD15CD33 等干细胞
巨核细胞系单抗 CD34CD41CD61HLADR 等抗体系白血病诊断
价值积分见表 281

表 281 种单抗诊断白血病积分
分 数 B系 T系 粒单系 巨核系 红系
2 mcCD22 mcCD3 MPO CD41 血型糖蛋白 A 53
cCD79a mcTCR cCD13 CD61 HbF
1 CD19 CD2 mCD13 CD36 CD71
CD20 CD5 CD33 CD36
CD23 CD8 CDw65
CD10 CD7 CD11bc
05 TdT CD4 CD14
HLADR CD1a CD15
CD117

（2）急性白血病已双标记抗体组合双标记抗体：
CD3CD19：区分 T 系 B 系
CD10CD33（CD20CD13）：区分髓系B 系诊断混合型白血病
CD41：巨核系标记
CD34HLADRCD9：述抗体结合鉴未分化型急性白血病
MPO（髓系氧酶）：胞浆染色 M0 诊断
GPACD36： M6 诊断（GPA+CD36+早期红系细胞GPA+CD36
成熟红细胞）
T 系尚应做 CD7CD4CD8 等检测
髓系应作 CD14CD15（M4 M5 时阳性）
巨核系加作 CD42aCD42b

(3) 白血病免疫分型常规抗体方法：
① 先做四组标志物初筛：CD45PerCPIgG1FITCIgG1PECD45PerCPCD5FITC
CD7PECD45PerCPCD10FITCCD19PECD45PerCPCD13FITCHLADRPE
② 结果确定髓系白血病时加做 CD45PerCPCD33FITCCD34PECD45 PerCP
CD14FITCCD15PECD45PerCPCD41FITCCD61PE确定 M1M2M3
M4M5M6M7
③ 结果确定淋系白血病时加做 CD45PerCPCD20FITCCD22PE CD45
PerCP CD4FITCCD8PE确定 T B 淋巴细胞性白血病

三免疫表型分析检测程序：

（1）细胞表面抗原检测染色方案：
① 取 20 单克隆抗体 100µL 抗凝血混合置室温 20min
② 加溶血素 1500µL置室温避光 15min2500rpm 5 min
③ 弃清加 1500µL PBS混匀2500rpm 5 min
④ 操作 1 次仪器检测： CD45PerCPSSC 设门观察群细胞免疫表型

（2）细胞胞浆细胞核抗原检测染色方案：
① 试加入染膜外抗原单抗阴性试中加入约 1×106 细胞混匀
避光孵育 15 分钟
② 室温加入 100ul 试剂 A避光孵育 15 分钟
③ 3mlPBS+01NaN3+5FBS 洗涤 1 次300~500g 离心 5 分钟清 54
④ 加入 100ul B 液相应膜标记抗体阴性
⑤ 混匀 2~8 度孵育 20 分钟3ml PBS+01NaN3+5FBS 洗涤 1 次
⑥ 300~500g 离心 5 分钟清 05mlPBS+01NaN3+5FBS 重悬
⑦ 机分析
四仪器分析结果判断：
标 CD45 荧光单抗标记 SSC vs CD45 图中白细胞血板红细胞碎片
相区分时设门选定细胞分析分析表达弱抗原时 CD34获准
确结果 CD45 阳性细胞数目求然 CD45 阳性细胞具体数目实验
室采取标准相范围 10×103 10×106采取 CD45 设门检测时计数 CD45
阳性细胞例保证足够细胞分析实验采取 CD45 设门检测必：
CD34 干细胞计数分析发性骨髓瘤中异常浆细胞浆细胞疾病检测数量少
细胞群体溶血失败标常规检测中 CD348NK 需 CD45
设门表达分化阳性细胞≥20时阳性表达根种单抗诊断白血病分型积分
型白血病诊断标准见表 282：




表 282 急性白血病免疫学系列分型
系 列 积 分
类 型
B 系 T系 粒单系 巨核系 红系
1单表型
纯 BALL >2 0 0 0 0
纯 TALL 0 >2 0 0 0
纯 AML 0 0 >2 0 0
纯 AMLM6 0 0 ≦2 ≦2 >2
纯 AMLM7 0 0 ≦2 >2 ≦2
2单表型
My+BALL >2 0 ≦2 0 0
My+TALL 0 >2 ≦2 0 0
Ly+AML ≦2 ≦2 >2 >2 >2
T+BALL >2 ≦2 0 0 0
3双表型双克隆型
TB >2 >2 0 0 0
TM 0 >2 >2 0 0
BM >2 0 >2 0 0
4未分化型
AUL ≦2 ≦2 ≦2 ≦2 ≦2
注： My+： 髓系抗原阳性 Ly+：淋系抗原阳性


五白血病免疫分型床应
流式细胞术进行白血病免疫分型抗体组合少根分析目疾病表达
特异性标记确定果检测目仅出断结需选急淋慢淋相关
特异性抗体组合便诊断出数病例理想状态标中分加入二种三种标记
抗体需中加入标记设门抗体衡定分析某群细胞 55
1急性白血病：
少数抗体认系特异性胞浆染色：髓系胞浆MPO
B细胞系胞浆CD22T细胞系胞浆CD3现 MPOCD3CD22双标试剂已商业化
直接购买试剂盒诊断急白程中必须细胞固定检测指标实验表明Fix &
Perm固定破膜剂检测指标（MPOCD22CD3TdTκ λ免疫球蛋白轻链
µ重链）时结果固定破膜剂检测胞浆抗原适情况：
① 表达细胞系特异性抗原细胞表达通常确诊抗原举例说明病例
MPO阴性急性白血病时细胞时表达三种髓系抗原CD33CD13CD65s指
标提示病例髓系白血病（AML）注意急淋病例中会出现CD33
CD13CD15缺失表达CD65s情况MPO阴性病中表达CD117支持髓系白血病诊
断急淋伴CD117表达情况十分罕见MPO阴性病例注意否伴红细胞
白血病巨核细胞白血病性会改变疾病预情况CD34HLADRTdT
标志物具系特异性通常评估细胞成熟度必须注意运
破膜剂检测AML病例TdT表达需直接荧光标记TdT抗体检测

②CD11bCD24检测髓细胞成熟度方面非常正常单核细胞系单核系
白血病细胞（通常CD14+）髓系白血病细胞（CD11b+AML通常CD14—）般表达
CD11b+HLADR+髓系细胞成熟度：骨髓中中幼粒细胞晚幼粒细胞早幼粒
细胞外周血中成熟粒细胞通常通CD11b阳性HLADR阴性情况加区分早幼
粒细胞白病中HLADRCD34阳性肿瘤细胞表达CD11b表明细胞较幼稚
CD24阴性CD24表达绝数正常髓细胞包括早幼粒细胞然急性髓系白血
病细胞早幼粒细胞白血病细胞表达正常异常单核细胞表达相CD24
③病例标量限时采系特异抗体重标志精减分
型方案进行分析精减B系ALL甚少包括CD10胞浆u两具预
意义重指标精减AML分型方案包括CD11a作区分APL（阴性）NK样AML
效指标
④ KORSA3544 抗原检测床意义 正常外周血中仅表达粒细胞表面淋巴
细胞红细胞血板表达急性白血病中KORSA3544 单克隆抗体 Ph1 阳
性急淋患者反应培养细胞系中KORSA3544 Ph1 阳性 ALL 细胞系反应（55）
时 11q23 易位白血病细胞系（311）淋巴细胞白血病中KORSA3544 Ph1 阳性
急淋患者反应（2626）部分普通 ALL 反应（538）1 例 11q23 易位早前 BALL 反应
外周血淋巴细胞反应正常成熟粒细胞强表达 KORSA3544 抗原髓系白血病
中KORSA3544 仅 FABM2 中部分表达（1656）明显 MDS 转变白血病
外KORSA3544 类型白血病中表达慢粒急变时表达KORSA3544 识
白血病细胞系膜 1 90Kda 抗原KOPN57bi正常骨髓中没发现 CD19+
KORSA3544+细胞 Ph1 阳性 ALL 两种抗体反应非常强KORSA3544 应仅
诊断 Ph1 阳性 ALL检测缓解期微残留病

2慢性白血病：
慢性淋巴细胞白血病分型目区分T系B系次检测B系细胞
否表达表面免疫球蛋白轻键通B系特异性抗原CD19κλ轻键抗体检测
检测中需注意细胞血浆免疫球蛋白结合非特性染色
慢性髓细胞白血病免疫分型时发现处慢性期异常细胞部分幼稚细
胞CD34阳性固建议慢性期病运CD34作设门单抗进行检测出现原始细胞危 56
象时需运急性白血病分型方案分型
果研究新白血病亚型预价值标志物采更精细分型方案分析样
方案研究样否系混合否表达某粘附分子标志物果
检测病化疗微残留病灶检测需进行发现急淋细胞表达髓系
抗原疾病预方面没意义该现象作监测病进入床缓解期残留白血病细
胞力工具

六流式细胞术白血病免疫分型注意事项：
1检测标混正常细胞异常细胞结果解释需结合床指征细胞形态学检测
报告细胞标志物结果时考虑许免疫标物非严格系特异性 CD7
T 细胞系标志物部分 AML 病例中表达
2 常单抗常检测免疫标志物需做阴性阳性检验
单抗效价溶血步骤程起新单抗仪器新校准新技术运必须
执行阴阳性已知表达表达某标志物白血病细胞正常细胞标中
正常细胞作工作量高实验室意义明确单抗需阳性阴
性正常范围值
3 做流式细胞仪检测时量直标抗体实验室制定相应抗体浓度相
应溶血步骤抗体滴定阴性阳性标进行然生产厂商说明
说明书操作
4进行免疫分型分析前操作者接受相关培训
5 某抗原阳性标准现没统标准通常急淋细胞中表达超 20白
血病细胞阳性慢淋中 30白血病细胞阳性便报告该抗原阳性然标准
意性许实验中运某情况标志物肿瘤细胞白血病细胞表
达意义总单核细胞表达典型情况 CD5 慢淋中 B 细胞表达 Kappa
Lambda 群 B 细胞群体表达
6实验室常做质控程序

七急性白血病微残留病检测
白血病微残留病(minimal residue diseasesMRD)指白血病诱导化疗获完全缓
解骨髓移植治疗体残留少量白血病细胞状态般形态学方法已难
检出白血病细胞存残存细胞成白血病复发根源称白血病微
残留病微残留病变流式细胞术检测方法包括 DNA 异倍体法免疫表型分析方法前
者灵敏度较低三分 BALL 10 TALL AML 患会出现异倍体白
血病细胞者敏感度达 104

1流式细胞术免疫表型检测 MRD 原理
白血病免疫表型分析结果表现白血病相关表型系列抗原交叉表达抗原表达步
抗原高低表达异常蛋白表达BALL 白血病细胞免疫表型结果：CD19 100
CD19+CD10 889 CD34 944 HLADR889 CD13 333 CD33 111 CD5 –0
CD70ANLL 白血病细胞免疫表型结果：CD19132 CD277 CD7220 LyAML
571CD7+AML M1M2M4M5 M1 467CD19+AML
M2M5分 158 250571 AML 淋系抗原表达治疗前较表达相
抗原细胞占细胞百分率 MRD
2微残留病检测意义： 57
（1） 早期判断药物治疗效果
（2） 评估恶性细胞数预期白血病复发
（3） 骨髓移植时评估移植物质量
（4） 判断恶性细胞否侵犯器官
第九节 定量流式细胞术

细胞表面分子定量分析

传统流式细胞分析方法仅提供关细胞表达抗原频率信息通细胞表面抗
原参数分析细胞分种亚群阳性群体指抗体荧光表达高阴性
群细胞通种方法容易计算细胞群含量通常报告设门阳性阴
性细胞百分含量已知体积含量参考微球报告细胞绝计数均荧
光强度研究显示检测表达抗原细胞出现频率必进行细胞抗原表达密
度检测尤细胞抗原表达量致时需标准方法检测细胞标志表
达水群细胞荧光表达常常表现阴性强阳性连续变化典型表现活化相
关抗原：CD38CD69HLADRCD25CD122CD95 检测变化常强阳性
弱阳性表示种定性表示会仪器实验室变化细胞
荧光定量技术测定项细胞荧光分子绝数量换算细胞抗原表达量
细胞荧光强度检测标准化统仪器实验室检测结果流式细胞仪
初针定量特定细胞群数量设计然真正迅猛发展开始 20 世纪 90 年代
短短十年定量流式细胞术已广泛应医学床实践
定量流式细胞术（Quantitative FCMQFCM）通检测标准微球荧光强度获标
准曲线通标准曲线（方程式）求测细胞某种生物分子精确数值反映
某种生理病理条件测细胞出现微细改变床疾病研究诊断治疗等重
意义QFCM 分两种特定细胞群绝计数 CD4+T 细胞绝计数类
细胞特定抗原表达数量血板 CD62p 抗原表达量前种较简单仅
需已知浓度荧光微球仅适合定量细胞表达量较致表达量较高阳
性区阴性区够明显区分抗原 CD3CD4CD8CD19 等种方法目前
常客观具床应价值定量技术










图 291 CD4 细胞阳性百分传统检
测方法



CD3 FITC
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 58











图 292 CD4 阳性细胞定量分析原理

1相关术语：
（1）相荧光强度(Relative Fluorescence IntensityRFI)：指荧光强度相值表示
流式直方图（Histogram）荧光道数(Channel)
（2）等量溶性荧光素分子（Molecules of Equivalent Soluble FluorochromeMESF）：指
荧光分子标准溶液中重法测荧光分子绝数该标准溶液环境
pH 值离子强度等均固定没荧光分子淬灭素存应 MESF 时
种标准参数衡量种荧光分子荧光量
（3）蛋白结合荧光分子数（FluorochromeProteinFP）：指蛋白分子结
合荧光分子数流式细胞术中通常表示抗体分子结合荧光分子数 FITC
FP 般 3～10PE FP 般 1
（4）抗体结合容量（Antibody Binding CapacityABC）：指细胞结合抗体数量值
通 MESF FP 值计算出
2染色细胞荧光分子选择
标准微球标已知数量 PE 分子流式细胞仪检测 PE 染
色细胞灵敏测定细胞荧光强度PE 荧光非常亮会淬灭非常理想细
胞荧光分子定量试剂
3BD 公司推出——QuantiBRITE 系统：包括
（1）QuantiBRITE PE 微球——种水溶性球含标记定量 PE 分子标准微球
四种 FL2 荧光水群体组成QuantiBRITE PE 微球： 4 种 PE
标记水标准微球组成水溶性球流式细胞仪根 PE 分子数量进行
FL2 标准曲线测定已知 PE 分子抗体结合量 PE 分子数量计算出细胞
结合抗体量 ABC）
（2）QuantiBRITE——CELLQust 软件（31 版）中定量标准测定计算 PE
分子荧光定量标准曲线
（3）QuantiCALC——流式细胞仪分析软件报告细胞结合抗体量(ABC)
4QuantiBRITE PE 微球荧光分子含量确定：
（1）种荧光测定方法检测微球结合 PE 分子数：荧光仪检测已知
含量 PE PE 标记标准微球荧光强度确定标准微球 PE 分子数通滤光镜
光散射影响适校正微球 PE 荧光影响
（2）碱性磷酸酶：PE 结合物酶活性已知量 PE 关系校正荧光方法
微球荧光分子数种 PE 结合物微球结合通检测已知数量微球酶活性计算 59
出微球 PE 含量种方法受微球影响流式细胞仪检测表明二种方法检
测结果致
外通染色细胞校正荧光方法微球 PE 荧光分子数外周血单核细胞
（PBMC） CD4PE 反应通荧光仪直接检测染色细胞通结合曲线 Scatchard
分析确定淋巴细胞 PE 分子量两种方法微球荧光分子数结果接
流式细胞仪测定结果相差 10种方法独立准确标定荧光分子
定量标记 PE 标准微球
5具体检测方法：
QuantiBRITE PE 标准微球含叠氮钠 5BSA PBS 缓液配制成适
LyseNo Wash 试验获取设置时阴性细胞处左边四组标准微球阳性区域序分
布保证 4 组微球完全例分布采获取设置流式细
胞仪进行检测时QuantiBRITE PE 标准微球标应样仪器获取设置FSC
SSC 影响荧光检测进行更改
（1）定标：CELLQuest 中荧光分子定量功 QuantiQuest通计算 FL2 PE
分子数拟合线性关系 ymx+c直方图分析标准微球线性荧光强度该批
QuantiBRITE PE 标准微球定荧光分子含量做数回标准曲线
（2）细胞 PE 荧光分子含量：测量细胞 FL2 线性荧光强度标准曲线计算
PE 染色细胞 PE 分子数
例：细胞线性荧光强度 1034 log10343015
标准曲线 y1003x1677
解 y1003x1677
y4678lg (PE copy number)
PE copy number47 598 PE moleculescell
注意阳性细胞须扣细胞空白（阴性细胞）报告 PE 荧光分子数（PE copy number）
已扣标准微球发荧光标准微球身荧光阴性细胞群非常接
计算荧光分子数时需扣标准微球细胞底
（3）细胞抗体抗原数量：果已知抗体结合 PE：mAb 值
细胞 PE 荧光分子数计算出细胞抗体结合量果 PE：mAb 值 1：1
细胞 PE 荧光分子数细胞抗体结合量理讲果已知抗原抗体结合
化学计量确定细胞抗原表达量：CD4PE（Leu3aBDIS）实验证明
该克隆抗体淋巴细胞 2 抗原位点结合细胞 CD4PE 抗体应 2 倍
CD4 抗原分子通常抗原抗体结合化学计量需实验证明 QuantiBRITE 系统中
计算报告单位 ABC细胞抗体结合量间接反映细胞抗原表达
（4）QuantiQuest：CELLQuest 获取分析软件进行荧光分子定量试验定标
QuantiBRITE PE 标准标准曲线QuantiQuest 功获取数文件动确定
标准曲线斜率截距QuantiCALCl 软件根标准曲线动分析结果CELLQuest
软件中定量获取文件（Qnantitation Acquisition Document）获取 QuantiBRITE PE
标准微球某特定试验中获取标准微球样荧光补偿设置必须致项
数文件线性拟歙发析信息会 QuantiCALC 软件动分析
（5）QuantiCALC 该软件荧光强度检测标准化荧光分子定量分析
CELLQuest 软件中 QuantiQuest 获取标准曲线数文件传统荧光强度分析常弱阳
性中阳性强阳性表示 QuantiCALC 定量分析荧光强度提供标准分析方法
设定 FL2 界值选择界值计算细胞 PE 分子数确定界值间细胞频
率分布 60

6影响 PE 荧光分子定量素
（1） 试剂——PE：mAb 荧光试剂结合率：流式细胞仪 QuantiBRITE PE 标
准微球标准曲线分析细胞结合 PE 分子数已知 PE：mAb 结合率
通细胞结合 PE 分子数进步细胞抗体结合量（ABC）果例 1：
1产品 AF 荧光含量均低 BDIS 抗体荧光抗体结合率低纯 1：1 结合
荧光抗体素导致差异分析表明BDIS CD4 PE 抗体绝部分 1：
1 荧光素结合（约占 90）抗体 AF 等量 1：1 1：2 荧光抗体荧光
抗体纯度够会影响细胞荧光分子定量分析结果观察PE 抗体结合PE
缓慢分解抗体 4℃保存 1 年信号会降 537℃条件PE 会加速分解
（2）标制备——固定染色降低控制：细胞固定采聚甲醛固定固定标
荧光信号降 30流式细胞仪做数分析时易发现差异做细胞 PE 含量
线性分析时结果会显著差异会显示两克隆 CD4PE 抗体标固定
荧光强度时间变化降低两种抗体变化说明荧光猝灭外
影响素① Leu3a Fab PE 抗体染色细胞固定荧光强度减弱较该抗体
亲力较低② 溶性 Leu3a PE 抗体染色细胞固定 3h 荧光强度基变化
③ 某 PE 标记抗体（ CD64克隆 101）染色细胞固定荧光强度非常稳定
聚甲醛导致 PE 染色细胞荧光信号快速降抗原抗体作
相互干扰造成荧光抗体会荧光强度降需 ABC 定量分析进行固
定效应控制
（3） 仪器：仪器 QuantiBRITE PE 标准微球淋巴细胞 CD4PE 荧光
分子数进行测定台 FACSCaliburh 测定结果误差低±2仪器间误
差±5（5 台 FACSCalibur）
细胞生物学研究中常常细胞膜分子胞分子表达产物进行定量半定量
检测研究细胞中某蛋白（细胞子趋化子炎症介质等）表达水较低
细胞裂解液培养清进行述蛋白定量检测长期采精度相较低传统方式
（ ELISAWestern Blotting）传统方式受灵敏度特异性局限难准确检测
蛋白蛋白定量检测迫切需新技术集计算机技术激光技术电子技术流体力
学细胞生物学细胞免疫学单克隆技术体革命性流式细胞术基细胞膜分子
胞分子实现快速准确灵敏单细胞分析典流式细胞术必须赖完整细
胞流式细胞仪应目前局限细胞定型分选年科学家基芯
片检测原理利流式细胞仪作检测台 ELISA 技术改进延伸建立 CBA
LiquiChip 等针研究需液相检测技术

二Cytometric Bead Array (CBA)：
年发展起 CBA 种液相系统中测物结合类似细胞颗粒利
FCM 进行蛋白定量液相蛋白检测技术芯片概念流式细胞仪机结合起
想法初付诸实践 20 世纪 90 年代中期研究者生物分子标记带荧光微
球体微球体液相系统中完成生物检测反应时没专检测台
检测工作利流式细胞仪完成段时间研究疑续发展坚
实基础BDPharmingen 公司推出 CBA样微球体反应载体液相中
完成反应检测系统检测原理 LabMAP 技术相整系统包括仪器控制软件 61
细胞子检测试剂盒里检测仪器传统流式细胞仪样更方
便BD 公司开发流式细胞仪配套动样系统更方便微孔板中动连续
样传统意义讲流式细胞术通检测细胞表面细胞抗原细胞进行计数分
型分选流式细胞仪（FCM）仅类似细胞颗粒物荧光颜色进行分析
物质（液相蛋白等）力年发展起 CBA 种测物结合类似细
胞颗粒利 FCM 进行蛋白定量液相蛋白检测技术
1CBA 作原理






