代测序镜逆行胰胆造影（ERCP）获胆道标相结合改善恶性胆狭窄患者检测理
目：
成血清CA199病理评估改善鉴良性恶性胆狭窄然诊断难题新代测序（NGS）新发展癌症早期检测理开辟新机会迄止尚未严格应胆道标
设计：
前瞻性评估28基NGS组（BiliSeq）镜逆行胰胆造影术 获胆狭窄患者胆道标评估血清ca199病理评估BiliSeq诊断性252例患者（57次实验195次验证）进行346例胆道标评估
结果：
BiliSeq恶性狭窄敏感性特异性分73％100％相升高血清ca199病理评估敏感性分76％48％特异性分69％99％BiliSeq病理评估组合敏感性提高83％保持99％特异性 BiliSeq胆道刷病理评估敏感性35％提高77％胆道活检敏感性52％提高83％原发性硬化性胆炎（PSc）患者中病理评估相BiliSeq敏感性83％病理评估敏感性8％20名（8％）患者中鉴定出治疗相关基组改变两名ERBB2扩增胆癌患者接受基曲妥珠单抗治疗方案具测量床放射学反应
结：BiliSeq联合胆道标病理评估增加恶性狭窄检出率特PSc患者外BiliSeq确定患者进行特定抗癌治疗分层改变
介绍：
涉胆狭窄代表组异质性良性恶性疾病1良性胆狭窄原发性硬化性胆炎（PSC）IgG4相关性硬化性胆炎医源性损伤感染等太常见病恶性原包括涉胰胆壶腹壶腹肝脏少转移性癌症癌然区分良性恶性胆狭窄挑战性赖床检查生化检测（血清CA199）放射摄影成镜手术病理评估学科方法考虑某良性狭窄病恶性肿瘤诱发素种区分更艰巨例般群相PSC胆癌风险增加400倍相关镜逆行胰胆造影术（ERCP）通定义形态学成特征疾病受累程度评估胆狭窄中发挥关键作然透视期间没区分良性恶性特征性特征外直接胆镜检查分级准确观察者致性差ERCP期间胆刷镊子活组织检查病理学确认首选方法然检测恶性肿瘤敏感性8％67％间改进恶性条件检测开发辅助技术包括数字图分析KRAS突变检测荧光原位杂交然检测灵敏度介14％60％间考虑病理评估低敏感性辅助研究患者常接受种ERCP手术诊断奇怪恶性狭窄治疗决策通常会延迟数周数月患者面疾病进展风险相反良性胆狭窄误诊导致必手术切报道达15％疑似恶性肿瘤接受手术患者患良性疾病种情况令担忧手术切相较高发病率死亡率关更需创新术前方法改善良性恶性狭窄患者分层年中理解肿瘤基组景观方面取显着进展次涉胆系统全外显子组全基组测序研究报道相少数致癌基肿瘤抑制基复发性基组改变KRASTP53CDKN2ASMAD4外基组变异部分作ATMERBB2赋予特定抗癌疗法易感性时新型分子诊断学引入术前标研究开辟新机会35 36胆标通常少量诊断材料特征异质细胞群组成模糊模仿恶性肿瘤处理分子检测检测样中例突变细胞高度敏感新代测序（NGS）高分析灵敏度基分析相结合评估胆狭窄吸引力选择项研究中开发种高灵敏度靶NGS测定称BiliSeq28种基基通常涉胆系统恶性肿瘤中发生突变扩增缺失该测试床实验室改进修正案（CLIA） 认证美国病理学家学院（CAP）认床实验室ERCP获胆刷活组织检查细胞学涂片载玻片酒精固定剂（例CytoLyt）福尔马林固定paraffin嵌入式（FFPE）组织中提取DNA会降低整体产量质量提交专门胆刷洗活组织检查获常规标进行病理学评估直接进行BiliSeq检测目标前瞻性评估群患者BiliSeq检测：（1）确定检测恶性狭窄准确性（2）较作诊断方式辅助手段表现（3）评估胆标中检测基组改变时患者理影响
患者群：
