09食安班
组成员：X
红霉素发酵工艺研究进展
红霉素简介发酵发展现状
红霉素属环酯类抗生素水溶液呈强碱性0 0 66红霉素溶液pH80～10 5 85 浓度乳糖酸盐pH达60～75具广谱抗菌作抗菌谱青霉素类似革兰氏阳性菌尤敏感葡萄球菌化脓性链球菌绿色链球菌肺炎链球菌白喉杆菌等较强抑制作床扁桃体炎猩红热白喉淋病皮肤组织感染等军团肺炎支原体肺炎作首选药物呼吸道感染特耐青霉素适红霉素收入中国药典外收入美国日等药典年竞争激烈抗生素市场红霉素衍生物产量断增长销售节节升市拓展广阔空间
红霉素早1952年JMMcguire等菲律宾群岛土样中分离红霉素发酵制美国礼莱公司Abbott公司先生产产品推市场年红霉素生产稳定增长20世纪80年代全世界产量已达800吨占全球抗生素产量3220世纪90年代国际市场红霉素畅销促进生产产量较副增长1995年产量达1500吨1996年达3200吨目前6000吨左右成世界抗生素市场头孢类青霉素类外第三抗生素药物
国红霉素发酵水属低水重复操作发达国家相差距较目前国外发酵单位已达8 000～12 000 g／ml国企业红霉素发酵水直4 000～5 000g／ml 国外企业技术封锁国红霉素生产发酵水直较落红霉素发酵水受工作菌种培养基组成发酵条件控制期分离提纯条件等方面素影响国科技工作者红霉素发酵相关参数调控手希提高红霉素发酵水目前响应面法正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响
二红霉素发酵工艺
①菌种活化
菌种：红色链霉菌红色链霉菌菌丝体红色链霉菌孢子
菌种活化：先级种子罐然二级种子罐保藏菌种孢子进行活化
②种子制备
种子扩培养指保存砂土冷冻干燥中处休眠状态生产菌种接入试斜面活化摇瓶种子罐逐级扩培养获定数量质量纯种程
③发酵
接种方法：火圈接种法压力差法该厂现火圈接种法次接种3－4瓶（250ml烧瓶）
发酵周期：级1－2天二级种子2天三级发酵2－3天周期6－7天
发酵温度：32－33℃
发酵终点：PH升高粘度增加效价提高
④红霉素发酵液提取精制
硫氰酸钠萃取法
发酵液放罐碱化絮凝处理板框滤滤液复合溶媒萃取溶媒相加入硫氰酸钠冰醋酸硫氰酸红霉素结晶出晶体洗涤烘干硫氰酸红霉素工艺应时间较久工艺稳定
超滤法
首先发酵液放罐碱调节pH8加入003甲醛溶液进行超滤滤连续离子交换树脂脱色进步纯化纳滤膜进行浓缩浓缩液效价达20000uml进工艺处理浓缩液加入定量碱NaSCN红霉素碱者硫氰酸红霉素结晶晶体滤丙酮溶解溶物丙酮液中加入水红霉素结晶出晶体烘干成品丙酮溶液三达EA技术回收丙酮剩余母液返回浓缩工序利返回离交工序
⑤废水处理
早期采混合稀释生化处理处理方法现采预处理—厌氧—氧处理方法
三 工艺存问题解决方法
（1） 培养基优化
培养基作微生物养料直接源影响微生物生命生理代谢活动素时做实验获某种单菌落培养基求较简单需够满足相应菌生长代谢需求发酵培养基求条件较实现产业化生产考虑原料制宜价格低廉资源丰富便采购运输适合规模贮藏保证生产供应考虑发酵副产物少选培养基应满足整体工艺求影响通气提取纯化废物处理等等获高产量红霉素找适合菌种生长培养基包括培养基成分组分含量配等确定培养基进行优化
目前响应面法 正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响笔者拟采响应面法正交试验法红色糖孢菌产红霉素发酵培养基进行优化期获交互影响显著素佳配提高红霉素发酵水具体优化探索：
材料方法
1．1 菌种红色糖孢菌UL5四川理工学院微生物实验室保藏
1．2 培养基培养条件
1．2．1 改进高氏培养基溶性淀粉2％ NaC1 0．05％ 硝酸钾0．1％ 磷酸二氢钾0．05％ 硫酸镁0．05％ 硫酸亚铁0．001％ 重铬酸钾7o80 rn1青霉素2．5～3．0 ml琼脂1．5％ ～2．5％ pH 7．4～7．6(NaOH调)33℃培养7 d
1．2．2 改进斜面培养基溶性淀粉l％ 硫酸铵0．3％ 玉米浆1．2％ NaC1 0．3％ 碳酸钙0．3％ 琼脂1．5％ 2．5％ 重铬酸钾70～8O ml青霉素2．5～3．0 Ixg／mlpH 7．5(NaOH调)33℃培养7 d
