非洲 猪 瘟 (Africans winef ever简称ASF)非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪种急性热性
高度接触传染性疾病特征病程短病死率高床症状病理变化均类似急性猪瘟表现高热
皮肤充血流产水肿脏器出血世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)
Office Intentional des Epizootic(法)OIE]国规定动物类疾病病毒鲜肉腌肉中存活数
月
AS F 实验室诊断分两类第类包括病毒分离病毒抗原基组 DNA检测第二类包括
抗体检测试验方法选择国区疾病情况定没ASF怀疑该病存
国家实验室诊断必须应感染性诊断方法应聚合酶链反应(PCR)检测病毒基组DNA
应酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体
国 ASF国家目前尚ASF检疫方法农业部动物检疫199年美国梅岛动物病
研究中心进行ASF感染性快速检测方法合作研究建立适合国疑感染动物
血液脏器官中直接检测ASFV DNAPCR技术检测血清中ASFV抗体ELISA方法
标准两种方法技术求作规定
标 准 附录A附录B附录C标准附录
标 准 中华民国农业部提出
标 准 全国动物检疫标准化技术委员会口
标 准起 草单位农业部动物检疫
标 准 起草蒋正军王树双尹燕博蔡丽娟郭福生陆明哲孙淑芳龚振华
中 华 民 国 国 家 标 准
非洲猪瘟诊断技术
GB'r 186482002
Diagnostic techniques for African swine fever
范围
标准规定非洲猪瘟(ASF)聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附试验(ELISA)技术求
标准适生猪野猪等易感动物产品ASF诊断检疫
2 PCR试验
21 材料准备
211 样品DNA制备方法见附录A(标准附录)
212 电泳液缓液配制方法见附录B(标准附录)
213 标准ASFVBA_株DNA引物1引物2125 m molLd N丁P载样缓液
214 台克(Taq)D NA聚合酶分子量100碱基(bp)Ladder(标准DNA Marker)010倍浓度
聚合酶链反应(PCR)扩增缓液
21 5 动DNA热循环仪
22 操作方法
221 列试剂求量加075 m L离心中灭菌蒸馏水(245 风)10倍浓度PCR扩
增缓液(5 VL)1 25 mmolL dNTP贮存液(8 pL)引物1(1 pL)引物2(1 pL)样品DNA溶液
(10 JAI)(见附录A)Taq DNA聚合酶(5 PI)
222 设定两阳性标准ASFVBA株10 pL DNA含量10 fg阴性含
DNA灭菌蒸馏水10讨
223 取50 pl矿物油覆盖混合液
224 加样品混合物Eppendorf放动DNA热环仪中述程序条件进行
DNA扩增 94C 5m in50 C2m in72 C3 m in循环次94C1m in50 'C'2m in72 C3 m in循环30次
94 C1 min50C2 min72'C10 min循环次置4'C保存
225 述步骤完成矿物油心取出种反应混合物20 pL放支干净Eppendorf
中加2 pL载样缓液
226 样品编号加应2琼脂凝胶(见附录B1)板孔中中孔加标准阳性
DNA样品凝胶边孔中加标准分子量DNA Marker
22 7 凝胶150 v恒定电压电泳2 ha
228 结果判定紫外光源检查凝胶阳性样品出现条孤立阳性PCR产物
步迁移带分子量265 bp阴性非ASF感染猪265 by带
3 酶联免疫吸附试验(ELISA )
3门试剂标准抗原
中华民国国家质t监督检验检疫总局20020219批准20D20501实施
Gs'r 186482002
0 1 molL磷酸盐缓液(制备方法见附录Cl)底物溶液(见附录C2)
操作方法
331 取EIASA微量滴定板孔加I molL pH7 2磷酸盐缓液稀释工作滴度抗原溶
液50 pL封板4C作16 h(夜)
332 pH72 01 m olL磷酸盐缓液洗板3次次2m in
333 含05Y吐温20 1 molI磷酸盐缓液溶液检血清阳性阴性血清作
30倍稀释稀释血清加抗原包孔中孔中加50川J
134 滴定板放微量振荡器37 C作30 min然1 molL磷酸盐缓液洗3次
335 孔加50 pL含005吐温20 1 moll磷酸盐缓液配制免疫球蛋白G(IgG)
抗猪氧化物酶结合物溶液
336 滴定板放振荡器37℃作1h然1 molI磷酸盐缓液洗3次
337 孔加50 p1底物溶液
338 室温显色15 min
I19 孔加50 pLl molI硫酸终止反应
3310 判定结果阳性血清肉眼辩认清亮黄色ELISA检测仪检测孔光吸收
值检测波长492 nm种血清吸收值超块板中阴性血清均吸收值两