患者群匹兹堡医学中心（UPMC）标准ERCP2014年9月2016年4月期间胆狭窄患者前瞻性收集57名患者胆道标训练队列匹兹堡学资助病理学系完成培训队列2016年9月2018年8月期间累计195名患者进行验证Pittsburgh学精准医学研究提供部分资助总收集163胆道刷172胆道活检组织进行病理学评估收集160刷牙135活组织检查BiliSeq测试胆标提交UPMC解剖病理学实验室进行常规细胞病理学病理学评估UPMC分子基组病理学（MGP）实验室ERCP程序2448时进行BiliSeq检测医疗记录进行审查记录患者口统计学床表现ERCP发现发镜超声（EUS）EUS细针穿刺（FNA）血清CA199水相应刷牙病理诊断活组织检查重复ERCP手术进行单独分析产生24胆道刷29胆道活检病理评估24刷牙27活组织检查
BiliSeq测试狭窄病基手术切样活检标（尸检开腹腹腔镜手术切活组织检查皮穿刺ERCP获性胆道活检）诊断病理学（n 145）访12月床标准（n 75）报道胆汁刷特异性<100％刷牙标病理评估结果视诊断病理学外ERCP阴性获活检认良性病支持果重复成ERCP访12月时记录先前导异常分辨率稳定性狭窄指定良性胆病相恶性肿瘤床诊断定义没急性胆病情况放射相成质量访12月床放射学进展床放射性死亡床诊断图形确定涉胆恶性肿瘤手术切活检标根标准组织形态学标准进行诊断线补充表1中详细描述诊断床访信息包括位患者访方法标收集样ERCP程中获包括细胞学刷镊子活组织检查两者细胞学刷子狭窄部位采集次复运动样品刷子细胞病理学检查置15mL ThinPrep CytoLyt溶液（HologicMarlboroughMassachusettsUSA）中24时转移样品处理单独刷子BiliSeq测试放入含基洗涤剂DNA裂解缓液收集瓶中然收集瓶24时运送UPMC MGP实验室进行相应处理类似方法镊子生物活检单独活组织检查提交病理检查BiliSeq测试测试需标细胞数标刷牙活组织检查相
biliseq测试：
NGS作床护理部分前瞻性进行UPMC MGP实验室10天完成该实验室通CLIA认证CAP认证MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒（RocheIndianapolisIndianaUSA）Compact MagNA Pure（Roche）刷洗活检样品进行类似基组DNA分离提交刷牙活检标情况两样DNA合续分析dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher ScientificWalthamMassachusettsUSA）Qubit 20荧光计定量提取DNA基扩增靶NGS基基组区域引物（https： mgpupmccom Applications mgp Content OncoSeq_Hotspotspdf）进行：AKT1ALKATMBRAF
前述CDKN2ACTNNB1EGFRERBB2ERBB4FGFR1FGFR2FGFR3GNA11GNAQGNASHRASIDH1IDH2KITKRASMETNRASPDGFRAPIK3CAPTENSMAD4TP53VHL 39扩增子进行条形码化纯化特定衔接子连接2200 TapeStation（Agilent TechnologiesSanta ClaraCaliforniaUSA）进行DNA量质量检查 Ion One Touch 2One Touch ES制备丰富模板通半导体芯片离子球粒子进行测试根制造商说明书（Thermo Fisher Scientific）离子质子系统进行规模行测序Torrent Suite软件V342进行分析点突变插入缺失拷贝数改变 根2017年分子病理学协会（AMP）美国床肿瘤学会（ASCO）美国病理学家学会（CAP）联合识指南基层次系统解释癌症中序列变异变体进行优先排序40报告第级第二级第三级变体Tier ITier II变体续分析符合I级Tier II变体基组改变存认种积极BiliSeq结果BiliSeq结果确定缺乏第级第二级变体检测检测限3％突变等位基频率（AF）测试覆盖深度500？ 鉴定突变基突变等位基野生型等位基读数计算AF百分形式报告前述进行拷贝数变异分析基扩增前述存≥6拷贝变体荧光原位杂交（FISH）分析验证