1．2．3 种子培养基淀粉3．0％ 黄豆饼粉2．5％ 蛋白胨0．5％ 糊精3．O％ 葡萄糖1．0％ NaC10．4％ 硫酸铵0．75％ 碳酸钙0．6％ 硫酸镁0．025％ 磷酸二氢钾0．02％ pH 7．5(NaOH调)121℃灭菌25 min挖取新鲜活化菌种板(1am×2 Cll1)接装50 rn1种子培养基250 ml摇瓶中培养温度33℃ 220 r／min置摇床培养2 d
1．2．4 初始发酵培养基黄豆饼粉3．0％ 淀粉4．O％ 糊精3．0％ 硫酸铵0．2％ 碳酸钙0．6％ 葡萄糖1．0％ 磷酸二氢钾0．04％ pH 6．8121℃灭菌25 rain接种量5％(二级种子)250 ml摇瓶装液量50 ml220 r／min培养2 d300 r／rain培养3 d150 r／rain培养2 d31 培养2 d33℃培养3d29℃培养2 d
1．3 红霉素生物效价测定采碟法
1．4 培养基优化方法
1．4．1 响应面试验前期完成单素试验研究结果采响应面法 培养基组成成分进行优化
1．4．2 验证试验响应面试验优化结果确定佳值预计结果进行验证进行性分析优结果
1．4．3 正交试验根响应面试验单素试验结果硫酸铵碳酸钙玉米浆磷酸二氢钾4种成分进行正交试验
实验具体程数（略）通实验出优化结果：终佳培养基配方黄豆饼粉2．89％ 淀粉3．025％ 糊精2．04％ 葡萄糖1．97％ 碳酸钙0．7％ 硫酸铵0．1％ 玉米浆1．2％ 磷酸二氢钾0．04％ 优化UL5菌株发酵液均生物效价达5 848 mlUL5菌株原始培养基效价4 772 ml相提高22．55％
（2 ）发酵程中参数控性模糊控制应
发酵抗生素生产程关键环节传统发酵工业操作方式开环具验操作者通验知识生产程信息时调整补加营养物料基质策略微生物生长代谢着理想轨迹进行发酵程环境参数PH发酵温度溶解氧浓度D0控制微生物生长程高度非线性时变性关键变量菌丝浓度总糖浓度线测量发酵程控制问题变复杂
采计算机控制技术抗生素发酵程进行实时动控制理优化操作解决述存问题减轻操作员劳动强度提高动化水稳定生产提高发酵系数降低原耗耗
传统控制方法执行控制时需取象数学模型红霉素发酵程参数确定性程非线性变量间耦合性信息完全性程关键参数测量时滞性法取精确数学模型生产实践中发现验操作员然懂控象数学模型十分效系统执行控制操作员系统控制建立直观验实际中取验采取相应决策完成控制工作验系列含语言变量值条件语句规模糊集合理十分恰表达具模糊性语言变量条件语句验模糊条件语句表示然模糊集合理语言变量进行量化模糊推理系统实时输入状态进行处理产生相应控制决策模糊控制器工作程见模糊控制器实质反映输入语言变量输出语言变量语言控制规模糊定量关系算法结构功实现先计算机观测控制程精确量转化模糊输入信息总结控制验策略取语言控制规进行模糊推理模糊决策求输出控制量模糊集模糊判决出输出控制精确量作控象模糊控制器结构通常输入输出变量模糊化模糊推理算法模糊合成模糊判决等部分组成
培养基优化
培养基作微生物养料直接源影响微生物生命生理代谢活动素时做实验获某种单菌落培养基求较简单需够满足相应菌生长代谢需求发酵培养基求条件较实现产业化生产考虑原料制宜价格低廉资源丰富便采购运输适合规模贮藏保证生产供应考虑发酵副产物少选培养基应满足整体工艺求影响通气提取纯化废物处理等等获高产量红霉素找适合菌种生长培养基包括培养基成分组分含量配等确定培养基进行优化
目前响应面法 正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响笔者拟采响应面法正交试验法红色糖孢菌产红霉素发酵培养基进行优化期获交互影响显著素佳配提高红霉素发酵水具体优化探索：
（3）通摇瓶发酵试验验证红霉素发酵工艺影响
红霉素产生取决菌丝生长活力营养期应控制菌丝具较高呼吸活力磷酸酶F蛋白酶F淀粉酶等活力合成期提高红霉素产量须菌体控制适生长点红霉素发酵工艺中究竟通温度PH值摇床转速控制方式补料工艺前体添加等条件产生影响？通红霉素摇瓶发酵实验验证影响确定否助工业发酵摇瓶发酵实验般分3级发酵l级种子培养2级种子培养发酵．完整周期12 d1级种子培养2级种子培养进行较考虑蒸发原结果二者差缩短发酵时间减少染菌率般省2级种子培养直接采1级种子进行发酵培养完整周期约10d
31温度PH值红霉素发酵水影响
摇瓶发酵实验般整发酵周期选取合适培养温度PH值根验关文献报道发酵期温度控制(29±0．5)CpH值控制7．0～7．2间采正交设计进行考察摇瓶发酵采2级发酵转速220 r／min全程补料培养