图 293 CBA 反应微球探针复合体结构模式图

CBA 具荧光强度包特异性捕获单抗（Capture Antibody）捕获微
球（Capture Bead）群组成CBA 微球提供针某特定蛋白捕获表面
ELISA 板包孔加入测样微球捕获抗体相应液相蛋白结合
加入荧光标记检测单抗（Detection Antibody）形成三明治’夹心复合物（见图
293）流式细胞仪 FL2 通道检测荧光信号定量溶性检物时检测种液相
蛋白物质（见图 294）











图 294 CBA 技术反应原理图

2CBA 技术传统 ELISA 相列优点：
（1）CBA 需样体积仅 ELISA 分析必需样量 16（2）CBA 灵敏度达
27pgml ELISA 通常 20100pgml（3）CBA 致性稳定性更符合细胞子检
测国际标准（美国 NIBSC gold 标准测试）（4）标准品混合物做次流式检
测样中种分析物相应标准曲线（5）避免酶联放技术信号失
Antibody coupled beads
emitting at distinct FL3
intensities
Various
Antibody coupled PE label
emitting at FL2 intensity
proportional to analyte conc 62
真导致假象（6）CBA 实验时间单次 ELISA 缩短提供需做 6 次 ELISA
结果
3CBA 技术操作（ BDPharmingen 公司 Th1Th2 例）：Th1Th2 CBA Kit 包
含具荧光强度 6 微球群分包针 IL2 IL4 IL5 IL10 TNFα
IFNγ 特异性捕获抗体述捕获微球 PE 标记检测抗体混合重组标准品
测样孵育形成三明治复合物 FCM 采集样数BD CBA 分析软件图表
形式产生分析结果（见图 295 表 291）
图 295 TH1TH2 细胞子 CBA 检测结果

TH1TH2 细胞子 CBA 中种抗体优化严格测试传统ELISA
技术相灵敏度恢复度稀释线性度特异性准确性提高
CBA 检测灵敏度表

表 291 细胞子均荧光强度标准差灵敏度分析








外 TH1TH2 细胞子 CBA 次仅重组细胞子蛋白做分析结果捕
获微球群未发现交叉反应背景表明 CBA 检测具极特异性

第 10 节 流式细胞术相关指标中应
63
RNA 含量样品制备方法

派宁 Y（Pyronin YPY）荧光染色法：PY 种硷性荧光染料细胞浆
核仁中 RNA 进行特异性结合RNA 核苷酸链单链结构呈现出红色荧光
流式细胞术进行单参数定量 RNA 种极荧光染料激发波长 488nm 相匹配发
射波长 580nm然 PY 解链 DNA 单链结合 PY 荧光染色 RNA
时避免 DNA 解链效应干扰
1试剂配制：
① PY试剂配制：PY 10g 100ml 蒸馏水溶解配成母液置 4℃冰箱保存PY 工
作液：取 1ml PY 母液加入 1nolL pH47 醋酸缓液 100ml稀释 001浓度
② 10 molL pH47 醋酸缓液配制：冰醋酸 1155ml 加蒸馏水 1000ml水醋酸钠
164g 加蒸馏水 1000ml分取述两种液体 255ml 245ml加入 200ml 蒸馏水成
③ 配制 pH72 磷酸缓液
④ DNA 酶消化液制备：DNA 酶 005mgml025molL 枸橼酸25mmolL TrisHCl调
pH 60
2染色程序：①制备单细胞悬液浓度 1×106ml②加入 DNA 酶液 05ml37℃消
化 20 min弃 DNA 酶③加入 001 PY 工作液 10ml 室温染色 30 min 离心沉淀
（800prm5min）④染色液 PBS 液洗 3 次加入 10 ml PBS机检测
3检测分析： Cellquest 软件程序获取 20000 细胞 ModiFit LT 软件分析细胞 RNA
含量RNA 含量 RNA 指数（RNA IndexRI）表示 RNA 直方图RI（检测
细胞峰荧光道数正常细胞峰荧光道数）×10值 RNA 指数RI DI 相区
×10 表示

二蛋白质总量样品制备

测定细胞总蛋白量够检测细胞群体生长代谢状态区具蛋白质
含量恶性肿瘤时肿瘤细胞蛋白质总量增加
1检测原理：异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanateFITC）检测细胞总蛋白量常
荧光探针酸性染料价键方式结合蛋白带正电核基蓝色激光
激发发出明亮绿色继发荧光绿色继发荧光强度细胞蛋白质含量成严格正
相关关系
2染色方法：：取 20 mg 异硫氰基荧光素加 20ml 水酒精 FITC 充分溶解染
色液原液保存 4℃冰箱具体荧光染色步骤：① TITC 贮存液稀释：
pH 74 PBS 液稀释成 50μg ml 浓度工作液备② 染色细胞首先 70酒精
破膜10imn FITC 染料进入细胞中③ 离心法 PBS 液洗破膜剂离心收
集细胞④ 取 FITC 工作液 2ml 加入样品中混匀置 4℃冰箱中反应 30 min ⑤
PBS 液 1500prm 离心 5min洗染色液离心清⑥加 05 ml PBS混匀
机检测
3检测分析： Cellquest 软件程序获取 20000 细胞 ModiFit LT 软件分析细胞总蛋白
质含量蛋白质指数（protein IndexPI）表示蛋白质直方图PI检测细胞峰荧
光道数正常细胞峰荧光道数值

三网织红细胞样品制备
64
1染色原理
网织红细胞种未完全成熟红细胞细胞成熟程中胞浆中 RNA 含量逐渐
血红蛋白取代检测红细胞中 RNA 含量少代表红细胞成熟程度
成检测网织红细胞重方法网织红细胞计数判断骨髓红细胞系统造血情况
溶血性贫血时量网织红细胞进入血循环网织红细胞高达 020 更高急性失
血 510 天网织红细胞达高峰2 周恢复正常典型生障碍性贫血病例网织红细
胞百分常 0005网织红细胞数低 5×109L 诊断生障碍性贫血标准网织红
细胞升高：表示骨髓红细胞增生活跃见种急慢性失血溶血治疗效类增生
性贫血缺铁性贫血溶血性贫血巨幼细胞性贫血等等贫血治疗中非常价值监
测指标网织红细胞减低：见种骨髓增生力低疾病尤见重型生障碍性贫
血等

2样品制备
（1） 抽取全血 05ml注入盛 05ml 01molL EDTA 溶液中
（2） 微量取液器取 50μlEDTA 抗凝血置离心中加入 Good¹s 缓液 50ml
离沉淀 1000 rpm5min连续洗 3 次
（3） 沉淀细胞加入 10ml 枸椽酸钠缓液轻轻振荡悬浮
（4） 悬浮液缓慢注入盛 4ml 01戊二醛缓液中固定 15min
（5） FCM 前 PBS 洗固定剂加入 05ml 001派宁工作液染色 30min 离
心沉淀染液1500 rpm5 min
（6） PBS 洗次离心 1500 rpm5min清 PBS 细胞悬浮机检测
3检测分析
运数放前侧散射光信号区分红细胞血板采集足够数量细胞
进行分析般网织红细胞低总红细胞 05少采集 50000 颗粒进行分析减
CV 值建立 FSC vs SSC 双参数直方图运数放设门圈定红细胞检测样
单参数直方图中分析红细胞门中细胞注意分析直方图细胞群体
会偏移成熟红细胞度染色造成检查强荧光表达区域强阳
性颗粒颗粒标中核红细胞着色形成成熟红细胞核红细胞间设
立适线性门（高成熟红细胞低核红细胞）统计网织红细胞例必
设立线性门统计成熟度网织红细胞百分根荧光强度网
织红细胞分成低荧光强度网织红细胞（Low Fluorescent Reticulocyte 简称 LFR）中荧光强度
网织红细胞（Middle FluorescentReticulocyte 简称 MFR）高荧光强度网织红细胞（High
Fluorescent Reticu1ocyte 简称 HFR）部分幼稚网红显示强荧光反成熟红细胞极
少没荧光

4床典型应
（1）骨髓移植(BMT)：评估 BMT 红细胞生成情况HFR 计数提供早期测量
时监测单核细胞水更精确实际
（2）贫血：网织红细计数分类作鉴诊断初筛指标
（3）海洋性贫血：贫效造血红细胞寿命缩短特点网织红细胞计数 HGB
水变化相反轻度贫血非贫血病网织红细胞增长非常细微手工计数察觉
精确动计数技术明显
（4）骨髓增生异常综合征（MDS）
般说MFR HFR 前进入循环暗示红细胞生成规律性恢复开始LKuse 65
认：少量 MFR 作 MDS 化疗粒系恢复早期指标 RET 绝值更敏感
（5）放疗化疗：通流式法网织红细胞分析获骨髓增生特红系增生放化
疗细胞毒副作信息造血反应中（叶酸 VitB12）治疗化疗造血恢复中
见网织红细胞短暂迅速增高 HGB 降组织氧化受阻时EPO 生成增EPO 促
干细胞原始红细胞分化加速网织红 细胞释放EPO 增加HFR 增伴
网织红细胞增化疗骨髓 EPO 功恢复早期 HPR 增网织红细胞总数恢复早
种反应时间体现 EPO HFR 间密切关系末梢血网织红计数优白细胞计
数血板计数分析骨髓造血状态
（6）抗贫血药疗效观察：网织红细胞作疗效观察指标骨髓增生功良病
予关抗贫血药物网织红细胞 1 周左右百家高峰贫血严重网织红细
胞数升越高升高红细胞恢复前贫血病抗贫血治疗程中果网
织红细胞见升高说明该种治疗效骨髓造血功障碍网织红细胞计数贫血
病常访检查项目缺铁性贫血铁剂治疗效时网织红细胞明显增
红细胞血红蛋白逐渐增高网织红细胞降种网织红细胞反应作抗贫血治疗
疗效判断
四外周血 CD4+细胞 CD45RACD45RO 表达
CD45ROCD45RA 白细胞抗原 CD45 两类亚型 CD45 肽链胞外区氨基端三
外显子发生旁路剪接导致缺乏三种外显子型称 CD45RO仅表达外显子 A
型称 CD45RAT细胞表达 CD45 亚型功差异定关系通常CD45RO 阳性
T 细胞记忆 T 细胞（memory T 细胞）CD45RA 阳性童贞 T 细胞（naïve T 细胞）1
生物学特性：
① 胸腺细胞：CD45RACD45RO → RARO+ → RA+RO（脐血 T 细胞占 90）胸腺
中淋巴细胞成熟进入血液循环 CD45RA+（ naïve T 细胞）
② 外周血中CD4+CD45RA+T 细胞接触抗原刺激转变 CD4+CD45RO+ T 细胞
③ CD45RA+ CD45RO+两类 T 细胞分泌淋巴细胞子力 抗原刺激
CD45RA+细胞增殖CD45RO+细胞发挥效应

2床意义：
① 骨髓移植：骨髓移植病中 CD45RACD45RO 衡持续 4～10 年CD34+分选造
血干细胞移植未分选干细胞移植受体较前者外周血 TB 细胞恢复延迟移植
先两月两组病循环 T 细胞 CD45RO+细胞前组移植 2～3 月CD45RA+细胞
逐渐增高表明成熟 CD34+造血干细胞产生 NaiveT 细胞
② SLE：床症状出现短期数 T 细胞表达 CD45RA 静止 T 细胞者已接触抗原
CD45RO 弱阳性早期 T 细胞然着疾病活动期延长CD45RO 强阳性 T 细胞开始增
加活动期 SLE 病中静止 T 细胞扩增疾病中作胜记忆 T 细胞反应 ③ 葡
萄膜炎：患者房水中 CD4+淋巴细胞百分明显较外周血高 Naïve T 细胞百分显著
低外周血记忆 T 细胞高外周血房水中 Fas 抗原表达记忆细胞Fas+记忆 T
细胞涉葡萄膜炎致病机理
④ ITP：急性特发性血板减少性紫癜（ITP）患慢性 ITP 患组更高
CD45RA 更低 CD45RO差异年龄关
⑤ CD45RACD45RO 年龄变化：老年组 CD4+T 细胞表达 CD45RO 超 CD45RA
年轻组中正相反

五外周血 CD4+细胞 CD40CD40L 表达 66

CD40CD40L 通路继 CD28CD8086 受重视刺激分子通路CD40CD40L
通路体液免疫中具重作CD40CD40L 间相互作促进 B 淋巴细胞增殖产
生免疫球蛋白必须CD40 广泛分布体种细胞表达 B 淋巴细胞CD40L
表达活化 T 淋巴细胞
1生物学特性：
① 刺激子传递第二信号
② 延长 APC 寿命机制通 CD40L 通路抑制发 活化诱导细胞死亡（AICD）
体外培养发现CD40 信号增强单核细胞 DC 细胞生存力
③ 分泌诸：IL12IL1TNFαIL6IL8 等细胞子
④ 增强单核细胞肿瘤杀伤活性
⑤ NO 合成
2床意义：
SLE： 正常情况CD40L 仅暂时性表达激活 T 淋巴细胞表面 CD40L 持久表
达活化身反应性淋巴细胞免调亡导致身免疫性疾病发生SLE 患者血
清中存溶性 CD40L滴度明显高组正常群疾病严重程度相关肾炎
高蛋白血症中枢神系统受累者更高 sCD40L 滴度

六Th1 细胞 Th2 细胞检测

1基概念：
Th 细胞：辅助性 T 细胞根分泌细胞子力分 Th1 Th2
Th1 细胞 Th2 细胞分泌细胞子抗原递呈细胞相互作关系见图 2101
21022103

Th1细胞： 辅助细胞免疫介导迟发型超敏反应
分类标准：分泌细胞子IFNγ（标志性细胞子）TNFβIL2
标记：CD3CD2TCRCD4（通常）LAG3
细胞功：活化Ⅰ型免疫效应细胞毒性T细胞巨噬细胞NKK细胞嗜中性
粒细胞












图 2101 Th1 细胞抗原提呈细胞关系
67
Th2细胞： 辅助B细胞产生抗体介导体液免疫
分类标准：分泌细胞子IL4（标志性细胞子）IL2IL10
标记：CD3CD2TCRCD4（通常）LAG3
细胞功：活化Ⅱ型免疫效应B细胞（IgG1IgEIgA）嗜酸性粒细胞柱
状细胞肥细胞










图 2102 Th2 细胞抗原提呈细胞关系

















图 2103 Th1 Th2 细胞 Th0＼APC 相互关系

2检测原理
活化：未活化淋巴细胞分泌细胞子极少流式细胞术难检测出
检测前需剌激活化活化剌激素 PMA（佛波脂）+Ionomycin
抑制分泌：淋巴细胞剌激素作活化分泌细胞子细胞外流式细胞仪
细胞表面部抗原进行检测必须阴止细胞子分泌
确定 CD4+细胞：Th1Th2 细胞先决条件 CD4+T 细胞存着 CD4 凤定细胞群
问题知道CD4 仅 T 细胞表面表达单核细胞表面表达
单独 CD4 设门法 CD4T 细胞区分开实践证明 CD3CD4 双参数设
门佛波脂作 CD4 抗原表达迅速调 CD3CD8 设门 CD8 受佛 68
波脂影响绝数 CD3+CD8细胞 CD3+CD4+细胞 CD3+C 左细
胞群确定 CD4+T 细胞群
3 检测试剂：(问陈军浩)
PMA：贮存液：PMA 溶 DMSO浓度 01mgml20℃保存工作液贮存液 1：100 稀释
RPMI 1640 PBS（菌 NaN3）中时 1μgml工作浓度 25ngml（取 25
μgml）
Ionomycin：贮存液：Ionomycin 溶 DMSO浓度 1mgml20℃保存工作液：贮存液 1：
20 稀释 RPMI 1640 PBS（菌 NaN3）中时 50μgml工作浓度 1μgml
（取 20μgml）
Monensin：贮存液：Monensin 溶甲醇浓度 50mgml加速成溶解置 4043℃
水浴4℃少保存 4 月工作液：贮存液 1：50 稀释 RPMI 1640 PBS（菌
NaN3）中时 1mgml工作浓度 17μgml（取 17μlml）
RPMI 1640：RPMI 1640 含 10FCS（胎牛血清）2mM glutamin50μgml 青霉素50μ
gmlsteptomycin 100μgml neomycin
抗体：细胞表面标志抗体：CD3PC5(PerCP)CD8FITC
细胞子抗体：IL4PEIFNγPE
破膜剂：品牌：美国 Caltag 公司 Fix&Perm 破膜剂美国 BD 公司 FACS 破膜剂
法国 Immunotech 公司 IntraPrep 破膜剂

4检测步骤：
（1） 肝素抗凝采血
（2） 取两试分作茧缚阴性（A ）测定（B ）两试中
均加入 100μl 血液 100μl PRPIM 1640
（3） A中加：34μl 1mgml Monensin 工作液B 中加入：5μl 1μgml PMA
工作液+4μl 50μgml Ionomycin 工作液+34μl 1 mgml Monensin 工作液
（4） 37℃5 CO2 培养箱培养 46h
（5） 混匀取出 100μl加入适量 CD3PC5（PerCP）CD8FITC孵育段时间（参
阅抗体说明书）
（6） 着破膜剂固定破膜
（7） 加入适量 IL4PEIFNγPE孵育段时间（参阅抗体说明书）
（8） PBS 洗次清适量 PBS 重悬细胞沉淀机检测
注意：细胞表面细胞抗原时检测时应先标记细胞表面抗菌素原破膜标记
细胞抗原Caltag 公司破膜剂公司破膜抗体标记时进行缩短
操作时间

5结果分析
（1） CD4 设门选定淋巴细胞
（2） CD8 分 IFNγ建立双参数直方图第 1 步确定淋巴细胞进行分析
（3） 出 CD8IL4+（Th2） CD8IFNγ+（Th2）细胞百分含量

七外周血白细胞 HLAB27 表达
HLAB27 抗原类组织相容性复合体（MHC）表达产物属Ⅰ型 MHC 基
免疫系统中负责细胞间相互识诱导免疫反应单核细胞粒细胞淋巴细胞表 69
面均检测含量等 HLAB27 抗原单核细胞表面含量丰富 HLAB27 抗原
刺激分子 B7（CD80CD86）类似组成结构 HLAB27 抗原单克隆抗体常
B7 分子交叉反应国外 1987 年首次报告流式细胞术检测 HLAB27 表达开
始应流式细胞术细胞水研究 HLAB27 表达状况作相关疾病筛选指标迄
止检索表明相关文献 81 篇国早综述文献发表1994 年致病机理研究发表
1998 年（PCR 方法）流式细胞术检测 HLAB27 表达文献发表 2000 年

1HLAB27 强直性脊柱炎（ankylosing spondylistisAS）中诊断价值
（1） 敏感性特异性 机选择患者说 HLAB27 实验发现 AS 诊断
价值通实验敏感性获敏感性定义患者中阳性结果率AS 病
90~95（白种）特异性定义健康体中阴性结果率群 AS 发病 01
时群 HLAB27 出现频率 10敏感性 95HLAB27 特异性 901果群
AS 发病率升 1时特异性 908
（2） HLAB27 实验阳性预示价值 预示价值系指 HLAB27 阳性患者占 HLAB27 阳性
群率果群 HLAB27 出现频率 10发病率分 01 1预示价值
分 095 95数字流行病学调查发现恰吻合者算出 1~6HLAB27
阳性者患 AS
（3） HLAB27 实验阴性预示价值 指 HLAB27 阴性健康者占率通计
数出HLAB27 阴性者未患 AS 约 999
述数资料出 HLAB27 实验具高度敏感性特异性
断机选择患者否患 AS阳性结果预示价值 095~95提示绝数
HLAB27 阳性者未患 AS HLAB27 作机选择群 AS 筛选指标
患 AS 者阴性结果预示价值非常高 AS 患者 HLAB27 阴性机会非常少
样 HLAB27 实验处理机选择患者床实践中具某价值阴性结果做
诊断 AS 排标准现实机选择群中作 HLAB27 实
验床怀疑患血清学阴性脊椎关节病变时作实验具
提示血清学阴性脊柱关节病症状体症病例实验具潜价值
流行病学调查发现 HLAB27 阳性伴背痛强直AS 发病率 225数字
机选择 B27 阳性者 AS 发病变幻常 1~6相差悬殊选择背痛强直者进行
实验提高发现 AS 性研究者指出AS 表现炎性背痛床症状没
AS 典型影特征家族调查中床特征 HLAB27 显著联系发现
13~18 B27 阳性级亲属炎性床特征伴影学改变
（4）青少年性关节炎 HLAB27 意义 成 AS 青少年 AS 发病初期引起骨
骼病变症状出现较少 24童诉腰椎痛强直发病初期末梢关节病
变表现明显青少年 AS HLAB27 关系成年 AS 样已确诊青少年慢
性关节炎患者HLAB27 实验阳性提醒医生诊断发生 AS 起辅助作
实验诊断成 AS 样具相局限性作诊断标准
HLAB27 显性方式遗传级亲属 HLAB27 出现率否纯合体配
偶 HLA 状态表现 25~100AS 先证者级亲属 AS 出现率预计 13~11
AS 诊断背部疼痛强直出殃影学骶髂关节炎类病例 HLAB27
阴性改变诊断AS 伴 HLAB27 阴性患者提醒医生时发生牛皮癣炎症性
肠病变然 HLAB27 阴性伴发皮肤肠道病变纯 AS 病例
HLAB27 脊柱关节病病发病机制关键观点已广泛认必须清楚
少数 HLAB27 阳性者患病目前 AS 诊断床检查X 线片示双侧骶髂 70
关节炎脊柱重诊断然 HLAB27 实验应限疾病确诊
预见患者预方面助诊断：BD 公司生产 B27 检测试剂
方便试剂盒 FITC 标记标准微球瓶B27FITCCD3PE 双标试剂 1 瓶 BD 溶血
剂 1 瓶组成
2 实验方法
① 取荧光素 PE 标记 CD3 单抗 FITC 标记 HLAB27 单抗 30 ulEDTAK2 抗凝全血 50
ul 混匀室温染色 15min( 20min)
② 加溶血剂 2 ml 溶解红细胞(10min)
③ 1500rpm 离心洗涤细胞碎片加 1聚甲醛固定(15min)
④ 机测定测完标准微球调节 FL1 电压改变 FL1 设置通 CD3PE vs
SSC 设门圈定 CD3 阳性细胞（T 淋巴细胞）检 测 B27 均荧光强度标荧光强度
标准微球荧光强度阴性相反阳性
⑤ 流式细胞仪检测发出实验报告(10min)