靶基组改变分类床相关基组改变定义目前市场注册床试验中抗癌药物靶改变报告激酶抑制剂靶基组改变（野生型KRASNRASHRAS基组改变情况）包括：ALKBRAFEGFRERBB2FGFR1FGFR2FGFR3MET43 46 ATM中基组改变针基铂方案聚（ADP核糖）聚合酶抑制47外已开发出体IDH1IDH2突变具高度特异性药理学抑制剂
统计分析研究中训练组样量估计功效计算基机构中胆狭窄60％恶性肿瘤患病率ERCP获标病理评估检测恶性肿瘤相应40％敏感性少50名患者样量产生> 80％功率α005Fisher精确检验二分类变量较评估突变状态差异统计分析训练组Youden指数生成接收器操作特征（ROC）曲线较生物标记物性建立截止水选择终截止值通梯形方法计算曲线面积（AUC）化然考虑生物学原理模型简单性确诊诊断病理学病例标准2×2列联表计算灵敏度特异性非说明重复测试计算体敏感性特异性生物标志物SPSS Statistical软件V25（IBMArmonkNew YorkUSA）进行统计学分析统计学显着性定义p值<005
结果：
血清CA199表现病理评估培训验证队列中biliseq测试57名接受ERCP治疗胆狭窄患者培训队列前瞻性进行生物标志物分析总结表1线补充数表1中病理评估BiliSeq测试血清CA199研究胆刷活组织检查57名（98％）患者中56名进行中名患者床表现时未进行CA199测量 考虑缺乏识CA199截止值作恶性狭窄标志物进行CA199水探索性研究（线补充图1）通ROC曲线分析血清CA199区分恶性良性狭窄AUC0727Youden指数选择≥45U mL阈值时升高CA199检测恶性敏感性62％特异性77％（表2）ERCP期间获病理学评估标包括22名（39％）患者胆道刷22名（39％）患者胆道活检13名（22％）患者胆道刷活组织检查腺癌少疑病理诊断恶性肿瘤敏感性特异性分相关46％100％提交配独立胆道刷活组织检查样BiliSeq测试然时进行病理评估13例刷牙活检标患者2名患者进行配刷牙获BiliSeq检测活检标剩余11名患者提交相应刷牙标未提交活检标BiliSeq测试总57名患者59胆标BiliSeq评估基组改变仅恶性狭窄中检测良性胆病变病例中存（图1） BiliSeq鉴定基组改变敏感性特异性分63％100％前瞻性收集验证队列195名患者组成中163名（84％）患者接受访（线补充数表1）出现时163名（88％）患者中144名患者测量血清CA199提交病理评估标包括49名（30％）患者胆道刷57名（35％）患者胆道活检57名（35％）患者胆道刷活组织检查提交成独立刷牙活检标BiliSeq测试时进行病理评估57例刷牙活检标患者27例（47％）单独刷牙活检标进行BiliSeq检测剩余30名患者中分24名患者6名患者获相应刷牙活组织检查BiliSeq测试163名患者190胆标进行BiliSeq测试根≥44U