32摇床转速红霉素发酵水影响
菌体生长代谢阶段需氧量 设计4组调节摇床转速方案实验结果采取第2级方案发酵水高效价达318 2单位实验提高8．3
33 补料配方红霉素发酵水影响
摇瓶发酵实验中通改变补料培养基配方考察红霉素发酵水影响补料分补糖补葡萄糖补混合料包括黄豆饼粉玉米浆硫酸铵酵母粉等着重考察中5素：葡萄糖黄豆饼粉硫酸铵酵母粉玉米浆素取5水采均匀设计Ⅲ提高实验精度采拟水法素虚拟10水．利U (10) 表安排实验实验结果利逐步回法n]求回方程 Y17．1 9x +84．44x 359．57x3+2 219．25式中： 红霉素效价 葡萄糖浓度 黄豆饼粉浓度z 硫酸铵浓度验证选取优化配方 i l ( 表示葡萄糖浓度第5水余类)酵母粉玉米浆原配方浓度结果3 305单位预测值 3 360单位较相符认r 薅r 台适 实验结果原配方进行菌体浓度40升41 ．化学效价提高约3．8
34前体添加红霉素发酵水影响
红霉素生物台成影响机酸醇类中发现丙醇明显作摇瓶发酵中+考察6种添加水丙醇红霉素发酵影响实验结果显示前体添加取第4水时应红霉素效价4 220单位加前体时3 31 6单位提高27．3
总结：(1)通摇瓶正交实验+出红霉素优化发酵温度pH值发酵前期：7135℃pH6．8发酵中期 71—31 CpH6．8时优化摇床转速控制方式前体添加水 (2)优化朴料配方效价提高约3 时效债基质浓度回方程 Y17．1gxI+84 44 2—359．5 7x3+2 219．25 (3)优化红霉素发酵水达4 2 20单位原始实验2 854单位提高约47．3
（4）红霉素协萃取新工艺研究
红霉素中性络合萃取体系研究基础进步改善红霉素萃取体系物性提高萃取力降低溶剂成进开发新协萃取体系关协萃取金属元素萃取已研究⋯ 谓协萃取效应指二元元萃取体系中萃取组分分配系数显著种萃取剂单独时分配系数称正协萃取效应反称反协萃取效应协萃取体系分配系数种萃取剂单独时分配系数相等时协萃取效应设B萃取剂萃取分配系数D s萃取剂D 定义D加Ds s+DB(1Xs)式中 s表示S组分物质量分数D协协萃分配系数协萃系数RD协／D加显然R>1正协效应R1．1 实验药品试剂
实验中红霉素标准品中国药品生物制品检定制备红霉素发酵滤液取红霉素发酵车间试剂均分析纯水纯化水
1．2 实验方法¨
1．2．1 萃取
取定体积红霉素发酵液滤液(红霉素模拟料液)10％ NaOH溶液调pH值10．6
l0．8定体积萃取溶剂加分液漏斗中常温恒温水浴条件振荡混合3～5 min静置30min分层两相分离分测定效价测定水相中衡pH值
1．2．2 反萃取
根实验求配制pH值乙酸缓液常温恒温水浴条件分液漏斗中两相混合
(振荡3 rain)静置30 min分层分相分测定效价测定水相中衡pH值
1．2．3 成盐
反萃取含高浓度红霉素酸水10％NaOH溶液调pH值6．0鼓泡法残存
机溶剂继续调pH值6．8酸水置34—36℃水浴中缓慢滴加定量硫氰酸钠溶液滴加继续保温搅拌30—60 min利晶体生长滤红霉素硫氰酸盐湿晶体纯化水洗涤3次次洗水量约等晶体量然真空干燥(4O℃)晶体12 h取样测定效价含水量等项指标
1．2．4 转碱
取定量红霉素硫氰酸盐溶4．0～4．5倍量(体积／质量)丙酮中搅拌条件滴加10％
20％NaOH溶液溶液澄清分出少量水相分两次加进2—6倍丙酮体积纯化水静置夜滤红霉素碱湿晶体先纯化水搅洗顶洗晶体干燥红霉素碱成品取样测定效价指标
1．3 分析方法
根红霉素硫酸作显棕黄色波长485 nm处吸收特性采化学法处理进
行分光光度测定仪器721型分光光度计红霉素硫氰酸盐红霉素碱成品均生物测定法测定效价
1．4 协萃取体系研究
采红霉素配制料液实际发酵滤液进行协萃体系实验测定研究二元协萃体
系中B组分种低水溶性脂肪醇类萃取剂s组分种极性协萃溶剂具稀释剂作实验条件：水相料液中红霉素浓度1 380 u／mL水相中衡pH值10．6—1 0．8萃取相(0：A)1：8萃取温度l9℃ 两相混合时间3 min选择三种溶剂作协萃溶剂分表示ss：s改变Bs配测定红霉素萃取分配系数D采实际料液实验条件：水相料液中红霉素浓度4 667 u／mL(B+s1萃取)4 312 u／mL