图 2102 HLAB27 细胞表达检测原理
3 床意义
① 强直性脊椎炎患者中 90 HLAB27 阳性正常群中 5～10阳性强直性脊
椎炎床症状许疾病相似难确诊特疾病早期
② Reiter`s 综合症患者中 HLAB27 阳性率 70～90
③ 银屑病性关节炎患者中 HLAB27 阳性率 50～60
④ 葡萄膜炎患者中 HLAB27 阳性率 40～50

八PNH 流式细胞术分析：

阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuriaPNH）种获性
造血干细胞异常床表现骨髓丧失造血功血栓慢性溶血性贫血急性发作PNH
发病率低发病原详生障碍性贫血关系PNH 床表现疾病
进程变床诊断治疗疾病研究带困难 15 年 PNH 细胞分子
生物学研究中取重进展定义导致PNH 异常表现分子缺陷流式细胞仪进
行 PNH 诊断分型PNH 研究里程碑单克隆抗体流式细胞仪技术发现诊 71
断 PNH 表型异常重手段
流式细胞仪发现 Ham 实验阴性生障碍性贫血病中存少量 PNH 细胞
PNH 分两种情况：（1）溶血性 PNH特征显性溶血性贫血时血红蛋白尿
值注意组病中 50发生静脉血栓导致病死亡原（2）
生良性 PNH检出 GPI 缺乏造血细胞没显性溶血症状生
障碍性贫血白细胞减少症血板减少症

1检测方法：通应 CD45CD61CD64 等单抗分设定血板淋巴单核粒红细
胞 III 区II 区 I 区细胞位置（见图）
（1）阴性：CD55CD59 相应型
取 3µl 全血加入 CD45+CD61FITC IgG1PE CD64TC CD45+CD61FITC IgG2a PE
CD64TC
（2）阳性
取正常外周血 3µl 加入 CD45+CD61FITC CD55PE CD64TC CD45+CD61FITC CD59PE
CD64TC
（3）病检测
直接病外周血 3µl CD45+CD61FITC IgG1PE CD64TC CD45+CD61FITC IgG2a
PE CD64TC 染色测定细胞群体 CD55CD59 表达情况








图 2103 通 CD61CD45 CD64 识血板红细胞淋巴细胞单核细胞粒细胞

2结果分析：见图 224 225 72

图 2104：正常分红细胞单核细胞 CD59 CD55 表达情况










图 2105 PNH 病红细胞单核细胞 II 区细胞存

九药耐药基蛋白表达检测

1基概念
肿瘤细胞药耐药（multidrug resistanceMDR）指肿瘤细胞接触种抗癌药物
该药产生耐药结构作机制药物产生抗药性1970
年 Biedler Reihm 先报道 MDR 现象发现放线菌素 D 耐药细胞时
种抗肿瘤抗生素植物碱药物交叉耐药1976 年 Juliano 等发现耐药细胞中种
耐药程度成数量相关高分子量细胞膜蛋白命名 P 糖蛋白分子量 170 KD
名 P170 糖蛋白肿瘤细胞耐药性分原发性耐药（intrinsic resistance）获性耐
药（acquired resistance）前者化疗前存肿瘤细胞中药物关者
化疗药物诱导产生药物前药物敏感药物应产生耐药获性
耐药根耐药谱分原药耐药（primary drug resistance PDR）药耐药（MDR）
原药耐药药物产生耐药药物产生交叉耐药药耐药种
药物诱发时种结构作机制完全药物产生交叉耐药导致联合
化疗方案失败

2p170 药耐药机制
药物肿瘤细胞杀伤作赖进入细胞药物浓度许药物通细胞膜进入
细胞动赖量程药物浓度梯度关参程载体蛋白结构
改变导致细胞药物吸收减少细胞效药物浓度降低果细胞药物产生
耐药性氨甲喋呤（MTX）转运研究认耐药性产生药物细胞膜结合载
体蛋白亲力降者细胞表达载体蛋白数量降
P170 糖蛋白种 MDR1 基编码具 ATP 酶活性跨膜泵肿瘤细胞抗
癌药物接触时脂溶性药物浓度梯度进入细胞细胞部 2 药物结合位点 2 ATP
结合位点药物 P 糖蛋白结合时水解 ATP 获量药物细胞泵出
细胞药物浓度断降药物细胞损伤减弱直消失终出现耐药P 糖蛋白
药物特异性 MDR 细胞许结构作机制药物产生耐药诱导
P 糖蛋白度表达产生耐药药物蒽环类长春新碱柔红霉素表鬼臼毒素放线菌素
D 紫杉醇等药物般天然源化学特性属疏水性药物诱导发生
耐药时时类药物产生交叉耐药P170 糖蛋白药物泵出细胞原理见图 73
2106













图 2106 p170 糖蛋白作原理示意图

3MDR1 基正常组织肿瘤细胞中表达
P 糖蛋白存许正常体组织肝脏结肠胰脏肾脏肾腺脑睾丸
胎盘中P 糖蛋白非种异常蛋白具定生理保护功细胞正常防御
中起着忽略作类类型肿瘤中测 MDR1肿瘤细胞中
MDR1 基表达肿瘤细胞组织起源关果某组织细胞高水
MDR1细胞恶变高水 MDR1 表达结肠癌肝癌肾细胞癌等
床类肿瘤具原发性耐药性化疗反应性低果组织细胞表达 MDR1
MDR1 水低恶变表达少表达 MDR1卵巢癌头颈部癌肺癌
膀胱癌等肿瘤化疗效果效会发生获性耐药然正常造血细胞少
量 MDR1 表达种白血病发性骨髓瘤（MM）非霍奇金淋巴瘤（NHL）
中初治治疗病例MDR1 水程度升高甚患者中
相高水 MDR1 表达
般情况肿瘤细胞治疗前显示较高水 P 糖蛋白提示预佳MDR1
阳性病耐药性发生率远远高 MDR1 阴性病 AML 病MDR1 表达增加常预
示完全缓解率（CR）低疾病易复发生存期短 MM 病果病 VA D 方案
治疗P 糖蛋白表达增加提示预良外肾细胞癌乳腺癌食癌等实体
瘤中P 糖蛋白表达耐药性相关

第 11 节 流式细胞术参数质量控制

流式细胞术标组织细胞获取抗体染色洗涤流式细胞仪采集存储
分析数出报告牵涉诸步骤步骤中均存着稳定确定素
流式细胞术质量控制（质控）监督控制步骤中素确保终结果准确
性重复性
引起流式细胞术参数变性素分四类：流式细胞仪变性标变性
操作程变性（包括试剂方法）数分析变性
流式细胞仪变性
74
流式细胞仪前需充分解状态天必需流式细胞仪进行监测
流式细胞仪需质控部件包括：
激发光路(包括激光器激光聚焦流路棱镜透镜)
发射光路(包括波长发射光引导光检测器透镜合滤片)
电子线路(包括光检测器高压供器放器补偿线路模数转换器线路均
光信号转换电信号然转换数字数字理想状态光强度成例)
流路系统(包括流动室样品流进样针鞘液流样细胞正交光路)
第步仔细校准激发发射光路细胞通激光光线时稳定激发激发
出光散射荧光信号准确集中光检测器校准时会导致信号 CV(变异系数)值
背景光散射(噪音)高终表现仪器灵敏度降
数床型流式细胞仪( FACSCalibur EPICS XL 等)仪器操作者
调整激发发射光路然流式操作者需知道环境温度波动会导致信号水减弱 CV
值噪音水增高激光老化引起输出电压稳定细胞激发相应
减弱激光强度荧光信号产生通常足够(处饱状态)激光器老化
敏感标志散射光信号减弱前侧散射光信号会激光强度降激光
信号降低定程度荧光信号会降
光路校准需电子线路稳定状态散射信号荧光信号 CV 值均微球
调准检测器输出均信号强度(道数)信号宽度( CV 值)两组数记录
流式细胞仪允许户行调整流动室光路仪信号强度达时 CV 值
新型流式细胞仪允许户干预应实验室做仅流式细胞仪特软件分析质
控微球某参数达 质控标准时联系生产厂家工程师校准维修
种仪器该实验室均应天认真记录参数道数 CV 值仪器处佳状态时
数值进行较解仪器否正常工作
第二步监控检测器灵敏度散射信号检测器 检测阈值通常调
低仪器阈值(ThresholdsDiscriminators)观察标准微球信号微球缓液
信号否区分开确定然法评价机器荧光检测阈值通常做法
区分带弱荧光荧光微球荧光微球力表示荧光检测阈值具体方法分析
含种荧光强度荧光微球 空白微球混合微球根软件设定户定
分离阈值判定仪器否种荧光强度区分开果空白微球背景荧光细胞
背景荧光相似知仪器检测细胞背景荧光荧光力种细胞
发荧光差实际操作程中空白微球判定检测细胞灵敏度时
太合适种方法问题荧光微球荧光强度明显高背景水果机器
CV 值高灵敏度判定力会显著降荧光灵敏度实际受两独立素影响
背景光仪器噪音水荧光激发检测效率获准确灵敏度指标必须
时监测弱荧光微球信号 CV 值仪器噪音水
第三步监控仪器电子线路稳定性某实验室某天数字结果
实验室某天结果相较必须设立衡量荧光强度标准方法含干
覆盖荧光检测器中通道荧光微球混合物中包含干具确定荧光强度
(荧光等量单位表示)荧光微球荧光强度连续时求荧光微球峰值
荧光等量单位成线性关系仪器光电倍增放器保良线性状态通调节检
测器电压荧光微球峰值固定某荧光通道记录检测器电压观察日
等检测器电压条件荧光微球峰值否会发生改变改变没超允许范围(
般 + 2SD)
种监控仪器电子线路稳定性方法标准化荧光强度标准化单位报告结 75
果述荧光通道数相荧光强度样机器检测器
设置结果进行较 荧光强度标准化问题荧光微球制备技术荧光强度单位
转换方法非佳厂家生产荧光微球荧光素量(溶性荧光素分子
等量物 MESF)相均厂家生产批号间会存差异外
种标准化方法带已知数目免疫球蛋白结合位点荧光微球微球细胞时
荧光抗体染色然细胞荧光强度转换细胞抗体结合数目种微球
校准荧光强度校准抗体特定抗体染色荧光强度水表示
细胞结合抗体数目需特注意：1) 微球染色通免疫球蛋白(抗体)
微球抗免疫球蛋白(免疫球蛋白结合位点)结合完成免疫球蛋白微球亲
力通常免疫球蛋白细胞抗原亲力两者等会存问题2)
条件免疫球蛋白抗原免疫球蛋白结合单价价
免疫球蛋白微球结合免疫球蛋白细胞结合等起存诸变数3)
述两种微球(荧光微球非荧光微球)稳定性非常重影响素荧光微球荧
光会减弱非荧光微球表面免疫球蛋白结合位点会减少均会导致结果判断失
误总言目前缺乏荧光强度进行标准化 金标准
信号道数值通调节光电倍增电压改变放电路电流改变
面点考虑会认标准化荧光强度必1) 果电倍增放器
非完全线性处两端荧光道数原始荧光信号强度成正2) 颜色
荧光间存着 颜色重叠必须通调节 颜色补偿 消种重叠果补偿准
会导致天测荧光绝值荧光间颜色补偿会处介质改
变外 串联(tandem)荧光染料 PECy5 PETR 等时补偿足非常值
注意问题种 串联染料两种组成部分(供体荧光物质 受体 荧光物质)
间量转移效率常会发生变化说两组成部分间距离增荧光信号
传 受体荧光物质导致串联染料漏光检测器中引起颜色重叠增
种量转移效率会结合抗体抗体保存长短关系
种常校准流式细胞仪线性度检测流式细胞仪灵敏度方法：
该方法中 Sphero™ Rainbow Calibration Particles (8peak) (Spherotech Inc ILUSA
目录号 RCP305A) 种空白微球 7 种具连续荧光强度(弱强覆盖整
荧光通道)荧光微球(发射波谱 360650nm覆盖常流式细胞仪检测通道)
混合微球微球直径 3um首先关掉仪器补偿设置通改变光电倍增电压
值图 1 中荧光检测通道中第 6 峰( M6)分调表 1 中示荧光道数注意
Beckton Dickinson 流式细胞仪 Beckman Coulter 流式细胞仪荧光检测器前者
第三荧光检测器(FL3)等者第四荧光检测器(FL4)两荧光检测器相








记录时峰荧光检测通道中测均荧光强度(Mean RFI)填入
Spherotech Inc提供 Excel 计算表格中表 2102 分析 FL2 检测通道表格

Beckman Coulter 流式细胞仪 Beckton Dickinson(BD)流式细胞仪
荧光检测通道 荧光道数
FL1 228
FL2 614
FL3 368
荧光检测通道 荧光道数
FL1 228
FL2 614
FL3 368


表 2111 RCP305A 微球中第 6 峰 Beckman Dickinson Beckman Coulter 流式
细胞仪荧光检测通道中应处荧光道数 76
峰 M1 峰 M8 FL2 检测通道中 Mean RFI 填入相应位置表格动计算
出面数值软件时荧光道数(Channel 总道数 256)横坐标 MEPE(molecules
of equivalent PE等 量 PE 分子数)数(Log)坐标作图线性回回方程
(图 2101)


PEAK Mean RFI Channel MEPE MEPE LOG CALC RESIDUAL CALC MEPE
M1 179 1618 74 1870 74
M2 972 6321 400 2602 2639 822 435
M3 2521 8970 1200 3079 3072 181 1180
M4 7193 11884 3800 3580 3548 670 3535
M5 22293 15028 12000 4079 4062 304 11547
M6 61431 17846 34000 4531 4523 073 33349
M7 222258 21420 124000 5093 5107 039 128072
M8 515731 23760 300000 5477 5490 521 309008

该表中出较重参数：
（1） r2：相关系数(r)方衡量线性回坏值需 095
（2） AvgRes 均残差百分率(Average residual percent)衡量微球处回图
处位置回线程度重参数值需<5超 5表明仪器数放
器非线性
（3）Logarithmic Decades表示数放器总体动态范围值应 40+02
（4）Blank Threshold 表示空白微球 MEPE 值反映仪器灵敏度值应 200
通述检测评价数放器工作状态线性度时解仪器
灵敏度果述四参数中允许范围说明仪器状态需工程
师维修
外RCP305A 8 种微球必须 FL1FL2 双参数直方图中明显区分开否
表明仪器灵敏度够满意
电子线路中 颜色补偿线路 通面两步骤校准：
含 空白微球颜色荧光微球( FITC PE PETR PECy5 等)混合微球
测试补偿电路通生物样进行免疫分型检测验证补偿设置
某型号机器( Beckton Dickinson FACS Calibur Beckman Coulter EPICS XL)
已第步骤软件化中软件动进行补偿设置软件准确调整荧
光微球 空白微球峰信号位置客观补偿设置通微球调节补偿设置通
常适合生物样免疫分型原包括荧光微球中荧光素掺入荧光素标记抗体
细胞结合细胞抗原量未染色细胞空白微球处较低荧光
道数需电压值分析生物样时需确认重新调节补偿
述质控步骤结果包括峰值CVs PMT(光电倍增)电压增益(Gain)补
偿值等均需记录定期计算均值标准差(SD)正常标准差通机器
处佳状态连续天次分析确定果某天出现述参数值超出户
设定标准差限结果需做特殊标记校准机器喜目前 Beckman Coulter
流式细胞仪已配备动质控程序程序动记录质控微球时获种参数
动绘制 参数表格 LeveyJennings 质控图(图 2101)户方便观察日
参数变化早踪异常情况
表 2112 Spherotech Inc 线性回计算表格 77












图 2111 荧光校准微球流式细胞仪第荧光通道(FL1)检测峰 CV 值
横坐标检测日期检测 30 天总坐标 CV 值(表示)见CV 值天均会
改变果某天 CV 值超出允许范围(户定软件设定)表明仪器状态需调
试

实容易引起质控失败流式细胞仪流路紊乱仪器参数出现质
控失败首先应检查仪器流路否正常然调整光路检测线路液体路部分
堵塞会严重干扰信号背景噪音水散射光荧光信号 CV 值均明显升高
素导致背景噪音中区分出荧光分子数降说仪器检测灵敏度降低
外引起流路改变原样流速果样细胞快压入通流动室样
核心区会变宽导致细胞光散射出现差异信号 CV 值相应增外样
通流动室时速度快某时间点流式细胞仪会时检测两细胞引起
信号 CV 值增加

二标变性

1标采集固定方法质量控制
标采集质量直接影响否制备出合格样品单细胞样品制备良劣直接影
响流式检测精度实验结果标采集十分重环节标采集程(1)手术切
新鲜标活检针吸标取材时避免出血坏死组织(2)标采集时固定
深低温保存免组织发生溶DNA 降解造成测试结果误差(3)固定剂采
组织细胞穿透性强浓度例 70乙醇固定 75浓度固定效果高浓度
乙醇常造成细胞表面快速形成蛋白膜致细胞物质固定良作者分析研究
溶 DNA 测定影响发现溶组织细胞常出现假性异倍体固定组织细胞
时间延长DNA 信号呈梯度降低根检测目选择什类型固定剂流式检
测质量显著影响例细胞 DNA 分析醇类固定剂较选择醛类固定剂
醛类固定剂明显影响细胞 DNA 荧光发射强度补证明醛类固定剂插入性荧光染料
核酸结合强干扰作荧光强度仅相新鲜组织荧光强度 50~70左右
果作流式免疫研究工作采新鲜组织选择时检测没低温保存条
件时根测物质细胞细胞膜表面膜表面抗原物质醛类固定剂
宜醛类固定剂产生非特异性荧光较强宜采醇类固定剂醇类固定剂
细胞表面糖蛋白脂蛋白脱落丢失失标记位点测抗原物质细胞
LeveyJennings质控图例
1
11
12
13
14
15
16
17
1 5 9 1317212529
日 期
(
百分率
) 78
醇类固定剂种固定方法简便易行需特殊低温冷条件般冰箱(0~4℃)放置
保持细胞形态生物化学成分发生变性

2单细胞悬液制备质量控制
流式细胞术定量分析基单细胞基础流式细胞术带特殊求应
流式细胞术中制备出合格单分散细胞悬液流式分析成败否关键环
解掌握体类组织单分散细胞悬液制备方法尤重
（1）体末梢血液骨髓细胞淋巴组织体组织中缺乏细胞间连结装置组
织尤血骨髓细胞天然单分散细胞材料中细胞成分生理状态呈单分
散状态流式分析合适样品源全血中含种形成分流式细胞检测某
群细胞检测检测前须测某群细胞成分分离出例淋巴细胞 DNA
定量分析例须淋巴细胞分离出核心细胞红细胞血板
分析样品制备程中须防止高离心速度造成血板膜损伤出现血板凝集
（2）新鲜实体组织单细胞样品制备实体组织流式分析工作材料源
分散单细胞样品技术方法存着问题需量探索工作目前国
外实体组织分散单细胞没找适通方法处理甚样组织
实验目需方法处理者种组织单独问题必须根
实际情况选择合适效单分散方法选方法必须达细胞产量高细胞损伤
目标实际工作中达目标困难年实体组织分散解聚采酶
学法化学法机械物理方法低渗脱核方法等根种组织特点实验目
选择方法
① 选择酶学方法时应注选择酶类型问题含量结缔组织组织器官选
择胶原酶宜选择胃蛋白酶胰酶注意酶活性条件影响素注意酶溶
剂消化时间pH 值浓度等方面酶活性影响酶学方法分散组织定应限
制特异流式免疫荧光实验时酶处理改变丢失膜抗原成分影响分析结
果酶学方法分散细胞产量低组织较注意酶纯度活性单位
生产厂家酶污染
② 化学方法单独应分散组织效果理想应酶学方法综合分散效果更
佳
③ 机械方法常采剪碎网搓研磨细针抽吸等细胞损伤产生细胞碎片
细胞团块机械方法时组织适压力种适压力需较
制样实践验技术员操作
④ 低渗方法溶液种低渗液体造成细胞膜破坏细胞核行释放出
裸核悬液样品方法简便改变样品变异系数避免脱核时间长造成
核膨胀碎裂
种方法目前实体组织解聚常方法单常常种二种方
法结合总说实体组织分散单细胞存困难需深入探讨
流式样品制备技术制备出完整细胞产量高细胞损伤合格悬液获更流式检
测结果

（3）石蜡包埋组织单细胞制备质量控制
石蜡包埋组织流式细胞术定量研究极扩流式细胞术应范围石蜡包埋
组织单细胞悬液制备技术流式细胞术说重技术进展推动流式分析
DNA 含量广泛应该方法建立结束流式新鲜组织定量分析时代尤 79
肿瘤组织量存档肿瘤标进行流式定量研究结合肿瘤病预资
料进行回顾性研究传统病理形态学提高分子病理学水肿瘤病理学定性诊断
推进定量诊断新阶段
① 石蜡包埋组织标材料选择应病理医师仔细检查选取溶坏死组织
肿瘤组织标选取含肿瘤组织细胞丰富区域病理形态细胞学核实病理诊断
② 切取适厚度石蜡组织片量研究证明切取 40~50um 厚度切片适宜
厚组织片消化费时消化细胞数少薄切片产生量细胞碎片影响检
测结果肿瘤异倍体检出率减少研究石蜡切片厚度(510203040
50un)流式分析 DNA 影响发现较薄切片造成碎片较噪音增加组方图基线提高
影响倍体分析精度
③ 组织脱蜡程中定蜡脱净残留石蜡影响酶消化活性检查否
蜡脱净方法弃二甲苯(Hedley 强调 Histoclear组织清洗剂代二甲苯脱蜡效
果更)加入 100乙醇果絮状物浮起视蜡已脱净
④ 梯度酒精(100 70 50)水化充分组织原新鲜组织相似状态
⑤ 消化酶液掌握适浓度pH 值温度等造成酶活性降低宜消化时间
重时间短细胞消化时间长消化细胞破化制备石蜡包埋单细
胞时常规 05胃蛋白酶 pH15
⑥ 石蜡包埋组织单细胞制备方法建立流式细胞术医学研究中更广泛
应问题进步解决存问题
ⅰ 样品中碎片较测 DNA 组方图质量新鲜组织组方图峰位较
宽 CV 会值偏
ⅱ 异倍体率减少组方图细胞峰 CV 值较二倍体 DNA 异倍体峰
掩盖
ⅲ S期细胞百分新鲜组织 S 期计算精确S 期细胞计算偏高然 CV
值较关
ⅳ DNA 二倍体标准稳定Schutter 等发现新鲜正常组织二倍体细胞者
生物细胞 DNA 含量(例鸡红细胞鳟鱼血细胞等)作石蜡包埋组织细胞 DNA 含量标
准适石蜡包埋组织新鲜组织细胞 DNA 荧光强度低样品间荧光强度稳定
解决 DNA 二倍体标准稳定办法正常组织肿瘤组织作标二倍体标准
参减少 DNA 倍体分析误差存档中石蜡包埋组织材料采正常组织石
蜡包埋标作外参二倍体标准求采外参二倍体样品肿瘤样品中加入
标准样品(例鸡血细胞等)