mL界值验证组血清CA199少高级胆道发育良敏感性81％特异性65％（表2）训练组相似病理评估BiliSeq测试表现分49％98％76％100％敏感性特异性相关包括220名访患者训练组验证组进行总体分析显示血清CA199病理评估BiliSeq检测敏感性特异性分76％69％48％99％73％100％病理评估BiliSeq测试组合两种测定灵敏度提高83％保持99％高特异性病理学评估BiliSeq测试中加入血清CA199进步敏感性提高95％特异性降低68％胆标亚型分析PsC历史重复ErCP生物标志物检测132胆刷114胆道活检组配病理评估BiliSeq检测（表3）胆道刷胆道活检病理评估敏感性特异性分35％98％52％100％相胆汁刷胆道活检BiliSeq测试分71％75％更高灵敏度相关特异性100％114例胆道活检中28例通数字胆镜检查获余标通胆造影获没统计学意义
胆镜引导胆造影引导胆道活检中确定敏感性特异性差异（线补充表2）29名患者提交病理评估BiliSeq测试匹配胆道刷胆道活检标病例刷洗活组织检查病理评估BiliSeq刷牙活组织检查测试敏感性分26％39％70％78％特异性100％ EUSFNA改善恶性远端胆狭窄诊断总141例患者接受远端胆狭窄发EUS86例患者FNA进行61例患者61例发ERCPEUSFNA患者中基ERCP获胆道标EUSFNA标病理评估检测恶性远端胆狭窄敏感性特异性分59％95％58分％100％相BiliSeq测试产生敏感性76％特异性100％外获ERCP标BiliSeq检测病理评估相结合恶性肿瘤敏感性90％特异性95％加入EUSFNA评估敏感性增加93％特异性保持95％ 220例（17％）患者中37例PSC记录该队列包括12胆狭窄少高级胆道发育良25胆狭窄伴良性胆病根美国肝病研究协会（AASLD）指南血清CA199> 129 U mL高风险群中疑似胆癌种标志物50基129 U mL界值血清CA199少高级胆汁敏感性67％特异性84％发育良病理评估敏感性仅8％特异性100％相BiliSeq测试灵敏度特异性分83％100％血清CA199BiliSeq测试相结合灵敏度提高92％特异性降低84％BiliSeq测试添加病理学评估未改善单独BiliSeq敏感性220名（9％）患者中20名（线补充表3）进行病理评估Biliseq测试重复ERCP具胆道刷活组织检查16名患者重复该程次两名患者重复该程两次两名患者重复三次访基础15名患者患严重狭窄5名患者患良性狭窄15例恶性狭窄患者中8例患者BiliSeq检测初始重复胆基组改变然初始胆道刷活组织检查相应病理评估恶性肿瘤阴性事实8例恶性狭窄中5例未出现少疑恶性肿瘤术前诊断剩7名患者通BiliSeq测试两名患者进行病理评估检测基组改变（阳性）重复生物标志物测试恶性病理学阴性BiliSeq两名患者阳性两种诊断方式名患者均阴性重复ERCP包含略微增加病理评估敏感性特异性BiliSeq测试组合两种测定分51％99％75％100％87％99％成ErCP获胆标诊断病理标较biliseq测试诊断病理学材料220名（66％）患者中145名包括134名恶性肿瘤11名良性胆病134例（40％）恶性肿瘤中54例（线补充表4）诊断病理学标进行BiliSeq测试54例患者中检测基组改变中包括12例ERCP获胆标标BiliSeq基组改变呈阴性剩余42肿瘤中4病例基组谱中包括ERCP获胆标BiliSeq检测基组改变治疗相关基组改变治疗数根先前报道行目标化疗反应预测标志物ERCP获胆标进行BiliSeq检测确定150例（13％）癌症中20例治疗相关基组改变（线补充图2） ）涉受体酪氨酸激酶（RTK） Ras 丝裂原活化蛋白（MAP）激酶信号通路基改变包括ERBB2（n 6）MET（n 4）ALK（n 2）FGFR2数情况（n 