BSA 性状定位项目分析报告


    BSA 性状定位项目分析报告
    项目编号:IBFC201874701
    撰写员:潘瑞青
    提交日期:20181107
    北京贝瑞康生物技术限公司
    生物信息分析部北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    目录
    1 建库测序流程2
    11 样检测2
    12 文库构建检测3
    13 文库质检机测序3
    2 信息分析流程3
    3 分析结果展示4
    31 数产出质控4
    311 原始数说明4
    312 数质量说明5
    313 数质控5
    32 参考基组分析6
    33 测序覆盖度分布7
    34 SNPInDel 检测注释8
    341 SNP 检测注释结果9
    342 InDel 检测注释结果 10
    35 子代 SNP11
    351 子代 SNP 频率计算 11
    352 子代 SNP 频率分布13
    353 子代 SNP 频率差异14
    36 子代 InDel 频率分析 15
    361 子代 InDel 频率计算 15
    362 子代 InDel 频率分布 16
    363 子代 InDel 频率差异 17
    37 合子代 SNP InDel 频率差异分析18
    371 合子代 SNPInDel 频率18
    372 合分布19
    373 合差异21
    374 基 SNPInDel 标记目标性状区域定位22
    38 基 SNPInDel 标记目标性状区域定位23
    4软件数库23
    5参考文献23北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    2
    1 建库测序流程
    样品检测建库测序环节会数质量数量产生影响数质量会直
    接影响续信息分析结果获高质量数保证生物信息分析正确全面信
    前提保证测序数准确性性样品检测建库测序生产步
    骤严格控根确保高质量数产出
    提取样品通严格质检合格样品 DNA 片段机断构建文库添
    加接头(adaptor)PCR 扩增然利 illumina 测序仪进行测序实验流程图:
    图 1 实验流程图
    11 样检测
    BSA 性状定位测序样 DNA检测方法包括三种:
    (1)Nanodrop 检测 DNA 浓度纯度(OD260280 值)
    (2)琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 降解程度否 RNA蛋白质污染
    (3)Qubit DNA 浓度进行精确定量北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    3
    12 文库构建检测
    基组 DNA Covaris 破碎仪机断成长度 350bp 片段 末端修复加
    A 尾片段两端分连接接头制备 DNA 文库 PCR 线性扩增文库质检检测
    合格文库进行机测序
    13 文库质检机测序
    文库构建完成先 Qubit20 进行初步定量 Agilent2100 文库
    insertsize 进行检测insertsize 符合预期 qPCR 方法文库效浓度进行准确 定
    量保证文库质量
    库检合格进行 Illumina HiSeq2500XTen NovaSeq 台 PE150 测序
    2 信息分析流程
    (1)原始机数做质控分析 Clean data
    (2) Clean Data 参考基组进行
    (3)做 SNPInDel 检测注释
    (4)计算 SNPindex
    (5)判断候选区域筛选基北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    4
    图 2 信息分析流程图
    3 分析结果展示
    31 数产出质控
    311 原始数说明
    高通量测序原始图数文件 CASAVA 碱基识(Base Calling)分析转化原
    始测序序列(Sequenced Reads)称 Raw Data Raw Reads结果 FASTQ (简称
    fq)文件格式存储中包含测序序列(reads)序列信息应测序质量信息
    FASTQ 格式文件中 read 四行描述:
    @HWIST127671C1162ACXX1110112082458 1N0CGATGT
    NAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGA
    +
    #55BBBBBBA@DEEFFCFFHHFFCFFHHHHHHHFAE0ECFFDAEHH
    中第行@开头 Illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)描述文
    字(选择性部分)北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    5
    第二行碱基序列
    第三行+开头 Illumina 测序标识符(选择性部分)
    第四行应碱基测序质量该行中字符应 ASCII 值减 33应
    第二行碱基测序质量值
    312 数质量说明
    测序质量测序程 BaseCalling 程中识碱基出错误概率衡
    碱基测序正确性
    测序质量 字符应 ASCII 值–33 碱基质量值范围:(0~40)
    测序错误率 测序质量值
    5 13
    1 20
    01 30
    001 40
    具体计算公式:
    般说 Q20 达 90指:质量值等 20 碱基数占例 90
    313 数质控
    测序 raw reads效里面含 adapter reads重复low quality