（4）脱落细胞样品采集
脱落细胞样品采集保证足够细胞数床实际工作中收集量然脱
落细胞标细胞标简单处理较单分散细胞例胸腹水
镜刷检细胞膀胱洗液等材料流式检测结果心谨慎分析解释结果
生物学意义材料获结果常出现阴性假阳性结果中白细胞常变性
样品细胞数量少制备出合格单细胞样品细胞数求 1×106ml杂质碎
片团块重叠细胞应 2否应放弃检测肿瘤细胞 DNA 异倍体分析样品中
少应 20肿瘤细胞存(占峰 15 异倍体峰确认异倍体)

三 操作程变性
80
包括试剂方法单细胞悬液样品荧光染色流式定量分析精度重目前常
荧光染料 EBPIDAPIAOFITCPE 等细胞染色时应特注意染料特性量效
关系定量细胞学荧光染色易受种素影响致造成正确测定结果解荧光
染色影响素助荧光定量细胞学分析中避免测量误差进行效
校正措施常见影响素需特注意

1 温度荧光染色强度影响
般情况环境温度升高荧光染色明显影响温度升高造成溶液粘滞性
增加溶剂荧光染料分子动力增荧光猝灭性增加荧光分子
分子间相互碰撞率增加影响荧光分子发光量子产额般认温度升高
时荧光减弱荧光减弱百分称温度系数般荧光物质言温度系数约 1
果温度 20℃时般荧光染料出现温度猝灭效应温度升高荧光猝灭作越
强致造成完全猝灭温度 20℃荧光分子发光量子产额变化明显基
保持恒量荧光测定时保持染色样品适低温环境进行减少样品
射时间条件时应样品观察室做恒温装置会更荧光定量结果

2荧光染色浓度荧光发射强度直接例关系
溶液较稀时荧光强度浓度成正关系浓度加荧光强度增荧光染
料达定浓度时继续增加浓度仅会荧光强度相应增加反荧光强度减
低种染料浓度增荧光量子产额降现象称浓度猝灭现象研究浓
度荧光强度关系时必须检查荧光值曲线高峰前浓度曲线高峰浓度
(方法减少溶液浓度荧光减弱高峰前浓度)浓度造成荧光猝灭原缔合分
子形成缔合分子中电子振作消耗激发分子量参猝灭作实验表明
溶液稀释荧光染料分子间相互作完全消失时荧光量子产额荧光强度发
射强溶液浓度增加时荧光分子间发生碰撞降原荧光染料浓
度增加时造成荧光分子均匀分布入射光面吸光强进入溶液深层时光
吸收越少发出荧光分子越少称种滤光效应(Interfilter Effect)鉴荧光染料浓
度荧光强度广泛选择合适浓度荧光强度定量检测技术极
重

3pH 值荧光强度发射强度影响
荧光分子溶剂中处离子状态溶液中氢离子浓度荧光强度影响极荧
光分子发光利条件溶剂中呈离子化极化状态通染料分子身具
听斥力作避免分子间相互碰撞作种荧光分子发光量产额高
合适 pH 值

4影响强度素
醛类固定剂(戊二醛甲醛)干扰荧光染料核酸分子结合溶剂中
发光物质(溴化物碘化物氨基酸硝基苯铁银离子等)均造成荧光猝灭现
象
影响荧光染色素 FCM 技术测量某种物质含量时需够影响荧光染色
素作仔细检查旦荧光实验技术程中出现误差必须根定条件进行综合
分析采取相应校正措施
81
四数分析变性
流式细胞仪检测结果长串简单二进制数字纪录计算机文件中准确
客观分析数字计算机软件应具备基功软件首先应该提出特
定问题然软件帮助解决问题流式特形式表达出
果问题表达某种蛋白细胞占百分率数分析时首
先应选定群特定细胞流式细胞术中称 设门(Gating)程成流
式数分析中第变素细胞根特定前散射光侧散射光特征设
定设定淋巴细胞常方法然根散射光特性设门非常观
十分清楚细胞激活浸润组织散射光特性改变模式时象
荧光信号样散射光信号进行质控目前较公认方法荧光参数辅
助散射光参数进行设门通常情况荧光参数荧光标记 CD45 抗体
CD45 白细胞亚群发育成熟阶段表达量差异 侧散射光
CD45 双参数设门方案已广泛应 CD4 绝计数时淋巴细胞群设定(淋巴细胞
CD45 强表达侧散射光较低)白血病患者骨髓标中原始细胞界定(原始细胞 CD45
弱表达侧散射光淋巴细胞相)
数分析时第二变素确定阳性细胞阴性细胞分界线通常做法
阴性标作参求准确合理选择阴性标阴性标未染色细
胞型抗体染色细胞(实际操作程中选择者)型
选择变素根源然找倒非常匹配实验中种抗体型
通常说容易外果实验室阴性确定阴性细胞
阳性细胞分界线导致 阳性百分率 结果出现差异阴
性非常合适确定阴性阳性分界线认应该分界线定假阳
性率(阳性细胞区阴性细胞百分率) 12处认应假阳性率 5左右
处果检测细胞抗原表达量较高( CD3 CD4 等)结合荧光抗体相应较
样阳性细胞荧光强度会明显高阴性细胞时采述种分界原结果影响
果检测细胞抗原表达量较少少( CD62pCD95 等)染色阳性细胞区会
阴性细胞区部分部分重叠时分界原结果会较差异事实出现
阳性细胞区会阴性细胞区重叠时尤白血病淋巴瘤免疫分型应该考虑
阳性百分率分析结果否合适种情况常会采寻找表达异常抗原组
合异常抗原量特殊细胞群确定白血病淋巴瘤类型关心特殊细胞百
分率细胞荧光标记强度带标准荧光强度微球进行较时显尤重
外流式进行白血病淋巴瘤免疫分型已传统报告数字结果渡基
二维轮廓图(contour plot) 模式识关注表达某种抗原( CD19
CD33 CD34等)细胞百分率少更注重通参数分析确定否存异常细胞
群体然室间质控保证实验室统标相结果白血病淋
巴瘤 模式识意两患者表现形式均差存衡量正确否
金标准时室质控非常重保证机器处良状态标准化试剂
客观分析结果
数分析终质控步骤数检验单参数直方图点图轮廓图等种
形式分析较数确定结果性视觉观察图形常会发现仪器标标
处理程中存某问题外数字结果时 部致性原校验
分析 CD4 时保证淋巴细胞设门标准(淋巴细胞回收率>95淋巴细胞纯度>90)
时保证 CD3+4+细胞 CD3+CD8+细胞约等 CD3+细胞总数 CD3+细胞(总
T 细胞)CD19+细胞(总 B 细胞) CD3CD(16+56)+细胞(总 NK 细胞)百分率似淋巴 82
细胞门中淋巴细胞纯度外 CD4 表型分析绝计数时抗体反应中均
包含 CD3 抗体分析较中CD3+细胞百分率进步实验进行 部
致性质控
83
第三章 体流式细胞参数正常参考值


外周血中种流式细胞仪检测指标正常参考值：

细胞表面标志 细胞名称 均值标准差 范围
T 细胞抗原
CD2 总 T 细胞 7628±768 625～890
CD3 成熟 T 细胞 6998±579 611～770
CD4 T辅助诱导细胞亚群 3525±516 158～416
CD5 T细胞（B 细胞亚群） 7706±734 695～88
CD8 T抑制细胞毒细胞亚群 2508±434 181～296
CD28 T细胞受体剌激分子 4959±930 395～648
CD8+CD28+ 细胞毒 T 细胞 1322±418 86～155
CD8+CD28 T 抑制细胞 1599±513 99～248
CD3+HLADR 静止 T 细胞 6710±1169 553～771

B 细胞抗原
CD19 全部 B 细胞 1156±254 73～182
CD20 全部 B 细胞 1220±292

NK 细胞抗原
CD3CD（16+56）+ NK 细胞 1491±487 81～256

单核巨噬细胞
CD14 单核细胞 510±200

活化细胞表达抗原
CD3+HLADR+ 活化 T 细胞 305±134 12～58
CD3HLADR+ 活化 B 细胞 742±322 30～117
CD3+CD25+ 活化 T 细胞 1594±367 101～220
CD5+CD19+ 活性 B 细胞 465±151 31～66
CD69 活化诱导分子（AIM） 209±087 08～35
CD38 活化 T 细胞 5107±567 424～600

免疫调节细胞
CD4+CD29+ T 辅助细胞诱导亚群 1692±535 98～260
CD4+CD45RA+ T 抑制细胞诱导亚群 2051±364 150～250

细胞
HLADR MHCⅡ类分子 DR 抗原 1093±451 61～170
CD45RA 白细胞抗原 CD45 异型 6699±506 598～737
CD4CD8 值 142±089 098～194
84
Ⅰ型变态反应介导分子
CD23 IgE低亲力受体（FcεRⅠ） 319±065 19～44
IgE 膜结合 IgE 195±089 09～37

造血干祖细胞
CD33 髓细胞前体 2590±3320 213～304
CD34 干细胞 <05 01～05

粘附分子
CD18 整合素β2 链 5342±1335 345～757
CD29 整合素β1 链 5763±887 408～690
CD44 细胞外基质受体Ⅲ 9833±239 938～999
CD49b 整合素α2 链VLA2 9522±639 926～978
CD49c 整合素α3 链VLA3 380±048 33～47
CD49d 整合素α4 链VLA4 8442±789 726～938
CD49e 整合素α5 链VLA5 3420±447 208～535
CD49f 整合素α6 链VLA6 3750±248 326～409
CD50 细胞间粘附分子3（ICAM—3） 899±549 801～969
CD54 细胞间粘附分子1（ICAM—1）1449±247 92～202
CD56 神细胞粘附分子（NCAM1）1084±184 74～144

凋亡相关蛋白
CD95（ApoFAS） 2059±549 130～289
FasL Fas配体 055±017 03～08

细胞动力学参数
SPF S期细胞率 015±013
Apo 细胞凋亡指数 033±026

某基编码蛋白表达
CD44V5 粘附子突变体5 619±121
CD44V6 粘附子突变体6 598±153
CerbB2 407±300
nm23 肿瘤转移异制基 8589±799
DCC 8031±1011
p16 抗肿瘤基 4132±934
p53(V) 突变型 p53 080±037






85

二体细胞 DNA 含量参数正常参考值

表 311 体种正常组织 DI倍体SPF PI 分布
组织 n DI 倍性 SPF( ) PI ( )
（x±s） （x±s） （x±s）
食 21 100±0 D 104±30 165±48
肝 13 100±0 D 120±42 165±42
肠 39 100±0 D 106±49 155±40
胃 16 100±0 D 124±54 177±59
肺 26 100±0 D 94±34 160±44
乳腺 14 100±0 D 123±49 136±49
脑 17 100±0 D 89±54 134±54
腮腺 9 100±0 D 60±39 119±50
骨髓 15 100±0 D 70±42 118±52


三正常体组织某基编码蛋白表达水参数

CD44S 粘附子 3727±1061
CD44V5 粘附子突变体5 1446±805
CD44V6 粘附子突变体6 213±1340
CerbB2 814±372
Nm23 肿瘤转移抑制基 8700±910
DCC 7200±857
P16 肿瘤抑制基 8627±1286
P53（V） 突变型 P53 170±129
Apo 细胞凋亡指数 266±249
SPF S期限细胞率 521±458
CD14 巨噬细胞 1870±500
CTL 细胞毒 T 细胞 1190±380












86
第四章 实流式细胞术彩色图谱

























图 411 细胞结构模式图

流式细胞术检测细胞种成分重细胞生物学工具定量测定细
胞膜细胞浆细胞核中种细胞成分 研究细胞种功状态（细
胞增殖细胞凋亡细胞分化酶活性细胞膜通透性氧化原状态吞噬性
等等）目前定量检测血清中种溶性生物分子成分

细胞膜：脂质双分子结构中相嵌种蛋白质分子——细胞表面抗原表面糖
类表面受体细胞子膜电位膜结合钙离子细胞表面电荷等
确定细胞性质功十分重
细胞浆：种细胞成份包括蛋白质RNA种细胞器中特殊成分
种抗原基编码蛋白细胞子细胞浆钙离子pH 值等
细胞核：DNARNA蛋白质种基表达蛋白抗原蛋白等

细胞膜

溶酶体

中心粒
线粒体
细胞核

高尔基体
质网
酶原粒
细胞浆
蛋白质
脂质双分
子层 87
() 流式细胞术分析方法肿瘤细胞 DNA 含量分析

11 例肺癌患者瘤组织细胞 DNA 含量分析方法
(1碎片峰2凋亡细胞峰3DNA 二倍体细胞 G01 峰4DNA 异倍体 G01 细胞峰)












图 412 肺癌细胞 DNA 含量 Modifit LT 分析直方图（左：直方图右：分析图）
(横座标——DNA 含量座标——细胞数量)













图 413 肺癌细胞 DNA 含量 CellQuest 分析直方图
（横座标——FL2A：细胞面积座标——细胞数）










图 414 肺癌细胞 DNA 含量假三维图
4
3 4
2 1
4
3
2
1
3
2
1 1
2
3
4 88










细








图 415 肺癌细胞 DNA 含量二维散点图
（FL2W——细胞宽度FL2H——细胞面积）

















图 416 肺癌细胞 DNA 含量等高线图
（FL2W——细胞宽度FFL2A——细胞面积）



4
3
2 1
1
1 2
3
4 89
2DNA 直方图假三维图举例












图 417 1 例肺癌患者骨髓细胞 DNA 含量分析（左：直方图右：假三维图）
（SPF 较高：1574）













图 418 1 例 NHL 患者化疗骨髓细胞 DNA 含量分析（左：直方图右：假三维图）
（细胞凋亡：2466）












图 419 1 例肠癌患者肿瘤细胞 DNA 含量分析（左：直方图右：假三维图）
（伴异倍体峰：DI131） 90
二 实验条件流式细胞术分析结果影响


1低渗处理












低渗处理前正常外周血细胞 DNA 直方图
（G01 峰 CV 值 334 G01 峰前明显细胞碎片峰）
















低渗外理 5h 正常外周血细胞 DNA 直方图
（G01 细胞峰 CV 值变化明显：355 G01 峰前明显细胞碎片峰：蓝色）



图 421 低渗处理前外周血细胞 DNA 含量分析直方图



91
2未固定细胞样品染色存放时间细胞表面标志检测结果影响










图 422 未固定细胞染色存放时间 CD44S 表达分析结果影响
左：染色立检测样品——细胞群分布集中阳性率高
右：染色置 4℃5h 检测样品——荧光强度减弱分布弥散阳性率降低

3散射光图设门分析种参数
荧光标记：FL1：CD3FITCFL2：CD（16+56）PE










散

散射光图（设定细胞淋巴细胞） 左限：CD3CD（16+56）+细胞（1863）











右限：CD（16+56）+细胞（1621） 右限：CD3+细胞（7646）

图 423 CellQuest 软件设 1 门分析种细胞参数 92
4 CellQuest 软件设门分析某 1 种参数
荧光标记：FL1：CD3FITCFL2：CD（16+56）PE



散射光图设门：
R1——淋巴细胞
R2——单核细胞
R3——粒细胞
R4——红细胞碎片














左限（R1）：NK 细胞 左限（R2）：CD3CD（16+56）+细胞













左限（R3）：CD3CD（16+56）+细胞 左限（R4）：CD3CD（16+56）+细胞

图 424 设门选择外周血 NK [CD3CD（16+56）+] 细胞检测结果影响
（检测外周血 NK 细胞应选择 R1门进行分析） 93





设门：
R1——样品全部细胞
R2——淋巴细胞
R3——粒细胞
R4——红细胞碎片
R5——单核细胞



外周血细胞散射光图（太）









R
R1 中 CD71+细胞 R2 中 CD71+细胞 R3 中 CD71+细胞
（1752）










R4 中 CD71+细胞 R5 中 CD71+细胞

图 425 设门选择患者外周血 CD71+（转铁蛋白受体）细胞检测结果影响
横座标 CD71FITC座标侧角散射（SSC）
（检测外周血 CD71+细胞表达率应该选择 R1门进行分析）

12345 94




设门：
R1——全部血细胞
R2——淋巴单核细胞
R3——淋巴细胞
R4——粒细胞
R5——单核细胞
R6——全部血细胞加红细
胞碎片




血细胞散射光图

R1 中 CD44+细胞 R2 中 CD44+细胞 R3 中 CD44+细胞


R4 中 CD44+细胞 R5 CD44+细胞 R6 中 CD44+细胞

图 426 设门选择患者外周血 CD44S+细胞检测结果影响
横座标 CD44SFITC座标侧角散射（SSC）
（检测外周血 CD44S+细胞表达率应该选择 R1门进行分析） 95
5DNA 含量分析时二联体细胞方法

流式细胞术脉处理：
G1 期二联体细胞具
G2M 期单细胞相
DNA 含量容易导致分析
假阳性通荧光信
号脉宽度(FL2W)面
积(FL2A)时检测
效区分二联体细胞单
细胞
红色细胞群：二联
体分析单细胞群







FL2 电信号脉宽度高
度二维散点图
R1：二联体分析
细胞











散点图中 R1 细胞
群分析 DNA 直方图




图 427 1 例肺癌患者肿瘤细针穿剌细胞二联体 DNA 倍体分析图
二倍体 G01 期细胞
异倍体 G2M 期细胞
异倍体 G01 期细胞
二倍体 G01 期细胞峰
异倍体 G01 期细胞峰
异倍体 G2M 细胞峰 96
6校准流式细胞仪线性度检测流式细胞仪灵敏度

微球散射光图 荧光强度微球 FL1 荧光道分布











荧光强度微球 FL2 荧光道分布 荧光强度微球 FL3 荧光道分布











荧光强度微球 FL4 荧光道分布 FL1FL2荧光道双参数散点图


图 428 RCP305A 微球 BD 流式细胞仪荧光检测通道中直方图二维散点图
（RCP305A 1 种空白微球种具连续荧光强度混合荧光微球）


97
7 细胞 DNA 直方图鉴细胞凋亡 DNA 异倍体 G01 期细胞峰











二倍体 G01 期细胞峰左侧 1 二倍体 G01 期细胞峰左侧 1
独立细胞峰 明显斜肩峰




二




二倍体 G01 期细胞峰左侧 二倍体 G01 期细胞峰左侧
1 斜肩细胞峰 细胞峰 1 独立
图 4862 DNA 二倍体 G01 期细胞峰左侧鉴定细胞峰例举











DNA 直方图（ 50 道处 1 等高双峰） FL2Caspase3+细胞检出率（6465）
图 4863 Caspase3 鉴确定 DNA 异倍体 G01 峰方法

DNA 直方图二倍体 G01 期细胞峰前出现亚二倍体细胞峰
DNA 异倍体细胞峰凋亡细胞峰？ Caspase3 样品细胞作 Caspase3
+率增高时该细胞峰细胞凋亡细胞峰 Capase3+率低时该细胞峰
低 DNA 二倍体异倍体细胞 G01 期细胞峰 98
8 DNA 直方图鉴细胞增殖（SPF） DNA 异倍体 G01 细胞峰










原发性肝癌癌组织标(右斜肩峰) 胃癌淋巴结转移灶标(右肩峰)

图 4864 DNA 二倍体 G01 期细胞右肩峰例举











左：直方图（斜肩峰）右：分析图（红色二倍体 G01 峰黄色疑异倍体 GO1 峰）










CD71+细胞检出率 403显著低 DNA 含量分析 SPF 954

图 4865 标细胞 DNA 含量转铁蛋白受体（CD71+）表达关系分析
(FL1：CD71 细胞表达)

DNA 直方图二倍体 G01 细胞出现右肩峰时先 DNA 直方图作二倍体细胞周
期分析 SPF 率 CD71+细胞检出率接时该右肩峰增殖细胞 SPF 率显
著高 CD71+细胞检出率时该右肩峰 DNA 异倍体细胞 G01 峰 99
9 细胞凋亡细胞坏死细胞 DNA 直方图











图 4852 细胞坏死碎片峰 DNA 直方图
细胞碎片峰呈反抛物线形 DNA 直方图左侧左右呈高低分布特征该标
1 DNA 二倍体 G01 细胞峰（红色） 2 DNA 异倍体 G01 细胞峰（黄色绿色）











图 4853 凋亡细胞峰 DNA 直方图
DNA 二倍体细胞 G01 峰前出现呈称分布亚二倍体 DNA 含量细胞峰凋亡
细胞峰该标 1 DNA 二倍体 G01 细胞峰（红色） 1 DNA 异倍体细胞 G01 细
胞峰（黄色）










图 4854 细胞碎片凋亡时存 DNA 直方图
细胞 DNA 直方图 DNA 二倍体细胞 G01 峰前呈反抛物线形分布细胞碎片
峰呈称分布细胞凋亡峰 1 DNA 二倍体 G01 期细胞峰（红色） 1
DNA 异倍体 G01 期细胞峰（黄色） 100
(三) 细胞总蛋白质检测



