1365％）检测（n 3）FGFR3（n 2）ATM（n 2）IDH1（n 1）IDH2（n 2）中发现行改变ERBB2改变恶性肿瘤中两名患者（腺癌具ERBB2拷贝数增加）接受针HER2 neu靶化疗单独标准化疗第位患者名老年妇女患黄疸腹痛加剧周肝功检查升高血清CA19955 U mLCT扫描显示胆结石肝胆扩张 ERCP显示肝胆狭窄病理评估BiliSeq测试胆道刷病理评估显示高度典型皮细胞疑腺癌然BiliSeq测试检测ERBB2拷贝数增加TP53突变（pC242fs * 5c723delC）2周三期CT扫描显示段4B 5中21cm转移性肝脏病变（图2A）血清CA1994224U mL重复ERCP确认恶性肿瘤胆刷活组织检查均侵袭性中分化腺癌床认肝胆细胞癌患者开始吉西滨铂曲妥珠单抗治疗3月血清CA199降14 U mL转移性肝脏病变降06 cm外访ERCP指出患者胆狭窄改善（线补充图3）诊断年患者目前活血清CA199继续处正常范围转移性病变尺寸03cm（图2B）第二名患者（线补充表1患者166）名中年男性患黄疸腹痛肝功检查升高血清CA199升高2383 U mL肺门周围胆增厚关MRCP肝门部严重MRCPERCP胆刷确定铋IIIa狭窄活检腺癌阳性患者相应BiliSeq测试显示ERBB2拷贝数增加TP53CDKN2A拷贝数丢失该患者转诊进行肝移植进步检查发现78段26 cm转移灶（图2C）血清CA1997959 U mL时患者开始吉西滨铂曲妥珠单抗治疗床周围胆癌 3月患者血清CA199标准化94 U mL诊断8月患者目前活血清CA199继续处正常范围转移病灶尺寸降07cm（图2D）
讨：横断面成血清研究镜技术病理评估方面改进良性恶性胆狭窄间区然诊断难题目前研究中开发独立床验证靶NGS检测评估胆狭窄发现靶NGS检测BiliSeq单独病理评估具更高敏感性（73％48％）更高特异性（100％99％）检测少涉胆高度胆道发育良外两种测试（BiliSeq病理评估）组合单独测试（83％）具更高灵敏度时保持高特异性（99％）迄止研究已研究靶NGS胆狭窄中应Bankov等发表项BiliSeq类似设计NGS检测结果采回顾性队列分析16例确定胆活检胆癌患者访作者未评估胆道刷洗标获NGS DNAFFPE组织块中提取该作者承认FFPE组织低输入低质量DNA续分析需DNA富集技术然良性组未较测定灵敏度81％BiliSeq相 Dudley等报道胆标NGS检测更全面评估作者评估73胆8胰刷牙标队列Bankov等相反研究队列包括胆生物学外获专门DNA分离刷CytoLyt保存标中提取DNA酒精固定导致DNA降解73（11％）刷牙标中8未通NGS测试出意料研究中没胆道刷牙活检标未通BiliSeq测试剩65胆道刷牙标中Dudley等报道敏感性68％特异性97％优病理评估然作者确定假阳性结果种情况NGS检测访时间清楚根作者排胆系统发育良性BiliSeq未发现假阳性病例重复检测37例（25％）假阴性病例确定假阴性NGS结果原37种恶性肿瘤中12种诊断病理材料进行BiliSeq检测分子组中检测28基中少基组改变考虑胆标采集技术困难已知采样失败发生狭窄采样充分解释者低标肿瘤细胞性素NGS测定低检测限突变等位基约3％者杂合突变例KRAS6％肿瘤细胞性果肿瘤细胞例低6％BiliSeq法检测致病基组改变然发现视技术限制控制BiliSeq敏感性益特特定基前手术切材料研究证实低度胆道发育良良性胆病变KRAS突变52增加BiliSeqKRAS突变敏感性导致少高级胆道发育良特异性降低样重强调涉胆部分恶性肿瘤包含未测试分析基组改变例染色质重塑基（ARID1A）FGFR2融合基突变存高达20％肝胆癌中BiliSeq敏感性通靶扩增改善富集技术扩展基组研究趣初步观察结果BiliSeqPSC患者中少高度胆道发育良病理评估间敏感性存显着差异 PSC种身免疫疾病胆癌终身发病率相关范围6％36％5356PSC诊断前2年胆癌风险高提示早期机会窗口然炎症性狭窄背景中胆癌特难通病理评估进行取样挑战进行诊断然队列中PSC患者数量相较少病理评估敏感性仅8％