倍判阳性
GBT 186482002
附 录 A
(标 准附录)
样品DNA制备
Al 组织放灭菌沙子研钵中研磨成糊状加5m L10m l含1牛血清01 m olLpH72
01 molI磷酸盐缓液研碎组织作10倍稀释制成组织悬液
A2 全血样品含1牛血清1 m olI磷酸盐缓液作 110 00倍稀释制成悬液
A3 污染物样品粪便等 1 molL磷酸盐缓液作10倍稀释制成悬液
A4 500r min离心5m in
A5 取500川加螺旋帽离心中煮沸10 min
A6 型高速离心机13 000 rmin离心5 min
A取10川清液作PCR试验样品DNA
附 录 B
(标 准附录)
电泳缓液配制
B1 琼脂糖凝胶TAE缓液(50倍)
三轻 甲 基 氨基甲烷碱(Trisb ase) 2 42 g
冰 乙 酸 571 m l
05 m ol 八(pH80 )乙二胺四乙酸(EDTA) 1 00 m L
蒸馏 水 700m l
述 混 合物完全溶解加蒸馏水10 00m l置4℃冰箱中备配制2琼脂糖凝胶
作电泳缓液蒸馏水稀释50倍成TAE缓液
B2 2琼脂格凝胶板制备
取 1g 琼 脂糖(电泳纯)加50m LT AE缓液中微波炉中充分溶解加终浓度
05 y gml滨化乙锭TAE定容50m L冷60℃倒凝胶板中距离底板5 m m
位置放置梳子便加琼脂糖形成完加样孔子凝胶厚度4 mm凝胶完全凝固
心移梳子凝胶板放电泳槽中加恰没胶面约1 mm深足量电泳缓液
附 录 C
(标 准 附 录 )
酶联免疫吸附试验溶液配制
Cl 01 m olL磷酸盐缓液配制
列试剂次序加2 000 ml体积容器中
氯化钠8006 g
氯化钾 2002 g
磷酸氢二钠 115 0g
Gs'r 186482002
磷酸二氢钾 201 g
双蒸馏水800 ml
混匀pH试纸调pH72双蒸馏水定容1 000 ml
C2 底物溶液[邻苯二胺权化氢(OPDH202)]
C21 01 m olIP H50磷酸盐柠檬酸盐缓液
列 试 剂次序加10 00M I体积容器中充分溶解成
磷酸 氢 二 钠(NaHPO·12HzO) 71 6 g
柠檬 酸 2g
蒸馏 水 10 00m l
C22 底物溶液
1 m ol pH50 磷酸盐柠檬酸盐缓液 100M I
邻苯 二 胺 (OPD) 40 m g
30 ( 氧化氢)(H O) 0 15 m l
液 光 敏感应避免强光直射现配现
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高度接触传染性疾病特征病程短病死率高床症状病理变化均类似急性猪瘟表现高热
皮肤充血流产水肿脏器出血世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)
Office Intentional des Epizootic(法)OIE]国规定动物类疾病病毒鲜肉腌肉中存活数
月
AS F 实验室诊断分两类第类包括病毒分离病毒抗原基组 DNA检测第二类包括
抗体检测试验方法选择国区疾病情况定没ASF怀疑该病存
国家实验室诊断必须应感染性诊断方法应聚合酶链反应(PCR)检测病毒基组DNA
应酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体
国 ASF国家目前尚ASF检疫方法农业部动物检疫199年美国梅岛动物病
研究中心进行ASF感染性快速检测方法合作研究建立适合国疑感染动物
血液脏器官中直接检测ASFV DNAPCR技术检测血清中ASFV抗体ELISA方法
标准两种方法技术求作规定
标 准 附录A附录B附录C标准附录
标 准 中华民国农业部提出
标 准 全国动物检疫标准化技术委员会口
标 准起 草单位农业部动物检疫
标 准 起草蒋正军王树双尹燕博蔡丽娟郭福生陆明哲孙淑芳龚振华
中 华 民 国 国 家 标 准
非洲猪瘟诊断技术
GB'r 186482002
Diagnostic techniques for African swine fever
范围
标准规定非洲猪瘟(ASF)聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附试验(ELISA)技术求
标准适生猪野猪等易感动物产品ASF诊断检疫
2 PCR试验
21 材料准备
211 样品DNA制备方法见附录A(标准附录)
212 电泳液缓液配制方法见附录B(标准附录)
213 标准ASFVBA_株DNA引物1引物2125 m molLd N丁P载样缓液
214 台克(Taq)D NA聚合酶分子量100碱基(bp)Ladder(标准DNA Marker)010倍浓度
聚合酶链反应(PCR)扩增缓液
21 5 动DNA热循环仪
22 操作方法
221 列试剂求量加075 m L离心中灭菌蒸馏水(245 风)10倍浓度PCR扩