图 431 细胞总蛋白质含量分析

（横座标——细胞蛋白质含量座标——细胞数）


左图：细胞仅细胞峰巅峰值 70 道左右
右图：恶性肿瘤细胞 70 道左右处正样品相似细胞峰外 120 道
左右处出现高 PI 值细胞峰

1 例肝癌患者肿瘤细胞蛋白质总量特征：蛋白质含量增加蛋白质指数(PI171)增高













101
（四） RNA检测














细胞 RNA（左：直方图右：分析图）

(横座标——RNA 含量座标——检测细胞数)














恶性肿瘤细胞 RNA（左：直方图右：分析图）

图 441 细胞 RNA 含量分析


1例胃腺癌患者肿瘤细胞 RNA 分布特征：
RNA含量增加RNA 指数(RI1167)明显著增高




102
（五） 细胞 DNA 倍体分类

1DNA 含量分析参数



DNA 二倍体（D）细胞直方图 DNA二倍体（ND）细胞直方图


DNA 四倍体（T）细胞直方图 DNA非整倍体（AN）细胞直方图











DNA 异倍体（M）细胞直方图

图 451 细胞种 DNA 倍体类型DI 值细胞周期分析图
DI100 103
2 二倍体细胞（diploidD）：组织细胞中 1 DNA 干系DI100
（1）外周血 DNA 二倍体细胞直方图 (横座标——DNA 含量座标——细胞数)












正常外周血 DNA 二倍体直方图（CV 168）
（DDI 100G01 峰 CV 值极终末细胞明显增殖活性）











正常外周血 DNA 二倍体细胞直方图(CV357)
（DDI 100G01 峰 CV 值较终末细胞明显增殖活性）











1 例结肠腺癌患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图（CV514）
（DDI 100CV 值较明显增殖活性）

图 452 外周血 DNA 二倍体细胞直方图 104
（2）骨髓组织 DNA 二倍体细胞直方图











1 例 T 细胞性 NHL 患者骨髓 DNA 二倍体细胞直方图
（DDI 100SPF 348）











1 例恶性淋巴瘤患者骨髓 DNA 二倍体细胞直方图
（DDI 100SPF 158）
图 453 骨髓组织 DNA 二倍体细胞直方图

（3）粘膜活检组织 DNA 二倍体细胞直方图











1 例浅表性胃炎患者胃粘膜组织细胞 DNA 二倍体细胞直方图
（DDI 100SPF 341）
105









1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 二倍体细胞直方图（细胞凋亡峰）
(DDI 100SPF 231Apo 4132)
图 454 活检组织 DNA 二倍体细胞直方图

（4）实体组织 DNA 二倍体细胞直方图










1 例胃癌Ⅰ期患者癌组织 DNA 二倍体细胞直方图
（DDI 100SPF 104）
图 455 实体组织 DNA 二倍体细胞直方图

3 二倍体细胞(neardiploidND)：二倍体细胞外 1 异倍体干系细胞 DI090～
110

（1）外周血 DNA 二倍体细胞直方图










1 例恶性淋巴瘤患者化放疗 4 年外周血二倍体细胞直方图
（NDDI 109 二倍体 G01 期细胞肩峰） 106











1 例肺腺癌化疗患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 107 二倍体 G01 期细胞独立峰）










1 例胃癌手术患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 108 二倍体 G01 期细肩峰）













1 例喉癌术 6 月肺转移肝转移患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 109 二倍体 G01 期细胞明显肩峰）



107











1 例胃癌患者手术化疗患者外周血 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 107 二倍体 G01 期细胞独立峰）

图 456 外周血 DNA 二倍体细胞直方图

（2）骨髓组织 DNA 二倍体细胞直方图











1 例霍奇金淋巴瘤放化疗患者骨髓 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 106 二倍体 G01 期细胞斜肩峰）










1 例 HD放化治疗患者骨髓 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 109 二倍体 G01 期细胞独立峰CV 值）

图 457 骨髓组织 DNA 二倍体细胞直方图 108
（3）活检组织 DNA 二倍体细胞直方图











1 例肺腺癌患者癌组织穿剌细胞中 DNA 二倍体细胞直方图
（NDDI 108 二倍体 G01 期细胞独立峰）

图 458 活检组织 DNA 二倍体细胞直方图

（4）实体组织 DNA 二倍体细胞直方图














1 例细胞性肺癌患者癌组织 DNA 二倍体细胞直方图
（ND DI 109 二倍体 G01 期细胞独立峰）

图 459 实体组织 DNA 二倍体细胞直方图




109
4 四倍体细胞（tetraploidT）： DNA 二倍体细胞外 1 DNA 干系细胞 DI
值 190～210 间

（1）外周血 DNA 四倍体细胞直方图












1 例恶性淋巴瘤合白血病患者外周血 DNA 四倍体细胞直方图
（TDI 190 四倍体 G01 期细胞巨峰）

图 4510 外周血 DNA 四倍体细胞直方图



（2）体腔液 DNA 四倍体细胞直方图












1 例左乳腺癌术化疗转移患者胸水 DNA 四倍体细胞直方图
（TDI 200 四倍体 G01 期细胞峰）

图 4511 体腔液 DNA 四倍体细胞直方图


110
（3） 实体组织 DNA 四倍体细胞直方图











1 例卵巢癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞直方图
（TDI 197 四倍体 G01 期细胞峰）












1 例乳腺癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞直方图
（TDI 197 四倍体 G01 期细胞较峰）











1 例结肠癌患者癌组织 DNA 四倍体细胞直方图
（T DI 203 四倍体 G01 期细胞巨峰）

图 4512 实体瘤组织 DNA 四倍体细胞直方图
111
5 非整倍体细胞(aneuploid AN)：二倍体细胞外 1 DNA 异倍体干系细胞DI
值 <090 >110外 T 细胞
（1）外周血 DNA 非整倍体细胞直方图










1 例结肠癌手术化疗 15 天患者外周血 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 129 非整倍体 G01 期细胞巨峰）










1 例霍奇金淋巴瘤患者外周血 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 123 非整流器倍体 G01 期细胞巨峰）

图 4513 外周血 DNA 非整倍体细胞直方图

（2）骨髓组织 DNA 非整倍体细胞直方图











例细胞性肺癌患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 115 低 DI 值非整倍体 G01 期细胞肩峰） 112











1 例乳腺癌术 20 天患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 111 低 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰）












1 例非霍奇金淋巴瘤患者骨髓 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 130 非整倍体 G01 期细胞较峰）

图 4514 骨髓组织 DNA 非整倍体细胞直方图

（3）体腔液 DNA 非整倍体细胞直方图











1 例胃癌转移出现黄疸患者胸水 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 119 低 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰） 113










1 例肺癌伴胸水心包积液肿瘤转移患者胸水 DNA 非整倍体细胞
（ANDI 257 高 DI 值 DNA 非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4515 体腔液 DNA 非整倍体细胞直方图

（4）活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图












1 例肺癌淋巴结转移患者肺癌组织剌穿细胞 DNA 非整倍体直方图
（ANDI 274 高 DI 值 G01 期细胞峰）










1 例肺癌淋巴结转移患者肺癌组织穿剌细胞 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 247 高 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4516 穿剌组织 DNA 非整倍体细胞直方图 114











1 例宫颈癌患者活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI113 低 DI 值非整倍体 G01 期细胞肩峰）












1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 156 非整倍体 G01 期细胞峰）












1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 124 DNA 非整倍体 G01 期细胞峰）


115












1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 224 非整倍体 G01 期细胞峰）











1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 214 非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4517 活检组织 DNA 非整倍体细胞直方图











1 例舌白斑患者口腔粘膜细胞 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 116 非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4518 粘膜组织 DNA 非整倍体细胞直方图 116
（5）肿瘤淋巴结转移灶 DNA 非整倍体细胞直方图











1 例胃癌术复发患者手术转移淋巴结 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 值 113 低 DI 值非整倍体 G01 期细胞肩峰）











1 例肝细胞癌患者淋巴结转移灶 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 401 高 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4519 肿瘤淋巴结转移灶 DNA 非整倍体细胞直方图

（6）实体组织 DNA 非整倍体细胞直方图











1 例卵巢癌网膜转移患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 167 非整倍体 G01 期较细胞峰） 117













1 例食癌患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 256 高 DI 值非整倍体 G01 期巨细胞峰）












1 例直肠癌患者癌组织 DNA 非整倍体细胞直方图
（ANDI 415 高 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰）

图 4520 实体组织 DNA 非整倍体细胞直方图










6 异倍体(multiploidM)：二倍体细胞外 2 2 DNA 异倍体干系细胞
包括：2 AN3 ANA N+TAN+NDT+ND2 AN+ND2 AN+T 等等
118
（1） 骨髓组织 DNA 异倍体细胞直方图

















1 例胃恶性淋巴瘤患者骨髓组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 111 非整倍体 G01 期细胞肩峰 DI 值 137 非整倍体 G01 期细胞
斜肩峰）














1 例乳腺癌患者骨髓组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 122 非整倍体 DI 193 四倍体 G01 期细胞峰）

图 4521 骨髓组织 DNA 异倍体细胞直方图




119
（2）体腔液 DNA 异倍体细胞直方图














1 例非霍奇金淋巴瘤患者脑脊液中 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 107 二倍体 G01 期细胞峰 DI 141 非整倍体 G01 期细胞峰）














1 例肺癌伴胸腔积液肿瘤转移患者血性胸水 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 110 二倍体 G01 期细胞峰 DI 258 高 DI 值非整倍体 G01
期细胞峰）


图 4522 体腔液 DNA 异倍体细胞直方图






121
（3）实体组织 DNA 异倍体细胞直方图












1 例乳腺癌患者癌组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 179 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 245 高 DI 值非整倍体 G01 期细胞
峰）











1 例嗜铬细胞瘤患者瘤组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 151 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 204 四倍体 G01 期细胞峰）












1 例膀胱癌患者癌组织细胞 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 171 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 299 非整倍体 G01 期细胞峰）
122











1 例结肠癌复发转移患者癌组织细胞 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 155 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 179 非整倍体 G01 期细胞
峰伴明显细胞碎片）













1 例卵巢癌化疗患者癌组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 119 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 206 四倍体 G01 期细胞峰）












1 例脑膜瘤患者瘤组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 110 二倍体 G01 期细胞峰 DI 139 非整倍体 G01 期细胞峰
伴细胞碎片） 123












1 例肝细胞癌患者癌组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 DI 203 四倍体峰 DI 248 高 DI 值非整倍体 G01 期细胞峰）


图 4524 实体组织 DNA 异倍体细胞直方图


























124
六DNA 倍体异质性分析


















图 461 部位取材检测肿瘤组织 DNA 倍体异质性示意图

（1 23 肿瘤组织取材部位）

1 2 3 3 块肿瘤组织细胞 DNA 直方图果 3 块组织中原意 2
块组织 DNA 异倍体 G01 期细胞 DI 值间相差>020 时克隆细胞该肿瘤 DNA
倍体异质体肿瘤果 3 块肿瘤组织中组织 DNA 异倍体克隆细胞 DI 值差均<020
时克隆该肿瘤 DNA 倍体质体肿瘤两 DI 值<02 确已形成 2 独
立细胞峰视细胞克隆

DNA 倍体质体包括： DNA 二倍体质体肿瘤
DNA 二倍体质体肿瘤
DNA 四倍体质体肿瘤
DNA 非整倍体质体肿瘤
DNA 异倍体质体肿瘤
DNA 倍体异质体肿瘤包括：
DNA 二倍体种 DNA 异倍体组合
种 DNA 异倍体类型间非整倍体类型间组合

DNA 倍体异质性分析包括：
肿瘤原发灶部位组织 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶浸润灶 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶转移灶 DNA 倍体异质性分析
肿瘤原发灶复发灶 DNA 倍体异质性分析

1

2



3 125
1 肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析(1)——质体肿瘤

（1）DNA 二倍体异质性分析












癌1：DI 值 100——DNA 二倍体细胞SPF 1237










癌2：DI 值 100——DNA 二倍体细胞SPF 17 3











癌3：DI 值 100——DNA 二倍体细胞SPF 1813

图 462 1 例乳腺癌患者二倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现相克隆 DNA 二倍体细胞该肿瘤：DNA 倍体质体肿瘤
126
（2）DNA 单异倍体（四倍体）异质性分析












癌1：DI 值 100 203 ——DNA 四倍体细胞SPF 614











癌2：DI 100 203——DNA 四倍体细胞SPF 1080












癌3：DI 100 202——DNA 四倍体细胞SPF 753

图 463 1 例食癌患者四倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现克隆 DNA 异倍体细胞克隆DI 值：203203202
该肿瘤：DNA 倍体质体肿瘤 127
（3）DNA 单异倍体（非整倍体）异质性分析：











癌1：DI 100 189——DNA 非整倍体细胞SPF 100











癌2：DI 100 182——DNA 非整倍体细胞SPF 159











癌3：DI 100 176——DNA 非整倍体细胞SPF 404

图 464 1 例右侧卵巢癌患者非整倍体肿瘤组织 DNA 干系异质性分析

3 块组织均 DNA 非整倍体细胞克隆
DNA 异倍体克隆 DI 值分：189182176属 DNA 异倍体克隆 DNA
非整倍体 G01 细胞峰
该肿瘤：DNA 倍体质体肿瘤 128
（4）DNA 异倍体异质性分析：











癌1：DI 100112178 221——DNA 异倍体细胞SPF 691











癌2：DI 100113180 220——DNA 异倍体细胞SPF 1606











癌3：DI 100113183 223——DNA 异倍体细胞SPF 1075

图 465 1 例结肠癌患者异倍体肿瘤患者 DNA 克隆异质性分析

3 块组织均出现相 DNA 异倍体细胞克隆
3 DNA 异倍体克隆：① 112113113② 178180183③ 221220223
异倍体克隆分布：癌1：①②③癌2：①②③癌3：①②③
该肿瘤：DNA 倍体质体肿瘤 129
2肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析(2)——异质体肿瘤











癌1：DI 100115 218——DNA 异倍体细胞SPF 1317











癌2：DI 100112 220——DNA 异倍体细胞SPF 823











癌3：DI 100113250——DNA 异倍体细胞SPF 1639

图 466 1 例乳腺癌患者异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 DNA 非整倍体细胞克隆
3 DNA 异倍体克隆：① 112113115② 218220③ 250
异倍体克隆分布：癌1：①②癌2：①②癌3：①③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 130











癌1：DI 100 185——DNA 非整倍体细胞SPF 817











癌2：DI 100 181——DNA 非整倍体细胞SPF 080











癌3：DI100114 237——DNA 异倍体细胞SPF 783


图 467 1 例肺癌患者异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织中出现 2 非整倍体 1 异倍体细胞克隆
3 DNA 异倍体克隆：① 114② 181185③ 237
异倍体克隆组织中分布：癌1：②癌2：②癌3：①③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 131











癌1：DI 100131 247——异倍体细胞SPF 817











癌2：DI 100110 140——DNA 异倍体细胞SPF 436











癌3：DI 100127 144——DNA 异倍体细胞SPF 939


图 468 1 例贲门癌患者异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织中出现二倍体非整倍体异倍体细胞克隆
4 异倍体克隆：① 110② 127131③ 140144④ 247
异倍体克隆分布：癌1：②④癌2：①②癌3：② ③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 132











癌1：DI 100 186——DNA 非整倍体细胞SPF 129











癌2：DI 100175 195——DNA 异倍体细胞SPF 259











癌3：DI 100117 195——DNA 异倍体细胞SPF 1171

图 469 1 例肠癌异倍体肿瘤患者 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 1 非整倍体克隆 2 异倍体细胞克隆
DNA 异倍体克隆：① 117② 175186③ 195
异倍体克隆组织中分布：癌1：②癌2：②③癌3：①③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤
133











癌1：DI 100 187——DNA 非整倍体细胞SPF 705












癌2：DI100126189——DNA 异倍体细胞SPF1860












癌3：DI 100112 199——DNA 异倍体细胞 SPF 1049

图 4610 1 例直肠癌患者异倍体肿瘤 DNA 干系异质性分析
3 块组织出现 1 非整倍体 2 异倍体细胞克隆
2 DNA 异倍体克隆：① 112126②187189199
异倍体克隆分布：癌1：②癌2：①②癌3：①②
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 134











癌1：DI 100 169——DNA 非整倍体细胞SPF 191











癌2：DI 100107 177——DNA 异倍体细胞SPF 387











癌3：DI 100117 206——DNA 异倍体克隆SPF 1089

图 4611 1 例卵巢癌子宫直肠转移患者异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 1 非整倍体 2 异倍体细胞克隆
4 DNA 异倍体克隆：① 107② 117③ 169177④ 206
异倍体克隆分布：癌1：③癌2：①③癌3：②④
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 135











癌1：DI 100 114——DNA 非整倍体细胞 SPF 1316











癌2：DI 100114 154——DNA 异倍体细胞 SPF 341











癌3：DI 100134 160——DNA 异倍体细胞SPF 1080


图 4612 1 例食癌患者异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 1 非整倍体 2 异倍体细胞克隆
3 DNA 异倍体克隆：① 114114② 134③ 154160
异倍体克隆分布：癌1：①癌2：①③癌3：②③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 136










癌1：DI 100110 200——DNA 异倍体细胞SPF 1577










癌2：DI 100107 147——DNA 异倍体细胞 SPF 1147












癌3：DI 100110 172——DNA 异倍体细胞SPF 637


图 4613 1 例肝细胞癌患者异倍肿瘤患者 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 3 异倍体细胞克隆
4 DNA 异倍体克隆：① 107110② 147③ 172④ 200
异倍体克隆分布：癌1：①④癌2：①②癌3：①③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤
137











癌1：DI 100127 144——DNA 异倍体细胞SPF 939











癌2：DI 100131 247——DNA 异倍体细胞 SPF 817











癌3：DI 100111 140——DNA 异倍体细胞 SPF 436


图 4614 1 例胰头癌患者异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 3 异倍体细胞克隆
4 DNA 异倍体克隆：① 111② 127131③ 140144④ 247
异倍体克隆分布：癌1：②③癌2：②④癌3：①③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 138











癌1：DI 100108 166——DNA 异倍体细胞SPF 3091




错






癌2：DI 100110 170——DNA 异倍体细胞SPF 3463











癌3：DI 100134 160——DNA 异倍体细胞SPF 1080


图 4615 1 例卵巢肿瘤患者异倍肿瘤 DNA 干系异质性分析

3 块组织出现 3 异倍体细胞克隆
3 DNA 异倍体克隆：① 108110② 134③ 160166170
异倍体克隆分布：癌1：①③癌2：①③癌3：②③
该肿瘤：DNA 倍体异质体肿瘤 139
3 肿瘤原发灶 DNA 倍体异质性分析床意义

（1） 肿瘤 DNA 倍体异质性特征肿瘤克隆起源












癌1：DNA 二倍体细胞二倍体克隆起源肿瘤











癌2：DNA 非整倍体细胞非整倍体克隆起源肿瘤












癌3：DNA 异倍体细胞克隆起源肿瘤

图 4616 DNA 倍体异质性肿瘤克隆起源
——1 例乳腺癌患者肿瘤部位组织 DNA 倍体细胞克隆起源分析 140
（2） DNA倍体异质性肿瘤克隆组合特征











癌1：DNA 非整倍体1（DI123）











癌2：DNA 非整倍体2 (DI236)











癌3：DNA 异倍体DNA 非整倍体1+DNA 非整倍体2


图 4617 DNA 倍体异质性肿瘤克隆组合特征

——1 例肺癌患者肿瘤部位组织 DNA 倍体异质性分析
141
（3） DNA倍体异质性异倍体克隆形成程












癌1：DNA 二倍体细胞未见 DNA 异倍体










癌2： DNA 二倍体 G01 细胞峰出现右肩峰——疑 DNA 异倍体












癌3：明显 DNA 异倍体细胞独立峰——DNA 异倍体形成


图 4618 DNA 倍体异质性肿瘤克隆形成（1）

1 例直肠癌患者肿瘤部位组织 DNA 倍体异质性分析：3 块组织 DNA 二倍体→疑
DNA 异倍体→DNA 异倍体 142












癌1：DNA 二倍体 G01 期细胞右肩峰——疑异倍体细胞


癌2：明显 DNA 异倍体细胞峰（DI143）




癌3： 1 异倍体峰（DI151 癌2 相似）外 1 异倍体（DI173）细胞峰

图 4619 DNA 倍体异质性肿瘤克隆形成（2）

1 例贲门癌患者部位肿瘤组织 DNA 倍体异质性分析：3 块肿瘤组织疑异倍体→1
异倍体→2 异倍体 143
（4）骨髓细胞 DNA 倍体异质性化疗效果





患者肿瘤化学治疗前：骨髓细胞异倍
体细胞占 802DI 值 184
非整倍体（AN）床病情严重







肿瘤化学治疗中：患者骨髓 DNA 异
倍体峰显著降低仅占 174DI 值
184床出现缓解






化学治疗：患者骨髓 DNA 异倍体
峰完全消失床出现完全缓解



1 例 NHL 患者化疗程中三次
检测骨髓细胞 DNA 倍体变化
图

绿色直方图——第 1 次检测
红色直方图——第 2 次检测
蓝色直方图——第 3 次检测


图 4620 DNA 倍体异质性疗效观察



144
4肿瘤原发灶淋巴结转移灶细胞 DNA 倍体异质性分析



癌灶：DI 100 114——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 492














转移淋巴结：DI 100 114——DNA 非整倍体细胞（AN） SPF 279


图 4622 1 例胃癌患者癌灶淋巴结转移灶 DNA 倍体异质性分析
——二者相 AN 克隆



癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆
转移淋巴结： 1 相 DNA 倍体克隆
癌原发灶转移淋巴结：DNA 倍体质体肿瘤

145




癌灶：DI 100 117——DNA 非整倍体细胞（AN） SPF 453




转移淋巴结：DI 100113 129——DNA 异倍体细胞（M） SPF 1475

图 4621 1 例结肠癌患者癌灶淋巴结转移灶 DNA 倍体异质性分析
——1 AN1 M 细胞克隆

癌原发灶： 1 DNA 非整倍体克隆
转移淋巴结： 1 癌灶相 DNA 非整倍体克隆外 1 非整倍体克隆 M
癌原发灶转移淋巴结：DNA 倍体异质体肿瘤


146














癌灶 ：DI 100117 308——DNA 异倍体细胞（M） SPF 538




转移淋巴结：DI 100194 322——DNA 异倍体细胞（M）SPF 167


图 4623 1 例直肠癌患者癌灶淋巴结转移灶 DNA 倍体异质性分析
—— M 细胞克隆


癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆1 高 DI 值（308）非整倍体克隆
转移淋巴结：1 DNA 四倍体克隆1 高 DI 值（322）非整倍体克隆
癌原发灶转移淋巴结：DNA 倍体异质体肿瘤