相BiliSeq少高度胆道发育良敏感性达83％提供令信服证进步探索改善高危患者群床结果潜力NGS测试外床开发种辅助技术评估胆狭窄例数字图分析单基测序染色体体性焦点FISH辅助研究中色FISH已成许学术机构十年采工具15类似BiliSeq色FISH前提发现涉胆发育良恶性肿瘤常常高频率特征数字染色体异常然年中该测试通常实现35％60％灵敏度技术改进13 15 18色FISH价格昂贵劳动强度容易出现观解释错误需量技术专业知识事实色FISH解释需验丰富病理学家需样进行成形态学评估确保正评估感兴趣皮细胞染色体异常然没BiliSeq色FISH进行正式较Dudley等[6]发现NGS检测色FISH具更高敏感性奇怪NGS测试检测基中拷贝数改变单核苷酸变体外着成降低单次批量处理样力NGS测试已广泛应学术非学术机构评估胆标时NGS测试色FISH更优选选择证明BiliSeqERCP获胆道标床行性NGS检测进步应非侵入性标类型（胆汁血清（循环肿瘤DNA外泌体））奠定基础5861外早期检测广泛采NGS技术推动力实体肿瘤基分型出现二次涉胆系统恶性肿瘤通常顽固前标准化疗方案限功效相关线二线化疗复发进展中部分肿瘤进行全面基组分析已确定作特定治疗反应靶预测标志物改变[26]例已报道肝ERBB2扩增胆癌肺门周围远端胆癌胆囊腺癌患病率分5％17％19％288例ERBB2扩增HER2 neu度表达胆囊腺癌患者中Javle等[46]报道3例患胆囊癌病情稳定4例部分反应1例靶治疗（曲妥珠单抗曲妥珠单抗帕妥珠单抗）完全反应值注意8名患者中5名接受靶治疗前接受线化疗化学放疗研究中BiliSeq测试确定两名ERBB2扩增患者：名肝胆癌名肺门周围胆癌两名患者均接受曲妥珠单抗联合标准线化疗（吉西滨铂）两者均表现出测量放射学反应血清CA199正常化两者目前均存活良然认识标准化学疗法处似理认化疗方案中纳入曲妥珠单抗负责
两患者中观察显着延长治疗效果应该强调诊断时识靶改变助性化治疗方法外ERBB2BiliSeq检测唯赋予抗癌治疗易感性基组改变承认项研究存局限性量胆标进行分析仅66％患者获访诊断病理学然数涉胆系统恶性肿瘤患者通常出现时具切疾病者良手术候选者外确保NGS测试足够DNA病理评估样单独胆样进行BiliSeq测试该协议解释病例评估BiliSeq测试间病例致结果外研究未涉基NGS分子检测胆狭窄评估相结合佳基组方法限度减少重复采样需通常初始ERCP时具潜恶性病变患者进行BiliSeq BiliSeq阳性结果加速适手术肿瘤学专科医生转诊程 BiliSeq阴性结果阴性病理评估提供额外保证诊断方式均未达> 95％敏感性基阴性BiliSeq少患者完全免监测色FISH投资者采类似方法样重认识胆镜检查新进展EUSFNA增加会改善恶性肿瘤检测然研究中少数患者通胆镜检查进行评估发现类似诊断性特征报道EUSFNA应胆狭窄特远端狭窄传统ERCP方法相增强组织采集然研究队列中两种技术进行评估患者未进行胆镜检查胆造影显示统计学显着敏感性差异事实BiliSeq单独ERCPEUSFNA产生更高敏感性种方法组合检测远端恶性狭窄敏感性提高少90％靶基组改变定义基数研究集合进行前瞻性床试验前定药物特定基组改变真实床效未知然够通基组改变（例ERBB2扩增）特异性抗癌疗法（例曲妥珠单抗）配证明床益处少轶事证总报告前瞻性研究检验基NGS分子（BiliSeq）检测评估胆狭窄中作结果支持BiliSeq胆标标准病理评估相结合床效外BiliSeq具识靶基组改变潜力特定化疗方案患者进行分层然未研究需探索BiliSeq类似基NGS检测方法整合胆狭窄患者前监测理指南中