增缓液(5 VL)1 25 mmolL dNTP贮存液(8 pL)引物1(1 pL)引物2(1 pL)样品DNA溶液
(10 JAI)(见附录A)Taq DNA聚合酶(5 PI)
222 设定两阳性标准ASFVBA株10 pL DNA含量10 fg阴性含
DNA灭菌蒸馏水10讨
223 取50 pl矿物油覆盖混合液
224 加样品混合物Eppendorf放动DNA热环仪中述程序条件进行
DNA扩增 94C 5m in50 C2m in72 C3 m in循环次94C1m in50 'C'2m in72 C3 m in循环30次
94 C1 min50C2 min72'C10 min循环次置4'C保存
225 述步骤完成矿物油心取出种反应混合物20 pL放支干净Eppendorf
中加2 pL载样缓液
226 样品编号加应2琼脂凝胶(见附录B1)板孔中中孔加标准阳性
DNA样品凝胶边孔中加标准分子量DNA Marker
22 7 凝胶150 v恒定电压电泳2 ha
228 结果判定紫外光源检查凝胶阳性样品出现条孤立阳性PCR产物
步迁移带分子量265 bp阴性非ASF感染猪265 by带
3 酶联免疫吸附试验(ELISA )
3门试剂标准抗原
中华民国国家质t监督检验检疫总局20020219批准20D20501实施
Gs'r 186482002
0 1 molL磷酸盐缓液(制备方法见附录Cl)底物溶液(见附录C2)
操作方法
331 取EIASA微量滴定板孔加I molL pH7 2磷酸盐缓液稀释工作滴度抗原溶
液50 pL封板4C作16 h(夜)
332 pH72 01 m olL磷酸盐缓液洗板3次次2m in
333 含05Y吐温20 1 molI磷酸盐缓液溶液检血清阳性阴性血清作
30倍稀释稀释血清加抗原包孔中孔中加50川J
134 滴定板放微量振荡器37 C作30 min然1 molL磷酸盐缓液洗3次
335 孔加50 pL含005吐温20 1 moll磷酸盐缓液配制免疫球蛋白G(IgG)
抗猪氧化物酶结合物溶液
336 滴定板放振荡器37℃作1h然1 molI磷酸盐缓液洗3次
337 孔加50 p1底物溶液
338 室温显色15 min
I19 孔加50 pLl molI硫酸终止反应
3310 判定结果阳性血清肉眼辩认清亮黄色ELISA检测仪检测孔光吸收
值检测波长492 nm种血清吸收值超块板中阴性血清均吸收值两
倍判阳性
GBT 186482002
附 录 A
(标 准附录)
样品DNA制备
Al 组织放灭菌沙子研钵中研磨成糊状加5m L10m l含1牛血清01 m olLpH72
01 molI磷酸盐缓液研碎组织作10倍稀释制成组织悬液
A2 全血样品含1牛血清1 m olI磷酸盐缓液作 110 00倍稀释制成悬液
A3 污染物样品粪便等 1 molL磷酸盐缓液作10倍稀释制成悬液
A4 500r min离心5m in
A5 取500川加螺旋帽离心中煮沸10 min
A6 型高速离心机13 000 rmin离心5 min
A取10川清液作PCR试验样品DNA
附 录 B
(标 准附录)
电泳缓液配制
B1 琼脂糖凝胶TAE缓液(50倍)
三轻 甲 基 氨基甲烷碱(Trisb ase) 2 42 g
冰 乙 酸 571 m l
05 m ol 八(pH80 )乙二胺四乙酸(EDTA) 1 00 m L
蒸馏 水 700m l
述 混 合物完全溶解加蒸馏水10 00m l置4℃冰箱中备配制2琼脂糖凝胶
作电泳缓液蒸馏水稀释50倍成TAE缓液
B2 2琼脂格凝胶板制备
取 1g 琼 脂糖(电泳纯)加50m LT AE缓液中微波炉中充分溶解加终浓度
05 y gml滨化乙锭TAE定容50m L冷60℃倒凝胶板中距离底板5 m m
位置放置梳子便加琼脂糖形成完加样孔子凝胶厚度4 mm凝胶完全凝固
心移梳子凝胶板放电泳槽中加恰没胶面约1 mm深足量电泳缓液
附 录 C
(标 准 附 录 )
酶联免疫吸附试验溶液配制
Cl 01 m olL磷酸盐缓液配制
列试剂次序加2 000 ml体积容器中
氯化钠8006 g
氯化钾 2002 g
磷酸氢二钠 115 0g
Gs'r 186482002
磷酸二氢钾 201 g
双蒸馏水800 ml
混匀pH试纸调pH72双蒸馏水定容1 000 ml
C2 底物溶液[邻苯二胺权化氢(OPDH202)]
C21 01 m olIP H50磷酸盐柠檬酸盐缓液
列 试 剂次序加10 00M I体积容器中充分溶解成
磷酸 氢 二 钠(NaHPO·12HzO) 71 6 g
柠檬 酸 2g
蒸馏 水 10 00m l
C22 底物溶液
1 m ol pH50 磷酸盐柠檬酸盐缓液 100M I
邻苯 二 胺 (OPD) 40 m g
30 ( 氧化氢)(H O) 0 15 m l
液 光 敏感应避免强光直射现配现
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