147





癌灶：DI 100121 207——DNA 异倍体细胞（M）SPF 2533
















转移淋巴结：DI 100117 405——DNA 异倍体细胞（M）SPF 1060


图 4624 1 例原发性肝细胞癌患者癌灶淋巴结转移灶 DNA 倍体异质性分析
—— M 细胞克隆


癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆1 DNA 四倍体克隆
转移淋巴结：1 DNA 非整倍体克隆1 高 DI 值（405）非整倍体克隆
癌原发灶转移淋巴结： DNA 倍体异质体肿瘤
148




癌灶：DI 100110 159——DNA 异倍体细胞（M）SPF 282





转移淋巴结：DI 100 109——DNA 二倍体细胞（ND）SPF 1060


图 4625 1 例食癌患者癌灶淋巴结转移灶 DNA 倍体异质体分析
2 相 ND 外癌灶 1 AN


癌原发灶：1 DNA 二倍体克隆1 DNA 非整倍体克隆
转移淋巴结：1 DNA 二倍体克隆
癌原发灶转移淋巴结： DNA 倍体异质体肿瘤

149

5肿瘤原发灶癌旁组织细胞 DNA 倍体异质性分析




癌灶：DI 100 118——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 1158



癌旁：DI 100 118——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 1475


图 4626 1 例原发性肝细胞癌患者癌灶癌旁组织 DNA 倍体异质性分析
——2 相 AN 细胞克隆


癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆
癌旁组织：1 相 DNA 非整倍体克隆
癌原发灶癌旁组织：DNA 倍体质体肿瘤

150



癌灶：DI 100121 206——DNA 异倍体细胞（M）SPF 1044




癌旁：DI 100112 196——DNA 异倍体细胞（M）SPF 1369


图 4628 1 例胃癌患者癌灶癌旁组织 DNA 倍体异质性分析
——2 M 细胞克隆



癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆1 四倍体细胞克隆
癌旁驵织：1 DI 值相 DNA 非整倍体克隆1 DI 值相四倍体细胞克隆
癌原发灶癌旁组织 DNA 倍体质体肿瘤
151



癌灶：DI 100 248——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 438




癌旁：DI 100 120——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 243



图 4627 1 例胰腺癌患者癌灶癌旁组织 DNA 倍体异质性分析
——2 AN 细胞克隆


癌原发灶：1 DNA 高 DI 值(DI248)非整倍体克隆
癌旁组织：1 DNA 非整倍体克隆
癌原发灶癌旁组织：DNA 倍体异质体肿瘤


152



癌灶：DI 100 125——DNA 非整倍体细胞（AN）SPF 216




癌旁：DI 100——DNA 二倍体细胞（D）SPF 344


图 4629 1 例乳腺癌患者癌灶癌旁组织 DNA 倍体异质性分析
——AN D 细胞克隆


癌原发灶：1 DNA 非整倍体克隆
癌旁组织：1 DNA 二倍体克隆
癌原发灶癌旁组织 DNA 倍体异质体肿瘤


153
(七) 类体细胞染色体流式细胞术检测














图 471 类男性体细胞 46 条染色体 DNA 含量直方图












图 472 类男性体细胞 46 条染色体 DNA 含量等高线图












图 473` 类体细胞染色体三维立体图
CA3 154
八 细胞动力学参数检测



















图 481 细胞周期相关参数示意图






















图 482 细胞凋亡信号传导相关蛋白表达示意图 155



CD71(转铁蛋白受体)
AnnexinⅤ（磷脂结合蛋白）
EMA（皮膜抗原）
Apo27（线粒体膜抗原）


PI DNA（DNA 含量分析）
Ki67（类细胞核抗原）
BrdU（5溴脱氧尿嘧啶核苷）
Caspase3（半光氨酸蛋白酶）
TUNEL(末端脱氧核苷酰转移酶)
PCNA（增殖细胞核抗原）
CEA (癌胚抗原)
CK（细胞角蛋白）


图 483 细胞增殖细胞凋亡检测指标示意图


细胞动力学常参数检测方法：
细胞增殖：DNA 含量分析法——SPFPI 法
PCNA+细胞表达水检测法
Ki67+细胞表达水检测法
CD71+细胞表达水检测法
Brdu 单抗掺入水检测法

细胞凋亡：PIDNA 含量检测——亚二倍体峰分析法
Apo 27 检测法
AnnexinVFITCPI 检测法
Caspase3 检测法
TUNEL 检测法

细胞分化：CEA 检测法(carcinoembryonic antigenCEA)
CK 检测法（cytokeratinCK）
EMA 检测法(epithelia membrane antigenEMA)
156
1细胞增殖活性检测

（1） DNA 含量测定法










正常外周血细胞 DNA 含量直方图 肿瘤患者外周血细胞 DNA 含量直方图
SPF 025 SPF 102











正常骨髓细胞 DNA 含量直方图 肿瘤化疗骨髓细胞 DNA 含量直方图
SPF 293 SPF 378











肿瘤组织非整倍体细胞 DNA 患者肿瘤组织异倍体细胞 DNA
含量直方图 SPF 1418 含量直方图 SPF 2852

图 484 DNA 含量分析法检测种细胞 S期细胞率 157












药物剂量 200mg 时SPF 3803 药物剂量 100mg 时SPF 4125











药物剂量 50mg 时SPF 4464 药物剂量 25mg 时SPF 4634












药物剂量 125mg 时SPF 5139 组未加药时SPF 6631

图 485 DNA 含量分析法检测白血病 K562 细胞 S期细胞例（SPF）

——药物 K562 细胞增殖抑制作剂量增加增加SPF 越越 158
（2）增殖细胞核抗原（PCNA）检测细胞增殖活性










乳
1 例胃腺癌患者外周血细胞 1例 NHL 患者骨髓细胞
PCNA+细胞 1698 PCNA+细胞 4449










1例恶性淋巴瘤患者肿瘤组织 1例肠癌患者淋巴结转移灶细胞
PCNA+细胞 7373 PCNA+细胞 8624











1例原发性肝细胞癌转移患者腹水细胞 1例肠癌肝转移患者肝癌细胞
PCNA+细胞 9410 PCNA+细胞 9912

图 486 增殖细胞核抗原肿瘤组织中表达

(FL1H：PCNAFITC) 159








骨髓组织
PCNA+细胞 1832











淋巴结转移灶
PCNA+细胞 6456













肿瘤组织
PCNA+细胞 9932




图 487 1 例肺腺癌患者组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达
(FL1H：PCNAFITC) 160
（3） Ki67 检测细胞增殖活性








1 例胃癌患者癌旁 7cm 正常胃
粘膜组织标 Ki67+细胞表达率
1845










1 例乳腺癌患者肿瘤组织标
Ki67+细胞表达率 4918









1 例乳腺癌患者腋窩淋巴结转移
灶标 Ki67+ 细胞表达率
7324




图 488 Ki67 肿瘤患者组织中表达
(FL1：Ki67FITC) 161

1 例卵巢癌病理Ⅰ级患者瘤组织 1例宫颈癌病理Ⅰ级患者瘤组织
Ki67+细胞 034 Ki67+细胞 462


1 例卵巢癌病理Ⅱ级患者瘤组织 1例宫颈癌病理Ⅱ级患者瘤组织
Ki67+细胞 3465 Ki67+细胞 4722


1 例卵巢癌病理Ⅲ级患者瘤组织 1例宫颈癌病理Ⅲ级患者瘤组织
Ki67+细胞 8931 Ki67+细胞 9946

图 489 卵巢癌宫颈癌患者肿瘤组织 Ki67+细胞表达率病理分级 162
（4） CD71 检测细胞增殖活性




外周血细胞
CD71+细胞 146












骨髓细胞
CD71+细胞 187











肿瘤组织细胞
CD71+细胞 1854







图 4810 1 例乳腺癌患者组织转铁蛋白受体（CD71+）细胞表达

（FL1：CD71FITC） 163












1 例恶性淋巴瘤患者外周血 1例乳腺癌患者肿瘤组织
CD71+细胞 211 CD71+细胞 643











1 例乳腺癌双肺转移患者骨髓组织 1例肺癌患者肿瘤组织
CD71+细胞 755 CD71+细胞 1171











1 例 T 细胞性 NHL 患者骨髓组织 1例肠癌腹腔转移患者骨髓组织
CD71+细胞 3987 CD71+细胞 4765

图 4811 种肿瘤患者肿瘤组织 CD71+细胞表达 164
（5） Brdu 单克隆抗体检测细胞增殖活性
BrdU 取代 TDR（胸腺嘧啶核苷）参加细胞 DNA 合成荧光标记 Brdu 抗体
掺入量先鼠腹腔注射 Brdu6h 注入 FITC 荧光标记抗 Brdu 抗体采流式
细胞术检测胸腺细胞 BrdU 掺入量进解胸腺细胞增殖状况




图 4812 鼠胸腺细胞 Brdu 掺入前细胞增殖活性变化
左：样品——细胞增殖率（M2） 274
右：实验样品——细胞增殖率（M2） 3652














右限：BrdU+ 细胞 4696 M2：BrdU+细胞 4678


图 4813 Brdu 单抗掺入胸腺细胞流式细胞分析结果表达方法
（左：荧光散点图 右：荧光直方图）

165
5细胞周期素检测





图 4814 细胞周期素细胞周期时相中表达



加段文字









166











1 例肺癌患者瘤组织穿剌细胞 1例肺癌隔淋巴结转移患者瘤组织
cyclinD3+细胞 251 cyclinD3+细胞 368

组









1 例肺癌伴胸水患者瘤组织 1例肺癌伴胸水患者瘤组织
cyclinD3+细胞 2352 cyclinD3+细胞 2854


组







织
1 例肺癌复发患者瘤组织 1例肺癌脑转移患者瘤组织
cyclinD3+细胞 3465 cyclinD3+细胞 6186


图 4815 癌组织细胞中周期蛋白（Cyclin D3）表达水
（FL1：cyclin D3 FITC）
167
2细胞凋亡检测

⑴ 早早期细胞凋亡检测——半胱氨酸蛋白酶（Caspase3 ）法：























图 4816 Caspasesc 介导细胞凋亡级联反应原理


化疗前 Caspase3+检出率 349 化疗 Caspas3+检出率 9486

图 4817 1 例胃癌患者化疗前胃镜活检组织 Caspase3+细胞检出率
(FL2：Caspase3FITC) 168








1 例乳腺癌患者肿瘤组织
caspase3+细胞检出率 351










1 例肺癌患者化疗肿瘤组织
caspase3+细胞检出率 54 68










1 例胃癌淋巴结转移患者化疗肿
瘤组织 caspase3+ 细胞检出率
9782




图 4818 肿瘤组织 Caspase3+细胞表达
(FL2：Caspase3FITC)
169
（2）早期细胞凋亡检测——AnnexinVPI 法
























死亡细胞










活细胞 凋亡细胞



图 4820 细胞凋亡 AnnexinVPI 检测结果(换)




图 4819 Annexin VPI 法检测细胞凋亡原理示意图


AnnexinVPI 法原理：细胞凋亡时细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）细
胞膜侧移位细胞膜外侧（细胞表面）PS AnnexinVFITC 结合
利 PI 分子通活细胞膜特性流式细胞术检测分析
AnnexinVFITC+PI–细胞细胞早期凋亡细胞 170






样品











塞米松(100 μM 4h )样品












喜树碱 (100 μgml 4h)
样品






图 4821 AnnexinVPI 法药前细胞凋亡指数变化检测
FL1：AnnexinVFITC FL2：PI
（绿色——凋亡细胞蓝色——活细胞红色——死亡细胞） 171







外周血细胞
——1 例脑膜瘤患者
细胞凋亡指数 824








骨髓组织细胞
——非霍奇金淋巴瘤患者
细胞凋亡指数 542









肿瘤组织细胞
——1 例卵巢癌患者
细胞凋亡指数 283







图 4822 采 Annexin VPI 法检测凋亡细胞组织中表达
（FL1：AnnexinVFITC FL2：PI）
172








1 例乳腺癌患者外周血细胞
凋亡指数 0











1 例肺腺癌患者外周血细胞
凋亡指数 314












1 例胃癌患者化疗外周血细胞
凋谢亡指数 1058





图 4823 AnnexinVPI 法检测外周血凋亡细胞表达水 173
（3）早期细胞凋亡检测——细胞线粒体膜蛋白（Apo27）法

点









阴性样品

点









检测阳性样品

图 4824 流式细胞术 Apo27 检测细胞凋亡表示方法
（左：散点图右：直方图）










1 例 NHL 化疗患者外周血 1例左乳癌患者瘤组织
Apo27+细胞 8953 Apo27+细胞 142

图 4825 Apo27+细胞肿瘤组织中表达
(FL2：Apo27PE) 174









1 例口腔粘膜扁苔癣癌变患者
外周血 Apo27+细胞 032










1 例转移性骨癌患者外周血
Apo27+细胞 3946











1 例肺腺癌手术化疗
外周血 Apo27+细胞 9556





图 4826 种肿瘤患者外周血 Apo27+细胞表达
175
（4）早期细胞凋亡检测——HoechstPI 染色法

染色原理：Hoechst 33242 种活细胞着色染料（绿色荧光）PI 种
死细胞着色（细胞膜通透性强红色荧光）细胞凋亡特性具完整细胞膜
凋亡细胞 PI 着色 Hoechst 33242 着色 PIHoechst+细胞凋亡
细胞


图 4827 Hoechst 33242PI 染色法测定细胞群中凋亡细胞
（蓝色：活细胞红色：死细胞绿色：凋亡细胞）


（5）晚期细胞凋亡检测——TUNEL 法



正








图 4828 鼠脑缺血导致脑细胞凋亡水升高(FL1：TDTFITC)

（左：样品 TdT+细胞 464右：实验样品 TdT+细胞 3154）



176
(6) 晚晚期细胞凋亡检测——DNA 含量分析法

































图 4829 细胞凋亡形态学变化






177
① 外周血细胞凋亡检测











图 4830 1 例食中段癌腹腔淋巴结转移放疗中患者细胞凋亡
(凋亡细胞峰 342)












图 48 31 1 例胃癌患者手术化疗外周血细胞细胞凋亡
(较凋亡细胞峰 727 )













图 4832 1 例急性淋巴细胞性白血病化疗患者外周血细胞细胞凋亡
(独立凋亡细胞峰1804)
178











图 4833 1 例肺癌脑转移化疗患者外周血细胞细胞凋亡
（凋亡细胞肩峰2522 ）













图 4834 1 例食段贲门癌化疗患者外周血细胞细胞凋亡
（CV 值较凋亡细胞峰3211）













图 4835 1 例左肺鳞癌患者隔淋巴结转移化疗外周血细胞细胞凋亡
（CV 值较巨细胞凋亡3433）
179











图 4836 1 例肠癌患者化疗外周血细胞凋亡
（巨细胞凋亡峰5073）












图 4837 1 例非霍奇金淋巴瘤化疗放疗患者外周血细胞凋亡
（巨凋亡细胞峰5967）












图 4838 1 例恶性淋巴瘤患者外周血细胞凋亡
（细胞凋亡峰2880 伴异倍体） 180
② 骨髓细胞细胞凋亡检测












图 4839 1 例细胞肺癌患者化疗中骨髓细胞凋亡
（较细胞凋亡峰1971）











图 4840 1 例非霍奇金淋巴瘤患者化疗中骨髓细胞凋亡
（巨细胞调亡峰3599）











图 4841 1 例宫颈鳞癌患者放疗中骨髓细胞凋亡
（巨细胞凋亡峰4981） 181











图 4842 B 系恶性淋巴瘤患者化疗中骨髓细胞凋亡
（巨细胞凋亡峰2023 伴异倍体）


③ 体腔液细胞凋亡检测










图 4843 1 例胃恶性淋巴瘤合白血病患者化疗放疗脑脊液细胞凋亡
（较细胞凋亡峰1272 伴异倍体）












图 4844 1 例卵巢恶性肿瘤患者腹水细胞凋亡
（较细胞凋亡峰1655 伴异倍体）

182
④ 转移淋巴结细胞凋亡检测











图 4845 1 例食中段癌患者食旁转移淋巴结细胞凋亡
（较细胞凋亡峰283 伴异倍体)

⑤ 癌组织细胞凋亡










图 4846 1 例胃癌患者化疗癌组织细胞凋亡
（明显细胞凋亡峰1344）











图 4847 1 例左乳腺癌患者癌组织细胞凋亡

（明显凋亡细胞峰480 伴异倍体）

183
⑥ 培养细胞细胞凋亡












图 4848 家兔血皮细胞药物浓度 50μU ml 培养 3h 凋亡
（细胞凋亡峰2143）













图 4849 家兔血皮细胞药物浓度 125μU ml 培养 3h 凋亡
（较细胞凋亡峰4623）












图 4850 家兔血皮细胞药物浓度 20μU ml 培养 3h 凋亡
（巨细胞凋亡峰6370） 184


图 4851 SGC7901 细胞（胃癌细胞株）呋尿嘧啶处理前细胞凋亡
（凋亡细胞峰105）











图 4852 SGC7901 细胞（胃癌细胞株）呋尿嘧啶处理 12h 细胞凋亡
（较细胞凋亡峰655）














图 4853 SGC7901 细胞（胃癌细胞株）呋尿嘧啶处理 24h 细胞凋亡
（细胞凋谢亡峰3749） 185
3细胞分化检测

（1） 细胞角蛋白抗原（CK）







1 例肺癌患者肿瘤组织
CK+细胞 3216











1 例胃癌复发患者肿瘤组织
CK+细胞 6432











1 例肝癌骨转移患者肿瘤组织
CK+细胞 9866




图 4860 细胞角蛋白（CK）肿瘤组织细胞中表达
（FL1：CKFITC） 186
（2） 癌胚抗原（CEACD66e）


组








1例肺炎患者炎症灶穿剌细胞中 1例卵巢囊肿患者卵巢组织
CEA+细胞 723 CEA+细胞 426

组









1例肠癌患者肿瘤组织 1例食癌患者肿瘤组织
CEA+细胞 3972 CEA+细胞 3743








癌


组
1 例胃癌患者肿瘤组织 1例肠癌患者肿瘤组织
CEA+细胞 4939 CEA+细胞 8776

图 4861 种癌组织中癌胚抗原（CEA+ CD66e+）表达
（FL1：CD66eFITC） 187
（九） 机体免疫功检测





































图 491 外周血免疫细胞间相互关系图




188
















图 492 细胞免疫反应原理示意图
(细胞表面抗原带荧光标记抗体特异性结合形成荧光抗原抗体复合物流式细胞仪
检测细胞荧光强度荧光标记细胞相数判断免疫细胞数量绝数)



图 493 外周血免疫细胞散射光种细胞分布

（红色细胞群 淋巴细胞绿色细胞群：单核细胞桃红色细胞群：粒细胞）
189






图 494 类外周血细胞流式细胞术检测参数览表



N
L
M 190
1 外周血 TBNK 细胞步检测法


散射光图 右限：CD45+细胞

左限：B 细胞 左限：NK 细胞右限：T 细胞

右限：T 细胞右限：Ts 细胞 右限：Th 细胞
图 495 外周血 TBNK 细胞六色免疫表型分析
PAINT A GATE 软件进行外周血 6 色荧光分析：图呈灰色点表示未染色细胞
T 辅助细胞（Th）： CD3+CD8CD4+CD19 287 (紫色)
T 抑制细胞毒 T 细胞(Ts)： CD3+CD8+CD4CD19 136 （红色）
B 细胞(BC)： CD3CD8CD4CD19+ 195 （蓝色）
T 细胞(TC)： CD3+CD16+56弱+CD8+CD19 113 （黄色）
NK 细胞(NKC)： CD3CD16+56+CD8弱+CD19 165 （绿色） 191
2外周血 T 细胞检测






图 496 T 淋巴细胞发育分化程中膜表面抗原表达



T 淋巴细胞发育分化程细胞膜表面抗原表达（期细胞表面标志序：高低）：


Ⅰ期——CD34+CD7+CD10+CD2+CD1a+CD45+CD48+

Ⅱ期——CD48+CD45+CD1a+CD7+CD10+

Ⅲ期——CD48+CD1a+CD45+CD2+CD3+CD10+CD7+

Ⅳ期——CD48+CD3+CD2+CD7+CD45+


192
（1） 荧光标记 3 参数检测外周血 T 细胞亚群



图 497 外周血细胞散射光图 图 498 外周血成熟 T 细胞
FSC：前角散射SSC：侧角散射 门1 例肺腺癌患者 CD3+细胞
6432


图 499 外周血辅助性 T 细胞 (右限) 图 4910 外周血抑制性 T 细胞（右限）

1 例肺腺癌患者外周血 1 例肺腺癌患者外周血
CD3+CD4+（Th）细胞 3357 CD3+CD8+（Ts）细胞 5431

193
（2） 荧光标记双参数检测外周血 T 亚群细胞







外周血成熟 T 细胞
右限：CD3+CD19细胞 8065



图 4911 荧光标记双参数检测外周血成熟 T 细胞（CD3+CD19）







外周血 T 辅助细胞（Th）
右限：CD3+CD4+细胞 4565




图 4912 荧光标记双参数检测外周血细胞 T 辅助细胞







外周血 T 抑制细胞（Ts）
右限：CD3+CD8+细胞 1900




图 4913 荧光标记双参数检测外周血 T 抑制细胞 194
（3） 荧光标记单参数检外周血 T 细胞亚群



外周血细胞散射光图 外周血成熟 T 细胞
横座标：SSC座标：FSC CD3+细胞 8136




外周血辅助性 T 细胞(Th) 外周血抑制性 T 细胞(Ts)
CD4+细胞 4556 CD8+细胞 3696

图 4914 荧光标记单参数检测外周血 CD3+CD4+ CD8+细胞

1 例正常外周血 T 细胞亚群荧光标记单参数分析 195
（4） 外周血 T 细胞亚群检测分析

① CD4+CD29+细胞





1 例硬膜恶性淋巴瘤患者外周血
CD4+CD29+细胞 312（右
限）










1 例 NHL 患者外周血
CD4+CD29+细胞 1372 （右
限）











1 例肺癌患者外周血 CD4+CD29+
细胞 2318（右限）





图 4915 种肿瘤患者外周血 T 辅助细胞诱导亚群（CD4+CD29+）表达
(FL1：CD29PEFL2：CD4FITC) 196

② D4+CD45RA+细胞






1 例右肺鳞癌患者外周血
CD4+CD45RA +细胞 032










1 例肺癌化疗放疗患者外周血
CD4+CD45RA +细胞 1842










1 例右腮腺恶性淋巴瘤放疗化疗
外周血 CD4+CDA45R +细胞
2439






图 4916 肿瘤患者外周血 T 抑制细胞诱导亚群（CD4+CD45RA+）表达
（FL1：CD4TITCFL2：CD45RAPE）
197
③ CD8+CD28+细胞