    reads reads 会影响续分析必须机 reads 进行滤干净
    效 reads
    数滤步骤:
    1 含 adaptor reads
    2 N 例 10 reads
    3 低质量 reads(质量值 Q < 3 碱基数占整 read 50%)
    4 获 Clean reads
    表 313 机数质控北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    6
    #Sample NAME NO CleanReads CleanBases CleanQ20 CleanQ30 CleanGC Length
    F4851 306306 34615103 10384530900 98379781 94799326 36363639 150150
    ganchiS 307307 69586695 20876008500 98179677 94299100 36433650 150150
    kangchiR 308308 82263579 24679073700 98249748 94569261 36143616 150150
    F5034 355355 52149052 15644715600 98019677 93939110 37303740 150150
    数质量情况详细容:
    (1) Sample Name 样名
    (2) NO 文库 ID
    (3) CleanReads(pair):滤效数量滤测序 Pairend 序列数
    (4) Clean Base(bp):滤效数量滤测序序列数测序序列长度 bp
    单位
    (5) CleanQ20CleanQ30:Phred 数值 2030 碱基占总体碱基百分
    (6) Cleam GC Content():碱基 G C 数量总占总碱基数量百分
    (7) Reads Length:测序序列长度
    数路径:1fqQC\QC_readsxls
    32 参考基组分析
    效数量数情况分析准确性影响突变检测分析前需
    进行数产出量统计结果统计数进行适筛选利续分析结
    果性
    clean reads 采 BWA 软件 clean reads 参考基组做初始结
    果 sam 格式利 samtools 软件结果转 bam 格式排序果样品结果包
    含文库 samtools 文库 bam 结果合 picard 标注重复序列进行数
    基信息统计 map 统计统计结果:
    表 32 统计结果表
    Sample F4851 F5034 ganchiS kangchiR
    Clean reads 69230206 104298104 139173390 164527158
    Clean bases(bp) 10384530900 15644715600 20876008500 24679073700
    Mapped reads 67056124 101627634 135024220 160496472
    Mapped bases(bp) 10058418600 15244145100 20253633000 24074470800
    Mapping rate 9686 9744 9702 9755北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    7
    Duplicate reads 14967642 23570974 33928900 40574259
    Duplicate rate 2232 2319 2513 2528
    Mismatch bases(bp) 147417457 139495392 242061649 279706439
    Mismatch rate 147 092 120 116
    Average sequencing depth 1543 2314 2947 3517
    Coverage 9426 9736 9906 9915
    Coverage at least 4X 8998 9457 9779 9824
    Coverage at least 10X 6764 8735 9310 9506
    Coverage at least 20X 1092 4720 7189 8380
    Coverage at least 50X 158 271 444 662
    注:
    Sample:样品名Clean reads:滤 Clean reads 总数
    Clean bases(bp):滤 Clean base 总数
    Mapped reads:参考基组 reads 总数
    Mapped bases(bp):参考基组 base 总数
    Mapping rate:Map 例Duplicate reads:Duplicate reads 总数
    Duplicate rate:Duplicate 例Mismatch bases(bp):Mismatch base 总数
    Mismatch rate:Mismatch 例Average sequencing depth:均测序深度
    Coverage:覆盖度Coverage at least 4X:深度等 4x 覆盖区域例
    Coverage at least 10X:深度等 10x 覆盖区域例
    Coverage at least 20X:深度等 20x 覆盖区域例
    数路径:2mapQCxls
    33 测序覆盖度分布
    测序覆盖度分布衡量测序均性重指标统计测序覆盖度分布情况
    视化展示出样品 F4851 例图:北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    8
    图 331 测序深度分布图
    数路径:2mapQC\*\*_histPlotpdf
    横坐标表示单碱基测序深度坐标表示特定深度碱基数占单碱基深度符合正态分