(B+s 萃取)水相中衡pH值10．6～10．8萃取相(0：A)1：6萃取温度28℃ 两相混合时间3 min实验结果见：①B+S B+s B+s 三萃取体系均峰值曲线萃取分配系数远脂肪醇煤油萃取体系(萃取分配系数43．15⋯)均明显正协萃效应②B+s B+S 协萃体系实际料液萃取曲线高模拟料液萃取曲线现象萃取温度致(升温利萃取)时实际发酵料液中含定量盐助提高红霉素萃取分配系数表1中B+S 萃取体系实验数计算：R>1说明该体系明显协萃效应实验条件：水相料液中红霉素浓度1 650u／mL水相中衡pH值10．6—10．8萃取相(0：A)1：8萃取温度17℃ 两相混合时间3 min取协萃体系中应R分配醋酸丁酯进行发现见协萃体系萃取力远醋酸丁酯萃取力
2 新萃取体系发酵料液实验结果研究协萃体系中综合较(包括萃取性体系物性毒性济性等)选定B+S协萃体系进行进步研究采实际发酵滤液进行萃取分机相反萃水相成盐进行较研究见新协萃体系萃取( 时损耗量水相成盐时损耗量低机相萃取反萃)程中损耗量远低醋酸丁酯萃取成盐时损耗量反萃取定收率水相成盐产品回收率会低机相成盐时产品回收率终红霉素碱产品中否萃取溶剂残留残留量少疑关注问题采协萃体系进行红霉素萃取成盐(溶剂相中成红霉素硫氰酸盐)转碱全流程试验红霉素碱产品进行溶剂残留量测定测定方法采气相色谱法心]测定结果表明溶剂残留量红霉素硫氰酸盐洗涤条件密切相关研究采效洗涤方法终成品中溶剂残留降低100 mg／L
3 结
文研究开发具正协萃取效应新萃取体系醋酸丁酯较新体系萃取程中损耗
少萃取收率高价格幅度降具明显技术济优越性新萃取体系机相成盐反萃水相成盐两工艺流程水相成盐具更低溶剂损耗量产品总回收率受定影响采实际发酵滤洗液实验表明新萃取体系萃取程中乳化趋势易生复适工业生产新萃取体系
四 红霉素发酵前景展
床应领域扩阿奇霉素罗红霉素克拉霉素等代表新型半合成红霉素出现快速拉动红霉素原料药生产需求西方济学家预测2010年红霉素系列产品全球市场总规模达70亿美元市场前景乐观抗生素发酵生产身高耗产业存环境污染等问题发达国家年正逐步抗生素原料药生产转移中国等发展中国家目前国世界红霉素生产出口第国年产量超7000吨
采微生物发酵获取药抗生素原料途径国作世界原料抗生素生产国发酵单位偏低产品质量偏低缺乏知识产权新型抗生素药物等系列原严重制约产业发展红霉素作种广谱抗生素药物进入床提高产生菌种发酵单位目遗传育种工作直未停止微生物次级代谢产物生物合成机制解常规诱变选育方法存周期长效率低机性缺点年红霉素高产菌株筛选方面收效着分子生物学技术发展国际红霉素产生菌种基工程改造方面进行诸尝试然研究集中红霉素产生相关底物供应限制素改进方面未红霉素生物合成次生代谢途径做特异性遗传修饰解决红霉素生产中常面效组分偏低等问题时缺乏效针性
基红霉素组分结构差异相互转化化学质运组合生物合成技术方法原理红霉素工业高产菌株进行针性遗传改良通发酵程中修饰酶表达例调整效副产物组分BC完全转化效组分红霉素A提高产品质量（基消副产物）时效提高产品产量达25左右
机知识创新程中面国家需求立足原始创新方面做件重意义研究工作充分体现学科交叉优势红霉素工业生产菌种遗传改造取系列创新技术生产中成功实施预示着样理念抗生素发酵生产中着普遍推广意义利促进国传统抗生素生产行业整体技术水提升
参考文献
1红霉素发酵工艺优化工业化生产技术研究 张金国 中国科技成果2007 年第13 期
2红霉素发酵程控制技术 动化技术应2009年第28卷第7期 施敏敏
3红霉素发酵培养基优化研究 安徽农业科学 2011 左勇
4红霉素协萃取新工艺研究 河南化工 2009第二期 李武德李洲宋喜芳
5红霉素摇瓶发酵实验工艺条件 西北学学报(然科学版) 范代娣
6红霉素产生菌Serythearafl基改造进展 中国抗生素杂志2010年8月第35卷第8期 窦海青
7 Combined UF–NF membrane system for filtering erythromycin fermentation broth and concentrating the filtrate to improve the downstream efficiency
Separation and Purification Technology
Volume 66 Issue 2 20 April 2009 Pages 390–396
Yasan He
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红霉素发酵工艺研究进展