CD8CD28+细胞 CD8+CD28+细胞
（ (细胞毒 T 细胞）





CD8CD28细胞 CD8+CD28细胞
（抑制性 T 细胞）


图 4917 CD8FITCCD28PE 单抗双荧光标记染色表达方法

染色方法：CD8+CD28+——细胞毒 T 细胞
CD8+CD28——抑制性 T 细胞



















图 4918 外周血细胞毒 T 细胞（TCLCD8+CD28+）检测
（FL1——CD8FITCFL2——CD28PE）

1 例正常外周血 CD8+CD28+细胞 954CD8+CD28 21 68
198











样品 1例 NHL Ⅲa 期患者外周血
CD8+CD28+细胞 072 CD8+C28+细胞 1015











1 例右肺癌手术患者外周血 1例乳腺癌患者外周血
CD8+C28+细胞 2145 CD8+C28+细胞 625


1 例胃腺癌术化转移患者外周血 恶性淋巴瘤患者外周血
CD8+C28+细胞 1498 CD8+C28+细胞 2265

图 4919 种肿瘤患者外周血细胞毒Ｔ细胞(CTLCD8+CD28+)表达率

199
④ 外周血 T 活性细胞检测














图 4920 T 细胞活化子时效关系




活性 T 细胞
（CD3HLADR+） （CD3+HLADR+）











静止 T 细胞
（CD3HLADR） （CD3+HLADR）


图 4921 外周血 T 活性静止细胞检测
（FL1：CD3FITCFL2：HLADRPE）

1 例正常外周血细胞 CD3HLADR）检测 200







1 例 NHL Ⅲb 期患者外周血 T 活性
细胞 032










1 例右肺癌患者外周血 T 活性细
胞 641












NHL 患者外周血干细胞移植采集
外周血 T 活性细胞 2321






图 4922 肿瘤患者外周血活性 T 细胞（CD3+HLADR+）表达 201



图 4923 浓度 PMA T 细胞激活（CD69+细胞）

















图 4924 剌激剂作 4 时 CD3+细胞细胞表面 CD69 表达
（空心细胞峰剌激 CD69+表达峰——CD69+细胞百分GM——CD69+细胞
绝数）

剌激剂：图 A：PMAION 图 D：PMAION
图 B：PMAION+BFA 图 E：PMAION+BFA
图 C：PMAION+MN 图 F：PMAION+MN 202










CD45RACD45RO+细胞 664 CD45RACD45RO+细胞 685
CD45RA+CD45RO细胞（幼稚 T 细胞） CD45RA+CD45RO细胞（幼稚 T 细胞）
303 133
图 4925 CD4+淋巴细胞 CD45ROCD45RA 表达

MS 移植 1 月 MS移植 5 月
CD45ROCD45RA+细胞 302 CD45ROCD45RA+细胞 395
CD45RACD45RO+细胞 401 CD45RACD45RO+细胞 555

图 4926 造血干细胞移植患者外周血 CD45ROCD45RA 检测分析











正常 CD154+细胞 027 SLE患者 CD154+细胞 228

图 4927 正常红斑狼疮（SLE）患者外周血活化 CD4 细胞（CD154+）检测 203
2外周血 B 淋巴细胞（CD19+CD20+）检测




图 4928 正常 B 细胞分化成熟程中种抗原表达示意图


B 细胞发育成熟程细胞表面标志：

（期细胞表面标志表达序：高低）


Ⅰ期——CD34+CD45+CD19+CD23+TDT+

Ⅱ期——CD10+CD45+CD19+CD20+CD22+

Ⅲ期——CD20+CD45+FMC7+CD19+CD22+CD10

Ⅳ期——CD20+CD45+FMC7+CD19+CD23+


204












1 例肝癌肺骨脑处转移患者外周血 CD19+细胞 021（左：散点图右：直方图）













1 例胰头癌肺转移患者介入化疗外周血 CD19+细胞 1143（左：散点图右：直方图）













1 例胃癌患者手术外周血 D19+细胞 586（左：散点图右：直方图）

205

1 例淋巴瘤合白血病患者化疗外周血 D19+细胞 5426（左：散点图右：直方图）

图 4929 外周血 B 细胞（CD19+）表达水表达方式较
（FL1：CD19FITC）

外周血 B 细胞（CD20+）型标（左：散点图右：直方图）

1 例 B 系恶性淋巴瘤颈淋巴结侵犯患者外周血 B 细胞（CD20+）表达率 3997
（左：散点图右：直方图）

图 4930 外周血 B 细胞（CD20）检测表达方式
（FL1：CD20PE）

206
（2）活性 B 细胞检测







1 例乳腺癌手术转移化疗外周
血 CD5+CD19+细胞 042













1 例正常外周血 CD5+CD19+细
胞 743








1 例急性淋巴细胞白血病患者三年
复发时外周血 CD5+CD19+细胞
5221






图 4931 肿瘤患者外周血活性 B 细胞（CD5+CD19+细胞）表达
（FL1：CD19FITCFL2：CD5PE） 207













正常 SLE患者


图 4932 正常 SLE 患者外周血 CD40+细胞表达
（CD40 抗原分布正常种发育阶段 B 细胞肿瘤化 B 细胞表面）
















B 细胞功细胞——浆细胞（CD19+CD38+） 活性 B 淋巴细胞（CD20+CD5+）
（右限：浆细胞 180） （右限：活性 B 细胞 6950）


图 4933 外周血浆细胞活化 B 淋巴细胞检测

208
3 外周血 NK 细胞检测







1 例乳腺癌患者外周血
CD3CD（16+56）+细胞
1443



图 4934 荧光标记双参数检测外周血 NK 细胞（左限）








1 例胃癌患者手术外周血
CD（16+56）+细胞 3042












1 例肺癌患者化疗外周血
细胞 CD（16+56）+细胞
5246


图 4935 采外周血 CD(16+56)+细胞检测 NK 细胞表达水
（FL2：CD（16+56）PE） 209







1 例食癌患者外周血
CD56+细胞 21 43





图 4936 采外周血 CD56+细胞检测 NK 细胞表达水
（FL2：CD56PE）










1 例乳腺癌淋巴结转移患者
外周血 CD16+细胞 184




图 4937 采外周血 CD16+细胞检测 NK 细胞表达水
（FL1——CD16FITC）







210
4某血细胞细胞表面标志表达



外周血细胞散射光图 型散点图





CD3+细胞直方图 外周血 CD3+CD8+细胞散点图


图 4938 免疫检测散射光图型CD3+细胞直方图 CD3+CD8+细胞散点图
211

图 4939 外周血成熟 T 细胞（CD3+）表达方式

1 例右肺癌手术患者外周血 CD3+细胞 7068（左：散点图右：直方图）



图 4940 外周血 Ts(CD8+)细胞表达方式
（FL2——CD8PE）
1 例 NHL Ⅲa 期患者外周血 CD8+细胞 1845（左：散点图右：直方图）


图 4941 外周血 Ts 细胞（CD28+）表达方式
（FL2——CD28PE）
1 例右肺癌手术外周血 CD28+细胞 3473（左：散点图右：直方图） 212






1 例恶性淋巴瘤患者外周血
CD29+细胞 2169






图 4942 肿瘤患者外周血 CD29+细胞标测（FL2——CD29PE）







1 例胃癌手术化疗转移
患者外周血 CD28+ 细胞
5667



图 4943 肿瘤患者外周血 CD28+细胞检测（FL2——CD28PE）










1 例食癌患者外周血 CD15+
细胞 6852


图 4944 肿瘤患者外周血粒细胞（CD15+）检测（FL1——CD15FITC） 213







1 例右肺癌患者外周血 CD45RA+细
胞 3865



图 4945 患者外周血 CD45DR+细胞检测（FL2——CD45RAPE）









1 例卵癌患者外周血 CD14+细胞
476


图 4946 患者外周血单核细胞（CD14+）检测（FL1——CD14FITC）








1 例肺癌患者肿瘤组织 CD14+细胞
248




图 4947 患者肿瘤组织巨噬细胞（CD14+）检测（FL1——CD14FITC）
214








1 例宫颈癌患者外周血
CD35 细胞 656





图 4948 患者外周血 CD35+细胞检测（FL1——CD28FITC）









1 例乳腺癌患者外周血
CD45+细胞 8082






图 4949 患者外周血 CD45+细胞（全部白细胞）检测（FL1——CD45FITC）








215

图 4950 患者外周血 CD45+细胞（全部白细胞）活化 T 细胞（CD69）细
胞 子检测

216
（十） 造血干细胞表达






图 4101 CD34 抗原血细胞发生程式中表达


217
1 荧光标记单参数检测造血干细胞——CD34FITC










外周血造血干细胞检测散射光图
(设门取淋巴细胞单核细胞进行分析)

图 4102 1例 NHL 患者 PBSCT 动员外周血造血干细胞（CD34+）单参数检测
(FL1：CD34FITC)
CD34+细胞 464（左：散点图右：直方图见两阴性细胞峰淋巴细
胞单核细胞峰）

1 例肺癌化疗患者外周血 1 例乳腺癌患者骨髓组织 CD34+细胞
CD34+细胞 068 211

图 4103 患者组织 CD34+细胞表达 (FL1 CD34FITC) 218


1 例细胞肺癌患者 PBSCT 动员外周血 CD34+细胞 548
（左：散点图右：直方图）


1 例细胞肺癌患者 PBSCT 动员外周血
CD34+细胞 269
（左：散点图右：直方图）


1 例 NHL 患者 PBSCT 动员外周血 CD34+细胞 663）
（左：散点图右：直方图）

图 4104 肿瘤患者外周血 CD34+细胞表达 (FL1 CD34FITC) 219
（2）荧光标记双参数检测造血干细胞

① CD34FITCCD33PE 双参数检测造血干细胞







单荧光抗体标记造血干
祖细胞（右限CD34+细胞
211）









单色荧光单抗标记造血祖
细胞（右限CD33+细胞
566）










双荧光单抗标记造血干
细胞（右限
CD33CD34+ 细胞
198）



图 4105 1 例非霍奇金淋巴瘤患者骨髓组织造血干细胞双色荧光标记检测
（FL1——CD34FITCFL2——CD33PE） 220







骨髓组织中 CD33+细胞
右限造血祖细胞 2257











骨髓组织中 CD34+细胞
右限造血干祖细胞 421












骨髓组织中 CD33CD34+细胞
右限造血干细胞 149






图 4106 1 例细胞肺癌患者骨髓组织造血干细胞双荧光标记检测 221







外周血 CD33+细胞表达
右限造血祖细胞 544











外周血 CD34+细胞表达
右限造血干祖细胞 142













外周血 CD33CD34+细胞表达
右限造血干细胞 131





图 4107 1 例非霍奇金淋巴瘤患者外周血干细胞双荧光标记检测 222





外周血 CD33+细胞
右限造血祖细胞 267











外周血 CD34+细胞
右限造血干祖细胞 062












外周血 CD33CD34+细胞
右限造血干细胞 041






图 4108 1 例肺癌（实体瘤）患者外周血干细胞双荧光标记检测

223
② CD45FITCCD34PE 双参数检测














外周血细胞散射光图 CD45+细胞图

横座标：FSCH 横座标：CD45FITC
座标：SSCH 座标：SSCH














CD34+细胞图 CD34+CD45+细胞图

横座标：SSCH 横座标：CD34PE
座标：CD34PE 座标：CD45FITC


图 4109 外周血干细胞（CD45+CD34+）表达
(Flow cytometry analysis of Diaclone CD34 Control Cells CD45FITCCD34PE dual staini ng)

淋巴细胞
单核细胞
粒细胞 224


R1：外周血中 CD45+细胞 R2： CD45+细胞中 CD34+细胞


R3：血细胞中 CD34+细胞 R4：造血干细胞


图 41010 外周血中造血干细胞 CD45+CD34+细胞检测法





225


R1：外周血中 CD45+细胞 R2：血细胞中 CD34+细胞



R3：CD45+细胞中 CD34+细胞 R4：造血干细胞


图 41011 外周血中造血干细胞 CD45+CD34+细胞检测法








226
（3）荧光标记三参数检测造血干细胞——ProCOUNTTm 法



























图 41012 外周血 CD34+细胞 ProCOUNTTM 检测——样品

CD34+细胞绝数：317μl
外周血细胞 ProCOUNT 系统试剂软件检测 CD34 细胞含量
图中：红色群体参数设门精确设定 CD34 阳性细胞群体
绿色群体进行定量计数标准微球 227




图 41013 外周血 CD34+细胞 ProCOUNTTM 检测——实验样品
CD34+细胞绝数：64846μl

外周血细胞 ProCOUNT 系统试剂软件检测 CD34 细胞含量
图中：红色群体参数设门精确设定 CD34 阳性细胞群体
绿色群体进行定量计数标准微球 228



门R2：成熟 T淋巴细胞（CD3+）


门R3：B 淋巴细胞（CD19+）



门R4：单核细胞（CD14+） 229




门R2 门R3：造血干细胞（CD34+）

门R2 门R3：型


图 41014 磁珠分离 CD34+细胞前骨髓组织种细胞成分变化

（左图：分离前样品右图：分离样品）










230
（十） 白血病细胞免疫分型

1白血病患者骨髓组织细胞变化程



















图 4111 正常骨髓组织细胞表面抗原表达特征




















图 4112 白血病初诊患者骨髓组织细胞表面抗原表达特征 231




图 4113 白血病缓解期患者骨髓组织细胞表面抗原表达特征


R1 核细胞
R2 CD34+细胞
R3 CD34CD19+细胞
R4 CD10+CD38+细胞
R5 CD38+CD10+细胞
R6 CD38+CD10+细胞
R7 CD38CD10+细胞
R8 CD38+CD10细胞
R9 CD38+CD10细胞




232
2B 细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特征




































图 4114 1 例 B 细胞性急性淋巴细胞患者白血病细胞免疫表型分析

（R1 中细胞占 8773表 达 CD19CD10CD13CD20 表 达 CD7CD15HLADR）

R1
R2 233





























图 4115 1例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分
析

（R2 中细胞占 9210表达 CD10CD19CD20CD22CD34HLADR）





234






























图 4116 1 例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 CD19CD10CD22CD20HLADRCD34）










235































图 4117 1 例急性 B 细胞性淋巴细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 4290表达 CD10CD22CD19CD34HLADRCD13CD33） 236



















急性 B 淋巴细胞性白血病（门白血病细胞）

















图 4118 1 例急性 B 淋巴细胞性白血病患者白血病细胞抗原κλ链检测

（κλ链单独表达阳性示细胞克隆性增生结果）
237
3T 细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特征





































图 4119 1例急性 T 淋巴细胞型白血病患者病细胞免疫表型分析

（R1 中细胞占 7287表达 CD5CD34CD10CD7CD13）
R1 R2
R4 238
















239




































图 41110 1 例 T 细胞型急性淋巴白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 854表达 CD5CD7CD19CD71 胞浆 CD3）





240



































图 41111 1 例 T 细胞型急性淋巴白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 8725表达 CD3CD5CD7CD71HLADR CD13）

241
5急性髓系白血病 M1 型白血病细胞免疫表型特征：



































图 41112 1 例急性粒细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 7069表达 CD34CD13表达 CD10CD19CD7CD15
CD14CD33）
R2
R3
R4 242


































图 41113 1 例急性粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 912 表达 CD13CD34CD33HLADRCD7CD71）






243
5急性髓系白血病 M2 型白血病细胞免疫表型特征



































图 41114 1 例原始细胞伴成熟型细胞白血病细胞免疫分型分析

（R3 中细胞占 8955表达 CD19CD13CD34HLADRCD33表达
CD5CD7CD20）



R2
R3 244






































图 41115 1 例急性单核细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 792 表达 CD13CD33CD34HLADR） 245































图 41116 1 例急性粒细胞白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 831表达 CD13CD33CD71） 246






图 41117 1 例急性粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 702 表达 CD13CD34CD33HLADR） 247
6急性髓系白血病 M3 型白血病细胞细胞表型特征






































图 41118 1 例早幼粒细胞 M3 患者白血病细胞免疫表型分析

（R3 中细胞占 9576CD13+CD33+CD15表达 HLADRCD34CD14
CD10CD19CD7CD5）

R2
R3 248
































图 41119 1 例急性早幼粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 903 表达 CD13CD33CD71表达 HLADRCD19）
249

































图 41120 1 例急性早幼粒细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 740 表达 CD13CD33CD71表达 HLADRCD19） 250
7急性粒细胞白血病—M4M5 型免疫表达特征



































图 41121 1 例急性粒细胞白血病 M45 型患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 912表达 CD34CD15CD13HLADRCD7表达
CD5CD14CD33CD19CD10）




R2
R3
R4 251

































图 41122 1 例急性单核细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 868 表达 CD13CD33CD34CD14CD71HLADR） 252








































图 41123 1 例急性粒单核细胞性白血病患者细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 876表达 HLADRCD13CD33CD14CD71） 253
8急性粒细胞白血病—M6 型免疫表达特征
































图 41124 1 例红白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 630表 达 CD33CD71 表 达 CD5CD7CD10CD19CD13
HLADRCD20CD22） 254


























图 41125 1 例急性红白血病患者白血病细胞免疫表型分析
（R2 中细胞占 562 表达 CD19CD34CD71CD117HLADR）

255
9混合型白血病免疫表型特征：































图 41126 1 例急性混合细胞性白血病患者白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 896 表达 CD13CD19CD14CD33CD34HLADR）








256



























图 41127 1 例 T 细胞混合型淋巴细胞性白血病患者白血病细胞免
疫表型分析

（R2 中细胞占 854 表达 CD5CD7CD13CD34CD34CD19）






257
































图 41128 1 例急性 TB 细胞混合型淋巴细胞白血病患者
白血病细胞免疫表型分析

（R2 中细胞占 958 表达 CD5CD7CD13CD19CD34CD71）







258
10骨髓异常增生综合症免疫表型分析：






























图 41129 1 例骨髓异常增生综合症（MDS）患者细胞免疫表型分析

（R2 中细胞表达 CD80CD25CD56CD8）


259
11白血病患者骨髓脑脊液微残留病检测





骨髓： CD45+细胞中 脑脊液： CD45+细胞中
CD10+CD19+细胞 8590 CD10+CD19+细胞 1370


图 41130 1 例 B 淋巴细胞患者治疗缓解骨髓组织脑积液白血病细
胞检测












260



图 41131 M2 患者脑积液中检测出量 CD34+细胞 CD13+细胞
















261




正常外周血细胞（阳性峰位 102） CML患者外周血细胞（阳性峰位 103）

图 41132 白血病患者外周血细胞磷酸酪氨酸激酶变化





取 CD45+细胞 细胞胞浆 CD3+CD22细胞


图 41133 1 例 T 细胞白血病患者外周血细胞胞浆 CD3+表达

——1 例白血病患者出现 CD5+CD7+CD34+ CD19+时鉴 T 细胞性 B 细胞
性白血病胞浆 CD3+CD22者 T 细胞性白血病

262
（十二） 细胞子检测

1 白细胞介素2 受体（IL2RCD25）











点
h
1例肠癌患者外周血 CD25+细胞 1745(左：点阵图：右：直方图)












1 例低分化胃癌患者外周血 CD25+细胞 1848（左：点阵图 右：直方图）




1
例
肝

肾

骨等发转移癌患者外周血细胞样CD25+细胞 2143

图 4121 外周血白细胞介素2 受体（IL2R）表达（CD25+）细胞 (FL1：CD25FITC)
263
2 干扰素γ（IFNγ）







1 例肝细胞癌骨肺脑转移患者
外周血细胞 IFNγ+细胞表达率
067










1 例肺腺癌患者化学治疗
外周血细胞 IFNγ+细胞
表达率 2858









1 例非霍奇金淋巴瘤患者手术化疗
外周血细胞 IFNγ+细胞表达
率 7239






图 4122 肿瘤患者外周血细胞干扰素γ（IFNγ）表达 (FL1：IFNγFITC) 264
3 肿瘤坏死子α（TNFα）







1 例胃癌患者外周血 TNFα+细胞
表达率 874










1 例恶性淋巴瘤患者化疗外周血
TNFα+细胞表达率 7784










1 例非霍奇金淋巴瘤患者化疗外
周血 TNF α+细胞表达率
9347







图 4123 外周血中肿瘤坏死子α（TNFα）水表达 (FL2：TNFαPE)
265
4细胞细胞子检测












正常 CD8+细胞中 IFN+细胞 675 白血病患者 MS 移植前 4379












MS 移植 1 月 IFNγ+细胞 192 MS 移植 6 月 IFNγ细胞 1440
图 4124 骨髓移植前患者外周血 CD8+细胞 IFNγ表达











图 4125 热休克蛋白中暑患者血细胞中表达

（红点：热应激组蓝点：37℃培养组绿点：基础组） 266

图图 44112266 特特异异性性抗抗原原（（巨巨细细胞胞病病毒毒））活活化化 TT 淋淋巴巴细细胞胞（（CCDD6699））实实验验
（CD69 细胞 CD45RA 细胞中 IL2TNFα IFNγ表达） 267

















图图 44112277 PPMMAAIIOONN 刺刺激激 44 时时 TT 细细胞胞活活化化子子————CCDD6699 细细胞胞细细胞胞表表面面表表达达
（（左左图图：：细细胞胞细细胞胞活活化化子子表表达达右右图图：：细细胞胞表表面面细细胞胞活活化化子子表表达达））