    图 332 测序深度累积分布图
    数路径:2mapQC\*\ *_cumuPlotpdf
    横坐标表示单碱基累积测序深度(等)坐标表示特定累积深度碱基占总数
    百分
    34 SNPInDel 检测注释
    SNP(单核苷酸态性) 指基组水单核苷酸变异引起 DNA 序
    列态性包括单碱基转换颠换等北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    9
    基测序产生序列基组参考序列结果采 samtoolsGATK 等软件
    Call snp indelAnnovar 软件 snpindel 位点进行注释确定 variant 位点应基
    信息义非义突变氨基酸影响等信息
    Annovar 注释变异(SNPSmall InDel)预测变异影响优秀软件根变
    异位点参考基组位置参考基组基位置信息变异位点基
    组发生区域(基间区基区 CDS 区等)变异产生影响(义非义突
    变等)
    341 SNP 检测注释结果
    ANNOVAR 种高效软件工具利新信息基组检测出
    基变异进行功注释出变异染色体起始位点终止位点参考核苷酸
    变 异 核 苷 酸 ANNOVAR 进 行 Genebased annotation Regionbased annotations
    Filterbased annotation Other functionalities鉴 ANNOVAR 强注释功国际认
    性利 SNP 检测结果进行注释
    表 341 SNP 检测注释结果统计
    Total snp 5542579
    Het 1801046(3249)
    Homo 3741533(6751)
    synonymous SNV 94495(170)
    nonsynonymous SNV 105153(190)
    exonic 201566(364)
    intergenic 4220696(7615)
    intronic 466914(842)
    UTR3 38867
    UTR5 26325
    UTR5UTR3 3
    downstream 264076
    exonicsplicing 12
    splicing 684
    stopgain 1681
    stoploss 249
    upstream 304118
    upstreamdownstream 19318
    TiTv 17
    注:北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    10
    downstream 基游区域(1K )
    Het:杂合突变
    Homo:纯合突变
    intergenic 基间区
    intronic 基(转录信息)
    intronic 含子区域
    nonsynonymous SNV 非义编码突变
    splicing剪切附突变(exon 前 2bp )
    stopgain 终止密码子获
    stoploss 终止密码子丢失
    ncRNA_* 应 ncRNA
    synonymous SNV 义编码突变
    upstream 基游区域(1K )
    UTR3 基 3’UTR
    UTR5 基 5’UTR
    TiTv:转换颠换率
    数路径:4annotation\BSA_annosnp_statxls
    342 InDel 检测注释结果
    表 342 InDel 检测注释结果统计
    Total indel 756983
    Het 86872(1148)
    Homo 670111(8852)
    exonic 5944(079)
    intergenic 485786(6417)
    intronic 101725(1344)
    UTR3 10045
    UTR5 7679
    UTR5UTR3 2
    downstream 64342
    exonicsplicing 4
    frameshift deletion 1346
    frameshift insertion 1206
    nonframeshift deletion 1626北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    11
    nonframeshift insertion 1636
    splicing 322
    stopgain 107
    stoploss 27
    upstream 75847
    upstreamdownstream 5287
    注:
    frameshift deletion 非 3 整数倍删
    frameshift insertion非 3 整数倍插入
    nonframeshift deletion密码子删(3 整数倍)
    nonframeshift insertion密码子插入(3 整数倍)
    downstream基游区域(1K )
    intergenic 基间区
    intronic 基(转录信息)
    intronic 含子区域
    Splicing剪切附突变(exon 前 2bp )
    ncRNA_* 应 ncRNA
    stopgain 终止密码子获
    stoploss 终止密码子丢失
    synonymous SNV 义编码突变
    upstream 基游区域(1K )
    UTR3 基 3’UTR
    UTR5 基 5’UTR
    数路径:4annotation\BSA_annoindel_statxls
    35 子代 SNP
    351 子代 SNP 频率计算
    减少测序错误错误造成影响滤态性位点滤标准:
    (1)两子代中 SNPindex 02 SNP 深度 7 位点滤掉北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    12
    (2) 子代 SNPindex 缺失位点滤掉
    (3) 子代池中 GQ 20 位点滤掉
    筛选滤 2480692+378511(SNP+INDEL)态性标记位点部
    分位点 SNPindex 信息见表
    表 35 部分位点 SNPindex 信息
    CHROM Chr1 Chr1
    POS 218 237
    REF G T
    ALT C A
    Ref_depth_LOW 15 19
    Alt_depth_LOW 28 28
    Depth_LOW 43 47
    SNPindex_LOW 035 04
    Ref_depth_HIGH 38 38
    Alt_depth_HIGH 24 26
    Depth_HIGH 62 64
    SNPindex_HIGH 061 059
    注:
    CHROM:染色体名
    POS:SNP 位点
    REF:该位点参考基组碱基型
    ALT:该位点突变碱基型
    Ref_depth_*:样品支持参考基组碱基型 reads 数
    Alt_depth_*:样品支持突变碱基型 reads 数
    SNPindex_*:样品该 SNP 位点 SNP 频率
    Depth_*:样品该 SNP 位点 reads 支持数
    数路径:5region_selected\*\*\raw_variantsxls北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    13
    352 子代 SNP 频率分布
    根 SNP 频率分布分析结果 SNPindex 染色体分布进行作图选择 200kb
    窗口计算窗口中 SNPindex 均值反应子代 SNPindex 分布
    抗虫子代池 SNPindex 染色体分布曼哈顿分布图:

    3521a
    :子代
    SNP index
    染色体分布
    数路径:5region_selectedSNPHIGHpng

    3522a
    :子代
    SNP index
    染色体分布
    横轴:染色体名称长度(Mb)轴:SNPindex
    数路径:5region_selectedSNPHIGH_chrspng
    感虫子代 SNPindex 染色体分布曼哈顿分布图:北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    14

    3521a
    :子代
    SNP index
    染色体分布
    数路径:5region_selectedSNPLOWpng

    3522b
    :子代
    SNP index
    染色体分布
    横轴:染色体名称长度(Mb)轴:SNPindex
    数路径:5region_selectedSNPLOW_chrspng
    353 子代 SNP 频率差异
    子代 SNPindex 作差:△(SNPindex) SNPindex(极端性状 B)SNPindex(极端性状
    A)选 90(a白色b黑色)置信水作筛选阈值
    根分布结果绘制染色体分布情况:北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    15
    图 3533a: 子代

    (SNPindex)染色体分布
    数路径:5region_selectedSNPINDEXpng
    图 3533b: 子代

    (SNPindex)染色体分布
    横轴:染色体名称长度(Mb)轴:

    (SNPindex)
    数路径:5region_selectedSNPINDEX_chrspng
    36 子代 InDel 频率分析
    361 子代 InDel 频率计算
    基基分型结果筛选亲间纯合差异 InDel 位点选择亲 AA(极端性状 A)
    作参考分析计算子代亲中标记位点 Indelindex
    表 6:部分 InDel index 信息
    CHROM Chr1 Chr1 Chr1
    POS 31071 31478 33667
    REF AC CGGG A北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    16
    ALT G T GTT
    GenotypeP1 AC C A
    DPP1 10 5 16
    AD_REFLOW 34 34 20
    AD_ALTLOW 36 52 48
    DPLOW 70 86 68
    SNPindexLOW 0514285714 0604651163 0705882353
    数路径:5region_selected INDELraw_variantsxls
    362 子代 InDel 频率分布
    根抗虫子代 InDel 频率分析结果绘制染色体分布图:
    图 3621a:子代 InDelindex 染色体分布
    数路径:5region_selectedINDELHIGHpng
    图 3621b:子代 InDelindex 染色体分布
    横轴:染色体染色体长度(Mb)轴:InDelindex北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    17
    数路径:5region_selectedINDELHIGH_chrpng
    根感虫子代 InDel 频率分析结果绘制染色体分布图:
    图 3622a:子代 InDelindex 染色体分布
    数路径:5region_selectedINDELLOWpng
    图 3622b:子代 InDelindex 染色体分布
    横轴:染色体染色体长度(Mb)轴:InDelindex
    数路径:5region_selectedINDELLOW_chrpng
    363 子代 InDel 频率差异
    两子代 InDelindex 作差:

    (InDelindex) InDelindex(极端性状 B)InDelindex(极端
    性状 A)选取 90(a白色b黑色)置信水作筛选阈值北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    18
    图 3631a:子代

    (InDelindex)染色体分布
    数路径:5region_selectedINDELINDEX_chrpng
    图 3631b:子代

    (InDelindex)染色体分布
    横轴:染色体染色体长度(Mb)轴:

    (InDelindex)
    数路径:5region_selectedINDELINDEX_chrpng
    37 合子代 SNP InDel 频率差异分析
    371 合子代 SNPInDel 频率
    全部位点合分析部分位点 Allindex 信息
    表 7:部分 Allindex
    chr pos ref alt Genoty
    peP1
    DP
    P1
    AD_R
    EFLO
    W
    AD_A
    LTLO
    W
    DPLO
    W
    SNPindex
    LOW
    AD_RE
    FHIGH
    AD_AL
    THIGH
    DPHIG
    H
    SNPindex
    HIGH
    deltaSNP
    Chr1 31071 AC G AC 10 34 36 70
    051428571
    4
    26 22 48
    045833333
    3
    0055952
    381北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    19
    Chr1 31478 C T C 5 34 52 86
    060465116
    3
    40 34 74
    045945945
    9
    0145191
    703
    Chr1 33667 A
    GT
    T
    A 16 20 48 68
    070588235
    3
    24 29 53
    054716981
    1
    0158712
    542
    Chr1 34057 C T C 12 38 40 78
    051282051
    3
    29 26 55
    047272727
    3
    0040093
    24
    Chr1 35239 A CA A 15 25 36 61 059016393 40 60 100 06 0009836
    Chr1 38389 T C T 6 36 42 78
    053846153
    8
    42 40 82
    048780487
    8
    0050656
    66
    Chr1 55398 A G A 7 25 46 71
    064788732
    4
    66 62 128 0484375
    0163512
    324
    Chr1 84683 A
    CT
    AT
    G
    A 4 34 35 69
    050724637
    7
    43 46 89
    051685393
    3
    00096075
    56
    Chr1
    15685
    4
    A T A 12 32 29 61
    047540983
    6
    30 24 54
    044444444
    4
    0030965
    392
    数路径:5region_selectedALLraw_variantsxls
    372 合分布
    根合 Allindex 结果绘图展示:
    图 3721a:子代 Allindex 染色体分布
    数路径:5region_selectedALLHIGHpng北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    20
    图 3721b:子代 Allindex 染色体分布
    横轴:染色体长度(Mb)轴:Allindex
    数路径:5region_selectedALLHIGH_chrpng
    根合 Allindex 结果绘图展示:
    图 3722a:子代 Allindex 染色体分布
    数路径:5region_selectedALLLOWpng北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    21
    图 3722b:子代 Allindex 染色体分布
    横轴:染色体长度(Mb)轴:Allindex
    数路径:5region_selectedALLLOW_chrpng
    373 合差异
    两子代 Allindex 作差:

    (Allindex) Allindex(极端性状 B)Allindex(极端性状
    A)选取 90(a白色b黑色)置信水作筛选阈值
    图 3731a:子代