红霉素简介发酵发展现状
红霉素属环酯类抗生素水溶液呈强碱性0 0 66红霉素溶液pH80～10 5 85 浓度乳糖酸盐pH达60～75具广谱抗菌作抗菌谱青霉素类似革兰氏阳性菌尤敏感葡萄球菌化脓性链球菌绿色链球菌肺炎链球菌白喉杆菌等较强抑制作床扁桃体炎猩红热白喉淋病皮肤组织感染等军团肺炎支原体肺炎作首选药物呼吸道感染特耐青霉素适红霉素收入中国药典外收入美国日等药典年竞争激烈抗生素市场红霉素衍生物产量断增长销售节节升市拓展广阔空间
红霉素早1952年JMMcguire等菲律宾群岛土样中分离红霉素发酵制美国礼莱公司Abbott公司先生产产品推市场年红霉素生产稳定增长20世纪80年代全世界产量已达800吨占全球抗生素产量3220世纪90年代国际市场红霉素畅销促进生产产量较副增长1995年产量达1500吨1996年达3200吨目前6000吨左右成世界抗生素市场头孢类青霉素类外第三抗生素药物
国红霉素发酵水属低水重复操作发达国家相差距较目前国外发酵单位已达8 000～12 000 g／ml国企业红霉素发酵水直4 000～5 000g／ml 国外企业技术封锁国红霉素生产发酵水直较落红霉素发酵水受工作菌种培养基组成发酵条件控制期分离提纯条件等方面素影响国科技工作者红霉素发酵相关参数调控手希提高红霉素发酵水目前响应面法正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响
二红霉素发酵工艺
①菌种活化
菌种：红色链霉菌红色链霉菌菌丝体红色链霉菌孢子
菌种活化：先级种子罐然二级种子罐保藏菌种孢子进行活化
②种子制备
种子扩培养指保存砂土冷冻干燥中处休眠状态生产菌种接入试斜面活化摇瓶种子罐逐级扩培养获定数量质量纯种程
③发酵
接种方法：火圈接种法压力差法该厂现火圈接种法次接种3－4瓶（250ml烧瓶）
发酵周期：级1－2天二级种子2天三级发酵2－3天周期6－7天
发酵温度：32－33℃
发酵终点：PH升高粘度增加效价提高
④红霉素发酵液提取精制
硫氰酸钠萃取法
发酵液放罐碱化絮凝处理板框滤滤液复合溶媒萃取溶媒相加入硫氰酸钠冰醋酸硫氰酸红霉素结晶出晶体洗涤烘干硫氰酸红霉素工艺应时间较久工艺稳定
超滤法
首先发酵液放罐碱调节pH8加入003甲醛溶液进行超滤滤连续离子交换树脂脱色进步纯化纳滤膜进行浓缩浓缩液效价达20000uml进工艺处理浓缩液加入定量碱NaSCN红霉素碱者硫氰酸红霉素结晶晶体滤丙酮溶解溶物丙酮液中加入水红霉素结晶出晶体烘干成品丙酮溶液三达EA技术回收丙酮剩余母液返回浓缩工序利返回离交工序
⑤废水处理
早期采混合稀释生化处理处理方法现采预处理—厌氧—氧处理方法
三 工艺存问题解决方法
（1） 培养基优化
培养基作微生物养料直接源影响微生物生命生理代谢活动素时做实验获某种单菌落培养基求较简单需够满足相应菌生长代谢需求发酵培养基求条件较实现产业化生产考虑原料制宜价格低廉资源丰富便采购运输适合规模贮藏保证生产供应考虑发酵副产物少选培养基应满足整体工艺求影响通气提取纯化废物处理等等获高产量红霉素找适合菌种生长培养基包括培养基成分组分含量配等确定培养基进行优化
目前响应面法 正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响笔者拟采响应面法正交试验法红色糖孢菌产红霉素发酵培养基进行优化期获交互影响显著素佳配提高红霉素发酵水具体优化探索：
材料方法
1．1 菌种红色糖孢菌UL5四川理工学院微生物实验室保藏
1．2 培养基培养条件
1．2．1 改进高氏培养基溶性淀粉2％ NaC1 0．05％ 硝酸钾0．1％ 磷酸二氢钾0．05％ 硫酸镁0．05％ 硫酸亚铁0．001％ 重铬酸钾7o80 rn1青霉素2．5～3．0 ml琼脂1．5％ ～2．5％ pH 7．4～7．6(NaOH调)33℃培养7 d
1．2．2 改进斜面培养基溶性淀粉l％ 硫酸铵0．3％ 玉米浆1．2％ NaC1 0．3％ 碳酸钙0．3％ 琼脂1．5％ 2．5％ 重铬酸钾70～8O ml青霉素2．5～3．0 Ixg／mlpH 7．5(NaOH调)33℃培养7 d