灰灰色色细细胞胞峰峰————细细胞胞
空空心心细细胞胞峰峰————加加剌剌激激剂剂细细胞胞

剌剌激激剂剂分分布布：：AA 图图：：PPMMAAIIOONN DD 图图：：PPMMAAIIOONN
BB 图图：：PPMMAAIIOONN++BBFFAA EE 图图：：PPMMAAIIOONN++BBFFAA
CC 图图：：PPMMAAIIOONN++MMNN F图：PPMMAAIIOONN++MMNN

















268
6 CBA 方法检测溶性血清蛋白分子（Cytometric Bead Array CBA）


图 4148 流式细胞术检测溶性分子（CBA 法）基原理





图 4129 CBA 实验流式细胞术检测示意图









IL2 IL4 IL8 TNFα IL10 IFNγ

图 41210 种血清溶性分子捕获示意图
（采夹心法分析策略微球捕获溶性分子）



269








γ




样品 实验样品




样品 实验样品



图 41211 白细胞介素（IL）等血清中表达实例










IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ 270





图 41212 流式细胞术检测血清细胞子 CBA 检测

（药物浓度作血清某溶液性细胞子变化）











IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ

IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ
IL2
IL4
IL8
T NFα
IL10
IFNγ

IL2
IL4
IL8
TNFα
IL10
IFNγ 271
























图 41213 CBA 床应示意图


















•（十三） 网织红细胞检测
• 免疫分析


• 酶分析



• 受体配基分析



• 蛋白质 蛋白质相互作分
析
• 蛋白质 核酸相互作分析



• 核酸杂交分析 272

















图 4131 流式细胞术 TO 染色成熟网织红细胞检测

IRF 数分析：排核细胞排血板定义 IRF 区域定义网织红细胞


图 4132 剌激红细胞生成素作外周血成熟网织红细胞（IRF）血红蛋白网织
红细胞计数变化——IRF 升高早

10 1 10 2 10 3 10 4
Thiazole Orange >
10
1
10
2
10
3
10
4
FSCHeight >
红细胞
血板
核细胞
IRF 网织红细胞 273
















剌激前（网织红细胞 015） 剌激 6时(网织红细胞 027)

















剌激 24 时(网织红细胞 123) 剌激 72 时(网织红细胞 267)


图 4133 EPO 剌激网织红细胞成熟——体剌激红细胞生成
（横座标：噻唑橙 座标：生物素水）




10 1 10 2 10 3 10 4
THIAZOLE ORANGE >
10
1
10
2
10
3
10
4
BIOTIN LEVEL >
10 1 10 2 10 3 10 4
THIAZOLE ORANGE >
10
1
10
2
10
3
10
4
BIOTIN LEVEL >
10 1 10 2 10 3 10 4
THIAZOLE ORANGE >
10
1
10
2
10
3
10
4
BIOTIN LEVEL >
10 1 10 2 10 3 10 4
THIAZOLE ORANGE >
10
1
10
2
10
3
10
4
BIOTIN LEVEL > 274


图 4134













Erythroid
Maturation
0
02
04
06
08
1
12
Erythroblast Normoblast
early
Normoblast
late
Reticulocyte
IRF
Reticulocyte
late
Erythrocyte
Nucleated
Glycophorin
CD71 (TfR)
RNA
Hemoglobin 275

（十四） 血板检测

+








图 4141 血板功活化示意图









276
277
1血板抗体检测

血板样品样品（左：散点图右：直方图）


血板抗体阴性患者（左：散点图右：直方图）


血板抗体阳性患者（左：散点图右：直方图）

图 4142 血板抗体检测 278

2 血板表面糖蛋白（CD41）检测











1 例正常外周血血板 CD41+细胞 653
（左：散射光图——设门右：荧光图 ）











1 例 T 细胞性白血病患者外周血血板 CD41+细胞 978
（左：散射光图——设门右：荧光图 ）




血







1 例肠息肉患者手术患者外周血血板 CD41+细胞 1271
（左：散射光图——设门右：荧光图 ）

图 4143 外周血血板表面糖蛋白（CD41）表达 (FL1：CD41FITC) 279


1 例原发性血板减少性紫癜患者 1 例生障碍性贫血患者
外周血血板 CD41+细胞 63 0胞 外周血血板 CD41+细胞 474

1 例细胞性肺癌免疫治疗患者 1 例急性髓细胞性白血病化疗
外周血血板 CD41+细胞 3575 患者外周血血板 CD41+细胞 5714

1 例肝硬化腹水手术免疫治疗患者 1 例乳腺癌术化疗免疫治疗患者
外周血血板 CD41+细胞 7523 外周血血板 CD41+细胞 7761

图 4144 种患者外周血血板——CD41+细胞表达 280
3 网织血板表达识统计分析












设阈值：散射光图 逻辑设门： 计算网织血板占全部
设门取血板 血板百分率 267
（横座标——侧角散射
座标——网织血板）


图 4145 网织血板识统计分析方法





样品 RNA 酶处理前：门 样品 RNA 酶处理：门
网织血板 732 网织血板 041

图 4146 1 例患者外周血细胞 RNA 酶处理前网织血板测定结果
（横座标——侧角散射座标——网织血板）
281


散点图 R3门 直方图 M1
网织血板 1564 网织血板 1394
图 4147 份标散点图直方图分析方法较
（横座标——侧角散射座标——网织血板）










正常（197） 障患者（047） ITP 患者（1212）








外周血干细胞动员 剂量化疗明显减低
网织血板显著增加(1053) （015）
图 4148 干扰素患者网织血板表达影响
（横座标——侧角散射座标——网织血板） 282












肝
移植前 肝移植

图 4149 肝脏移植前患者外周血血板变化
（横座标——侧角散射座标——网织血板）



















图 41410 单核细胞血板粘连表达

（1 例心肌梗塞患者单核细胞血板粘连现象）


283












移植前（041） 第 4 天(027)










第
第 9 天(240) 第 14 天(529)









第19天



第 16 天(671) 第 19 天(805)


图 41411 异体骨髓移植前时间外周血网织血板变化
（横座标——侧角散射座标——网织血板）
284
4 活化血板检测
型(0)













活化血板（CD62P+CD63+）低表达（524）

活化血板（CD62P+CD63+）高表达（7545）

图 41412 外周血血板活化（CD62P+CD63+）检测 285

散射光图设门取细胞













门 CD61+细胞


右限 PAC+细胞


图 41413 血板活化早期标志物（PAC）检测

（左：型：右实验样品） 286


散射光图设门取细胞


门 CD61+细胞


右限 PAC+细胞

图 41414 外周血血板活化 PAC1（ⅡbⅢa）检测分析
（左：型：右实验样品） 287



样品（左：设门’取分析细胞右：CD62p+CD63+细胞 052）



实验样品（左：设门’取分析细胞右：CD62p+CD63+x 细胞 5672）


图 41415 外周血血板活化 CD62pCD63+细胞检测







288
（十五） HLAB27表达检测
















散射光图 淋巴细胞中取 CD3+细胞
（取淋巴细胞——绿色部分） （FL2绿色部分）


CD3+细胞中 HLAB27+细胞分布直方图 (FL1 HLA B27FITC)

左：正常样品 HLAB27+细胞 124
右：受检患者样品 HLAB27+细胞 9454



图 4151 强直性脊柱炎患者外周血细胞 HLAB27 表达
289











散射光图（左：型样品右：受检患者外周血细胞）
(取红色细胞部分淋巴细胞)











淋巴细胞中取 CD3+（红色部分）细胞进行分析（左：型右：受检患者）


HLAB27+细胞直方图（图中绿竖线分界线）

（左：型样品阳性细胞表达率 054右：受检患者阳性细胞 8735）

图 4152 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞 HLAB27 检测方法 290


正常样品

（左：散射光图设门’取淋巴细胞右：散点图HLAB27+HLAB7细胞 045）




受检患者样品

（左：散射光图设门取淋巴细胞右：散点图右限 HLAB27+HLAB7细胞 9245）


图 4153 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞 HLAB27 表达检测
291




HLAB27 检测型
（左：散点图HLAB27+HLA陈细胞 245右：直方图HLAB27+细胞 486）




HLAB27 表达阳性患者
(左：散点图HLAB27+HLAB7细胞 100右：直方图HLAB27+ 细胞 100)


图 4154 1 例强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞中 HLAB27+细胞表达方式

292
十六常见癌基编码蛋白检测


Rb
p53(V)
p16
基编码 DCC
蛋白表达 MCC
APC
细胞核 Ras
细胞浆 Bcl2
CerbB2
myc
bl

CD44V5
CD44V6
基编码蛋白表达细胞表面 nm23
p170
FasApo1
CD44S

图 4161 癌基编码蛋白表达检测指标示意图














图 4162 癌基蛋白表达检测原理

细胞膜 细胞浆细胞核中种基编码蛋白通荧光标记单克隆抗体特异
性结合产生抗原抗体复合物流式细胞术检测细胞荧光强度荧光标记阳性细胞百
分率获该基表达蛋白绝计数相计数
293
1 抑癌基编码蛋白表达检测


1 例乳腺癌肿瘤细胞 1例胃癌癌旁组织
（384 ） （2345）

1 例卵巢癌腹水细胞 1例乳腺癌淋巴结转移灶
（2785） （4987）

1 例乳腺癌骨髓细胞 1例肠癌外周血细胞
（7034） （9648）

图 4163 视网膜母细胞瘤基（RB）编码蛋白肿瘤组织中表达
(FL1：RbFITC) 294







癌组织 Rb+细胞
467











淋巴结转移灶 Rb+细胞
7124










外周血 Rb+细胞
9865






图 4164 RB 基编码蛋白 1 例肠癌患者组织中表达
(FL1：RbFITC)

295










1 例直肠状腺癌瘤组织 1例肠癌肿瘤组织
（033） （1354）


1 例胃癌肿瘤组织 1例肺癌肿瘤组织
（4439） （3019）


1 例胃癌肿瘤组织 1例食癌肿瘤组织
（8843） （7271）


图 4165 DCC 基编码蛋白肿瘤组织中表达
(FL1：DCCFITC)
296








1 例输尿癌术复发患者瘤组织
p53(V)+细胞表达率 1887










1 例乳腺癌患者瘤组织 p53（V）+
细胞表达率 2743











1 例肺癌患者瘤组织 p53(V)+细胞
表达率 4668





图 4166 p53（V）基编码蛋白癌组织细胞中表达
（FL1：p53VFITC） 297











1 例右乳腺癌患者肿瘤组织 p53（V）+细胞 034











点
1例卵巢癌患者肿瘤组织 p53（V）+细胞 5135











点

1 例肺癌手术前放疗化疗患者肿瘤组织 p53（V）+细胞 9987

图 4167 p53（V）基编码蛋白癌组织细胞中表达
（左：散点图右：直方图） 298







外周血细胞 p53(V)+细胞表达率
32









淋巴结转移灶细胞 p53(V)+细胞表达率
7191












肿瘤组织 p53(V)+细胞表达率
8845






图 4168 1 例结肠癌患者组织中 p53（V）基编码蛋白表达分布
（FL1：p53（V）FITC）

299




外周血细胞 淋巴结转移灶
p16+细胞表达率 7246 p16+细胞表达率 2487



癌旁正常组织 原发灶肿瘤组织
p16+细胞表达率 6647 p16+细胞表达率 598


图 4169 1 例直肠癌患者组织 p16 基编码蛋白表达
（FL1：p16FITC） 300


1例肺癌器官转移患者肿瘤组织 1例胃癌肝转移患者肿瘤组织
（373） （124）



P








1 例肺癌骨转移患者肿瘤组织 1例胃癌淋巴结转移患者肿瘤组织
（2646） （5976）











1例乳腺癌患者癌旁组织 1例胃癌Ⅰ期患者肿瘤组织
（9351） （8875）

图 41610 p16 基编码蛋白肿瘤组织细胞中表达
（FL1：p16FITC） 301








1 例肺癌远处广泛转移患者肿瘤组
织 p16+细胞 344












1 例肺癌肺转移患者瘤组织
p16+细胞 213











1 例肺癌未转移患者瘤组织 p16+
细胞 9013




图 41611 癌组织细胞 P16 基编码蛋白表达肿瘤转移
（FL1：p16FITC） 302

2癌基编码蛋白表达检测









外周血细胞
p21+细胞表达率 076










淋巴结转移灶细胞
p21+细胞表达率 4565










肿瘤组织细胞
p21+细胞表达率 9812





图 41612 1 例卵巢癌患者组织细胞 p21 基编码蛋白表达较
（FL1：p21FITC） 303

1 例胃癌Ⅱ期患者肿瘤组织 乳腺癌患者肿瘤组织
（138） （476 ）


1 例卵巢癌患者肿瘤组织 1例宫颈癌患者肿瘤组织
（3976） （695）

1 例胰腺癌肝转移患者肿瘤组织 结肠癌肺转移肿瘤组织
（7389） （9442）

图 41613 肿瘤患者癌组织 p21 基编码蛋白表达
（FL1：p21FITC） 304


外周血细胞 癌旁正常组织
CerbB2+细胞表达率 764 CerbB2+细胞表达率 1234



淋巴结转移灶 瘤组织
CerbB2+细胞表达率 6674 CerbB2+细胞表达率 8579

图 41614 1 例卵巢癌患者组织 CerbB2 基编码蛋白表达
（FL1：CerbB2 FITC）


305


1 例食癌患者肿瘤组织 1例乳腺癌术肺转移患者肿瘤组织
（388） （1348）

1 例卵巢癌网膜转移患者 肠癌淋巴结转移患者
肿瘤组织 cerbB2+细胞 3313 肿瘤组织 cerbB2+细胞 5565


1例胃癌 LNM 患者肿瘤组织 1例胰头癌肺转移患者肿瘤组织
（8687） （9633）

图 41615 种癌组织细胞 CerbB2 基编码蛋白表达水
（FL1：CerbB2 FITC） 306








1 例胃癌Ⅱ期患者肿瘤组织 Bcl2+
细胞 365











1 例胃癌附淋巴结转移患者肿瘤
组织 Bcl2+细胞 6364










1 例胃癌肝肺骨广泛转移患者
肿瘤组织 Bcl2+细胞 9668





图 41616 癌组织细胞 Bcl2 基编码蛋白表达肿瘤转移
（FL1： Bcl2 FITC） 307

1 例高分化肺癌组织 1 例高分化结肠癌患者肿瘤组织
（1491） （1811）


1 例中分化肺癌患者肿瘤组织 1例中分化结肠癌患者肿瘤组织
（3155 ） （7349）


1 例低分化肺癌组织 1例低分化结肠癌组织
（7448） （7933）

图 41617 肿瘤组织细胞 BCL2 基编码蛋白表达病理分级
（FL1： Bcl2 FITC） 308
3调整基编码蛋白检测












1 例胃癌转移患者肿瘤组织 1例肝细胞癌转移患者肿瘤组织
（124 ） （1154 ）










1
1例结肠癌患者肿瘤组织 1例胃癌患者肿瘤组织
（2013） （5063）











1 例卵巢癌患者肿瘤组织布 1例食癌患者肿瘤组织
（83 38） （89 46）

图 41618 癌组织细胞 CD44S 基编码蛋白表达 309



外









图 41619 1 例肺癌患者 CD44S 基组织中表达
（左：外周血9854 右：肿瘤组织4258）










点


1 例直肠癌患者肿瘤组织 CD44S+细胞 7191

图 41620 CD44S 基编码蛋白组织中表达分析方法
（左：散点图右：直方图）






310

1 例胃癌患者外周血 1例肠癌患者肿瘤组织
（380） （276）


1 例乳腺癌淋巴结转移患者骨髓组织 1例卵巢癌Ⅲ期化疗患者瘤组织
（2066） （4924）


1例子宫膜癌ⅡⅢ期患者肿瘤组织 1 例卵巢癌手术化疗复发患者肿瘤组织
（6687） （9864）

图 41621 CD44V5 基编码蛋白种癌组织细胞中表达
（FL1：CD44V5 FITC） 311











1 例升结肠癌患者外周血 1例子宫膜癌患者外周血
（346） （386）











1 例胃癌患者外周血 1例乳腺癌转移子宫膜癌肿瘤组织
（287） （3647）











1 例子宫膜癌ⅡⅢ级患者瘤组织 1例直肠癌腹腔转移患者肿瘤组织
（4886） （4976）

图 41622 CD44V6 基编码蛋白种肿瘤组织中表达
（FL1： CD44V6 FITC） 312








1 例胃癌患者肿瘤组织 CD44V6+
细胞 1452











1 例胃癌淋巴结转移患者肿瘤组织
CD44V6+细胞 2851











1 例胃癌远处广泛转移患者癌组织
CD44V6+细胞 9428





图 41623 胃癌患者肿瘤组织 CD44V6 基编码蛋白表达肿瘤转移
（FL1： CD44V6 FITC） 313







1 例结肠癌患者肿瘤组织
nm23+细胞 1674









1 例直肠癌患者肿瘤组织
nm23+细胞 4568










1例升结回肓部肠癌患者
肿瘤组织 nm23+细胞 8365








图 41624 nm23 基编码蛋白种癌组织细胞中表达
（FL1： nm23 FITC）
314
4药耐药基编码蛋白（p170）表达



外周血样 p170+细胞率 1532均荧光强度 90











肿瘤组织样 p170+细胞 9778 均荧光强度 576

图 41625 1 例卵巢癌患者 p170 蛋白外周血肿瘤组织细胞中表达
（左：散点图右：直方图 FL2：p170PE） 315



1 例细胞肺癌肿瘤组织 p170+细胞表达率 059 均荧光强度 32



1 例原发性肝癌肿瘤组织 p170+细胞表达率 805均荧光强度 60







P



1 例非霍杰金淋巴瘤肿瘤组织 p170+细胞表达率 4954均荧光强度 323





316


1 例胰腺癌肿瘤组织 p170+细胞表达率 9959均荧光强度 379












1 例直肠癌肿瘤组织 p170+细胞表达率 3126均荧光强度 562

图 41626 种肿瘤组织药耐药基（p170）表达
（左：散点图右：直方图 FL2：p170PE） 317


化疗前 p170 表达率 1744均荧光强度 418


化疗 1 月 p170 表达率 503均荧光强度 670


图 41627 1 例胃癌患者化疗前肿瘤活检组织 p170 蛋白表达变化
（左：散点图右：直方图 FL2：p170PE）


318

化疗前 p170 表达率 053均荧光强度 109



化疗 1 月 p170 表达率 1000均荧光强度 711


图 41628 1 例非霍奇金淋瘤患者化疗前骨髓细胞 p170 蛋白表达
（左：散点图右：直方图 FL2：p170PE） 319












化疗前 p170 基外周血细胞中低水表达（998）











化疗 3 月 p170 基外周血细胞中高水表达(9711)













化疗 9 月 p170 基外周血细胞中较高水表达（4325）

图 41629 肿癌患者外周血细胞 p170 基骗蛋白表达化疗时间关系
（左：散点图右：直方图 FL2：p170PE）
320
5Fas 基蛋白检测











1 例升结肠癌肿瘤组织样 CD95 低水表达（057）


1 例乳腺癌肿瘤组织样 CD95 中水表达（4715）


1 例胃癌患者瘤组织样 CD95 高水表达（6897）



图 41630 癌组织细胞中 CD95 表达水分析方法
(左：散点图右：直方图FL2：CD95FITC)

321












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）

图 12 精子发生示意图 322












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100） 323












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）











正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）












正常生育男性精液细胞 DNA 直方图 正常生育男性精液细胞 DNA 直方图
（单倍体细胞 100） （单倍体细胞 100）


324


（十八） 发荧光药物进入细胞浓度检测



样品（0h） 实验样品(加药 12h)
阳性细胞 13 45

阿霉素发荧光外周血细胞中表达
1 例白血病患者药（阿霉素） 12h 外周血细胞中药物浓度检测














样品(0h) 实验样品(加药 24h)
阳性细胞 4929

表阿霉素发荧光外周血细胞中表达
1 例乳腺癌患者药（表阿霉素） 24h 外周血细胞中药物浓度检测



图 4181 发荧光药物体组织细胞中表达 325
(十九)


正常 M1 045 Ph染色体（）者 M1 005





出现少部分 Ph 染色体患者 出现量 Ph 染色体者
M1 1576 M1 8954


图 4191 急性淋巴细胞白血病（ALL）Ph 染色体频率患者外周血细胞 KORSA3544
抗原表达
——诊断 Ph 阳性 ALL 检测 Ph 型 ALL 缓解期微残留灶


326


患者红细胞 CD59+细胞表达明显降低 患者红细胞 CD55+细胞显著降低





患者白细胞 CD59+细胞显著增加 患者白细胞 CD55+细胞显著增加




图 4192 1 例阵发性血红蛋白尿(PNH)患者红白细胞 CD55 CD59 表达 (直方图)

发作性夜间血红蛋白尿症（PNH）时糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合蛋白 GPI 结合
蛋白发生障碍红细胞 CD55（DAF） CD59 减少缺确定 PNH 诊断

327


型 正常




轻度阵发性血红蛋白尿患者 重度阵发性血红蛋白尿患者


图 4193 阵发性血红蛋白尿(PNH)患者病情外周血 CD55+CD59+细胞表达(点阵图)


328

正常外周血细胞 MS患者外周血细胞

图 4191 发性硬化病（MS）患者外周血 T 细胞 CD8+细胞中 IFNγ表达

——外周血细胞散射光图设门取淋巴细胞分析 CD3+细胞分析 CD3+CD8+
细胞 IFNγ双参数表达分析























329

























120











1 例肺癌淋巴结转移复发患者肺癌组织穿剌细胞中 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括： DI 130 非整倍体 DI 163 非整倍体 G01 期细胞峰伴 1
细胞凋亡峰）












1 例输尿癌术 10 年转移患者肺癌穿剌组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括：DI 111 非整倍体 G01 期独立细胞峰 DI 129 非整倍体 G01 期
细胞肩峰）











1 例胃癌患者胃粘膜活检组织 DNA 异倍体细胞直方图
（M包括 1 DI 值 178 非整倍体 G01 期细胞峰 DI 值 268 高 DI 值非整倍体
G01 期细胞峰伴细胞凋亡）
图 4523 活检组织 DNA 异倍体细胞直方图

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