    (Allindex)染色体分布
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    图 3731b:子代

    (Allindex)染色体分布
    横轴:染色体长度(Mb)轴:

    (Allindex)
    数路径:5region_selectedALLINDEX_chrpng
    374 基 SNPInDel 标记目标性状区域定位
    选择 90置信水阈值窗口作候选区间
    CHROM qtl start end length nSNPs avgSNPs_Mb peakDeltaSNP avgDeltaSNP
    Chr01 1 50625118 51245143 620025 4990 8048 0418211896 0412552076
    Chr02 1 2122130 4986753 2864623 20838 7274 0543291181 0503151847
    Chr02 2 5721178 5876332 155154 131 844 0431353321 0424253527
    Chr02 3 6918622 7387350 468728 1987 4239 0509581505 0484844221
    Chr02 4 7719290 8099163 379873 1990 5239 0514000543 048379809
    注:
    CHROM:染色体名
    qtl 该 QTL 区间某染色体排序
    Start 该 QTL 染色体起始位置
    end 该 QTL 染色体结束位置
    length 该 QTL 染色体长度
    nSNPs 该 QTL 染色体高质量 SNPINDEL 数量
    avgSNPs_Mb 该 QTL 染色体高质量 SNPINDEL 数量 Mb
    peakED 该 QTL 高质量 SNPINDEL 应 ED 峰值
    avgED 该 QTL 高质量 SNPINDEL 应 ED 均值北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    23
    数路径:5region_selected\All\region_selectedxls
    38 基 SNPInDel 标记目标性状区域定位
    选择 90置信水阈值窗口作候选区间全基组范围挑选候选 SNP
    InDel挑选子代池中 ganchiS Allindex 接 02kangchiR 接 095 位点候选
    位点提取 ANNOVAR 注释结果优先挑选引起 stop loss 者 stop gain 者非义突变
    变剪接位点基作候选基候选基列表请见:
    表 8:部分候选基统计
    Trans_ID Varients_
    Type
    CHRO
    M
    POS Ref Alt Gene Annotat
    ion
    Phvul001G253900 upstream Chr01 51100464 T C Phvul001G253900 NA
    Phvul001G253900 upstream Chr01 51100521 A G Phvul001G253900 NA
    Phvul001G253900 upstream Chr01 51100526 T C Phvul001G253900 NA
    数路径:6gene_selected\candidate_genexls
    4软件数库
     Annovar
     BWA (BurrowsWheeler Aligner) 075ar405
     picardtools 157
     samtools (Sequence AlignmentMap Tools) 0119
     GATK 38
    5参考文献
    1McKenna A Hanna M Banks E et al The Genome Analysis Toolkit a MapReduce
    framework for analyzing nextgeneration DNA sequencing data[J] Genome research 2010 20(9)
    12971303
    2 Li H et al The Sequence AlignmentMap format and SAMtools Bioinformatics 2009
    25(16) p 20789北京贝瑞康生物技术限公司 wwwberrygenomicscom 01084409702
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    24
    3Takagi H Abe A Yoshida K et al QTL‐seq rapid mapping of quantitative trait loci in rice
    by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations[J] The Plant Journal 2013
    74(1) 174183
    4Cingolani P Platts A Wang le L et al A program for annotating and predicting the effects
    of single nucleotide polymorphisms SnpEff SNPs in the genome of Drosophila melanogaster
    strain w1118 iso2 iso3 Fly (Austin) 2012 AprJun6(2)8092
    5Wang K Li M Hakonarson H ANNOVAR functional annotation of genetic variants from
    highthroughput sequencing data Nucleic acids research 2010 38(16)e164
    6 Cunpeng Z Guiyuan Z Zhao Get alPhysical mapping and candidate gene prediction of
    fertility restorer gene of cytoplasmic male sterility in cotton BMC Genomics 2018 19(1)6

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