1．2．3 种子培养基淀粉3．0％ 黄豆饼粉2．5％ 蛋白胨0．5％ 糊精3．O％ 葡萄糖1．0％ NaC10．4％ 硫酸铵0．75％ 碳酸钙0．6％ 硫酸镁0．025％ 磷酸二氢钾0．02％ pH 7．5(NaOH调)121℃灭菌25 min挖取新鲜活化菌种板(1am×2 Cll1)接装50 rn1种子培养基250 ml摇瓶中培养温度33℃ 220 r／min置摇床培养2 d
1．2．4 初始发酵培养基黄豆饼粉3．0％ 淀粉4．O％ 糊精3．0％ 硫酸铵0．2％ 碳酸钙0．6％ 葡萄糖1．0％ 磷酸二氢钾0．04％ pH 6．8121℃灭菌25 rain接种量5％(二级种子)250 ml摇瓶装液量50 ml220 r／min培养2 d300 r／rain培养3 d150 r／rain培养2 d31 培养2 d33℃培养3d29℃培养2 d
1．3 红霉素生物效价测定采碟法
1．4 培养基优化方法
1．4．1 响应面试验前期完成单素试验研究结果采响应面法 培养基组成成分进行优化
1．4．2 验证试验响应面试验优化结果确定佳值预计结果进行验证进行性分析优结果
1．4．3 正交试验根响应面试验单素试验结果硫酸铵碳酸钙玉米浆磷酸二氢钾4种成分进行正交试验
实验具体程数（略）通实验出优化结果：终佳培养基配方黄豆饼粉2．89％ 淀粉3．025％ 糊精2．04％ 葡萄糖1．97％ 碳酸钙0．7％ 硫酸铵0．1％ 玉米浆1．2％ 磷酸二氢钾0．04％ 优化UL5菌株发酵液均生物效价达5 848 mlUL5菌株原始培养基效价4 772 ml相提高22．55％
（2 ）发酵程中参数控性模糊控制应
发酵抗生素生产程关键环节传统发酵工业操作方式开环具验操作者通验知识生产程信息时调整补加营养物料基质策略微生物生长代谢着理想轨迹进行发酵程环境参数PH发酵温度溶解氧浓度D0控制微生物生长程高度非线性时变性关键变量菌丝浓度总糖浓度线测量发酵程控制问题变复杂
采计算机控制技术抗生素发酵程进行实时动控制理优化操作解决述存问题减轻操作员劳动强度提高动化水稳定生产提高发酵系数降低原耗耗
传统控制方法执行控制时需取象数学模型红霉素发酵程参数确定性程非线性变量间耦合性信息完全性程关键参数测量时滞性法取精确数学模型生产实践中发现验操作员然懂控象数学模型十分效系统执行控制操作员系统控制建立直观验实际中取验采取相应决策完成控制工作验系列含语言变量值条件语句规模糊集合理十分恰表达具模糊性语言变量条件语句验模糊条件语句表示然模糊集合理语言变量进行量化模糊推理系统实时输入状态进行处理产生相应控制决策模糊控制器工作程见模糊控制器实质反映输入语言变量输出语言变量语言控制规模糊定量关系算法结构功实现先计算机观测控制程精确量转化模糊输入信息总结控制验策略取语言控制规进行模糊推理模糊决策求输出控制量模糊集模糊判决出输出控制精确量作控象模糊控制器结构通常输入输出变量模糊化模糊推理算法模糊合成模糊判决等部分组成
培养基优化
培养基作微生物养料直接源影响微生物生命生理代谢活动素时做实验获某种单菌落培养基求较简单需够满足相应菌生长代谢需求发酵培养基求条件较实现产业化生产考虑原料制宜价格低廉资源丰富便采购运输适合规模贮藏保证生产供应考虑发酵副产物少选培养基应满足整体工艺求影响通气提取纯化废物处理等等获高产量红霉素找适合菌种生长培养基包括培养基成分组分含量配等确定培养基进行优化
目前响应面法 正交试验法微生物发酵培养基优化常方法单素种素相互作会红霉素生物合成产生程度影响笔者拟采响应面法正交试验法红色糖孢菌产红霉素发酵培养基进行优化期获交互影响显著素佳配提高红霉素发酵水具体优化探索：
（3）通摇瓶发酵试验验证红霉素发酵工艺影响
红霉素产生取决菌丝生长活力营养期应控制菌丝具较高呼吸活力磷酸酶F蛋白酶F淀粉酶等活力合成期提高红霉素产量须菌体控制适生长点红霉素发酵工艺中究竟通温度PH值摇床转速控制方式补料工艺前体添加等条件产生影响？通红霉素摇瓶发酵实验验证影响确定否助工业发酵摇瓶发酵实验般分3级发酵l级种子培养2级种子培养发酵．完整周期12 d1级种子培养2级种子培养进行较考虑蒸发原结果二者差缩短发酵时间减少染菌率般省2级种子培养直接采1级种子进行发酵培养完整周期约10d
31温度PH值红霉素发酵水影响
摇瓶发酵实验般整发酵周期选取合适培养温度PH值根验关文献报道发酵期温度控制(29±0．5)CpH值控制7．0～7．2间采正交设计进行考察摇瓶发酵采2级发酵转速220 r／min全程补料培养
32摇床转速红霉素发酵水影响
菌体生长代谢阶段需氧量 设计4组调节摇床转速方案实验结果采取第2级方案发酵水高效价达318 2单位实验提高8．3
33 补料配方红霉素发酵水影响
摇瓶发酵实验中通改变补料培养基配方考察红霉素发酵水影响补料分补糖补葡萄糖补混合料包括黄豆饼粉玉米浆硫酸铵酵母粉等着重考察中5素：葡萄糖黄豆饼粉硫酸铵酵母粉玉米浆素取5水采均匀设计Ⅲ提高实验精度采拟水法素虚拟10水．利U (10) 表安排实验实验结果利逐步回法n]求回方程 Y17．1 9x +84．44x 359．57x3+2 219．25式中： 红霉素效价 葡萄糖浓度 黄豆饼粉浓度z 硫酸铵浓度验证选取优化配方 i l ( 表示葡萄糖浓度第5水余类)酵母粉玉米浆原配方浓度结果3 305单位预测值 3 360单位较相符认r 薅r 台适 实验结果原配方进行菌体浓度40升41 ．化学效价提高约3．8
34前体添加红霉素发酵水影响
红霉素生物台成影响机酸醇类中发现丙醇明显作摇瓶发酵中+考察6种添加水丙醇红霉素发酵影响实验结果显示前体添加取第4水时应红霉素效价4 220单位加前体时3 31 6单位提高27．3
总结：(1)通摇瓶正交实验+出红霉素优化发酵温度pH值发酵前期：7135℃pH6．8发酵中期 71—31 CpH6．8时优化摇床转速控制方式前体添加水 (2)优化朴料配方效价提高约3 时效债基质浓度回方程 Y17．1gxI+84 44 2—359．5 7x3+2 219．25 (3)优化红霉素发酵水达4 2 20单位原始实验2 854单位提高约47．3
（4）红霉素协萃取新工艺研究
红霉素中性络合萃取体系研究基础进步改善红霉素萃取体系物性提高萃取力降低溶剂成进开发新协萃取体系关协萃取金属元素萃取已研究⋯ 谓协萃取效应指二元元萃取体系中萃取组分分配系数显著种萃取剂单独时分配系数称正协萃取效应反称反协萃取效应协萃取体系分配系数种萃取剂单独时分配系数相等时协萃取效应设B萃取剂萃取分配系数D s萃取剂D 定义D加Ds s+DB(1Xs)式中 s表示S组分物质量分数D协协萃分配系数协萃系数RD协／D加显然R>1正协效应R
实验中红霉素标准品中国药品生物制品检定制备红霉素发酵滤液取红霉素发酵车间试剂均分析纯水纯化水
1．2 实验方法¨
1．2．1 萃取
取定体积红霉素发酵液滤液(红霉素模拟料液)10％ NaOH溶液调pH值10．6
l0．8定体积萃取溶剂加分液漏斗中常温恒温水浴条件振荡混合3～5 min静置30min分层两相分离分测定效价测定水相中衡pH值
1．2．2 反萃取
根实验求配制pH值乙酸缓液常温恒温水浴条件分液漏斗中两相混合
(振荡3 rain)静置30 min分层分相分测定效价测定水相中衡pH值
1．2．3 成盐
反萃取含高浓度红霉素酸水10％NaOH溶液调pH值6．0鼓泡法残存
机溶剂继续调pH值6．8酸水置34—36℃水浴中缓慢滴加定量硫氰酸钠溶液滴加继续保温搅拌30—60 min利晶体生长滤红霉素硫氰酸盐湿晶体纯化水洗涤3次次洗水量约等晶体量然真空干燥(4O℃)晶体12 h取样测定效价含水量等项指标
1．2．4 转碱
取定量红霉素硫氰酸盐溶4．0～4．5倍量(体积／质量)丙酮中搅拌条件滴加10％
20％NaOH溶液溶液澄清分出少量水相分两次加进2—6倍丙酮体积纯化水静置夜滤红霉素碱湿晶体先纯化水搅洗顶洗晶体干燥红霉素碱成品取样测定效价指标
1．3 分析方法
根红霉素硫酸作显棕黄色波长485 nm处吸收特性采化学法处理进
行分光光度测定仪器721型分光光度计红霉素硫氰酸盐红霉素碱成品均生物测定法测定效价
1．4 协萃取体系研究
采红霉素配制料液实际发酵滤液进行协萃体系实验测定研究二元协萃体
系中B组分种低水溶性脂肪醇类萃取剂s组分种极性协萃溶剂具稀释剂作实验条件：水相料液中红霉素浓度1 380 u／mL水相中衡pH值10．6—1 0．8萃取相(0：A)1：8萃取温度l9℃ 两相混合时间3 min选择三种溶剂作协萃溶剂分表示ss：s改变Bs配测定红霉素萃取分配系数D采实际料液实验条件：水相料液中红霉素浓度4 667 u／mL(B+s1萃取)4 312 u／mL
(B+s 萃取)水相中衡pH值10．6～10．8萃取相(0：A)1：6萃取温度28℃ 两相混合时间3 min实验结果见：①B+S B+s B+s 三萃取体系均峰值曲线萃取分配系数远脂肪醇煤油萃取体系(萃取分配系数43．15⋯)均明显正协萃效应②B+s B+S 协萃体系实际料液萃取曲线高模拟料液萃取曲线现象萃取温度致(升温利萃取)时实际发酵料液中含定量盐助提高红霉素萃取分配系数表1中B+S 萃取体系实验数计算：R>1说明该体系明显协萃效应实验条件：水相料液中红霉素浓度1 650u／mL水相中衡pH值10．6—10．8萃取相(0：A)1：8萃取温度17℃ 两相混合时间3 min取协萃体系中应R分配醋酸丁酯进行发现见协萃体系萃取力远醋酸丁酯萃取力
2 新萃取体系发酵料液实验结果研究协萃体系中综合较(包括萃取性体系物性毒性济性等)选定B+S协萃体系进行进步研究采实际发酵滤液进行萃取分机相反萃水相成盐进行较研究见新协萃体系萃取( 时损耗量水相成盐时损耗量低机相萃取反萃)程中损耗量远低醋酸丁酯萃取成盐时损耗量反萃取定收率水相成盐产品回收率会低机相成盐时产品回收率终红霉素碱产品中否萃取溶剂残留残留量少疑关注问题采协萃体系进行红霉素萃取成盐(溶剂相中成红霉素硫氰酸盐)转碱全流程试验红霉素碱产品进行溶剂残留量测定测定方法采气相色谱法心]测定结果表明溶剂残留量红霉素硫氰酸盐洗涤条件密切相关研究采效洗涤方法终成品中溶剂残留降低100 mg／L
3 结
文研究开发具正协萃取效应新萃取体系醋酸丁酯较新体系萃取程中损耗
少萃取收率高价格幅度降具明显技术济优越性新萃取体系机相成盐反萃水相成盐两工艺流程水相成盐具更低溶剂损耗量产品总回收率受定影响采实际发酵滤洗液实验表明新萃取体系萃取程中乳化趋势易生复适工业生产新萃取体系
四 红霉素发酵前景展
床应领域扩阿奇霉素罗红霉素克拉霉素等代表新型半合成红霉素出现快速拉动红霉素原料药生产需求西方济学家预测2010年红霉素系列产品全球市场总规模达70亿美元市场前景乐观抗生素发酵生产身高耗产业存环境污染等问题发达国家年正逐步抗生素原料药生产转移中国等发展中国家目前国世界红霉素生产出口第国年产量超7000吨
采微生物发酵获取药抗生素原料途径国作世界原料抗生素生产国发酵单位偏低产品质量偏低缺乏知识产权新型抗生素药物等系列原严重制约产业发展红霉素作种广谱抗生素药物进入床提高产生菌种发酵单位目遗传育种工作直未停止微生物次级代谢产物生物合成机制解常规诱变选育方法存周期长效率低机性缺点年红霉素高产菌株筛选方面收效着分子生物学技术发展国际红霉素产生菌种基工程改造方面进行诸尝试然研究集中红霉素产生相关底物供应限制素改进方面未红霉素生物合成次生代谢途径做特异性遗传修饰解决红霉素生产中常面效组分偏低等问题时缺乏效针性
基红霉素组分结构差异相互转化化学质运组合生物合成技术方法原理红霉素工业高产菌株进行针性遗传改良通发酵程中修饰酶表达例调整效副产物组分BC完全转化效组分红霉素A提高产品质量（基消副产物）时效提高产品产量达25左右
机知识创新程中面国家需求立足原始创新方面做件重意义研究工作充分体现学科交叉优势红霉素工业生产菌种遗传改造取系列创新技术生产中成功实施预示着样理念抗生素发酵生产中着普遍推广意义利促进国传统抗生素生产行业整体技术水提升
参考文献
1红霉素发酵工艺优化工业化生产技术研究 张金国 中国科技成果2007 年第13 期
2红霉素发酵程控制技术 动化技术应2009年第28卷第7期 施敏敏
3红霉素发酵培养基优化研究 安徽农业科学 2011 左勇
4红霉素协萃取新工艺研究 河南化工 2009第二期 李武德李洲宋喜芳
5红霉素摇瓶发酵实验工艺条件 西北学学报(然科学版) 范代娣
6红霉素产生菌Serythearafl基改造进展 中国抗生素杂志2010年8月第35卷第8期 窦海青
7 Combined UF–NF membrane system for filtering erythromycin fermentation broth and concentrating the filtrate to improve the downstream efficiency
Separation and Purification Technology
Volume 66 Issue 2 20 April 2009 Pages 390–396
Yasan He
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