文档香网(httpswwwxiangdangnet)户传
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代测序镜逆行胰胆造影（ERCP）获胆道标相结合改善恶性胆狭窄患者检测理
目：
成血清CA199病理评估改善鉴良性恶性胆狭窄然诊断难题新代测序（NGS）新发展癌症早期检测理开辟新机会迄止尚未严格应胆道标
设计：
前瞻性评估28基NGS组（BiliSeq）镜逆行胰胆造影术 获胆狭窄患者胆道标评估血清ca199病理评估BiliSeq诊断性252例患者（57次实验195次验证）进行346例胆道标评估
结果：
BiliSeq恶性狭窄敏感性特异性分73％100％相升高血清ca199病理评估敏感性分76％48％特异性分69％99％BiliSeq病理评估组合敏感性提高83％保持99％特异性 BiliSeq胆道刷病理评估敏感性35％提高77％胆道活检敏感性52％提高83％原发性硬化性胆炎（PSc）患者中病理评估相BiliSeq敏感性83％病理评估敏感性8％20名（8％）患者中鉴定出治疗相关基组改变两名ERBB2扩增胆癌患者接受基曲妥珠单抗治疗方案具测量床放射学反应
结：BiliSeq联合胆道标病理评估增加恶性狭窄检出率特PSc患者外BiliSeq确定患者进行特定抗癌治疗分层改变
介绍：
涉胆狭窄代表组异质性良性恶性疾病1良性胆狭窄原发性硬化性胆炎（PSC）IgG4相关性硬化性胆炎医源性损伤感染等太常见病恶性原包括涉胰胆壶腹壶腹肝脏少转移性癌症癌然区分良性恶性胆狭窄挑战性赖床检查生化检测（血清CA199）放射摄影成镜手术病理评估学科方法考虑某良性狭窄病恶性肿瘤诱发素种区分更艰巨例般群相PSC胆癌风险增加400倍相关镜逆行胰胆造影术（ERCP）通定义形态学成特征疾病受累程度评估胆狭窄中发挥关键作然透视期间没区分良性恶性特征性特征外直接胆镜检查分级准确观察者致性差ERCP期间胆刷镊子活组织检查病理学确认首选方法然检测恶性肿瘤敏感性8％67％间改进恶性条件检测开发辅助技术包括数字图分析KRAS突变检测荧光原位杂交然检测灵敏度介14％60％间考虑病理评估低敏感性辅助研究患者常接受种ERCP手术诊断奇怪恶性狭窄治疗决策通常会延迟数周数月患者面疾病进展风险相反良性胆狭窄误诊导致必手术切报道达15％疑似恶性肿瘤接受手术患者患良性疾病种情况令担忧手术切相较高发病率死亡率关更需创新术前方法改善良性恶性狭窄患者分层年中理解肿瘤基组景观方面取显着进展次涉胆系统全外显子组全基组测序研究报道相少数致癌基肿瘤抑制基复发性基组改变KRASTP53CDKN2ASMAD4外基组变异部分作ATMERBB2赋予特定抗癌疗法易感性时新型分子诊断学引入术前标研究开辟新机会35 36胆标通常少量诊断材料特征异质细胞群组成模糊模仿恶性肿瘤处理分子检测检测样中例突变细胞高度敏感新代测序（NGS）高分析灵敏度基分析相结合评估胆狭窄吸引力选择项研究中开发种高灵敏度靶NGS测定称BiliSeq28种基基通常涉胆系统恶性肿瘤中发生突变扩增缺失该测试床实验室改进修正案（CLIA） 认证美国病理学家学院（CAP）认床实验室ERCP获胆刷活组织检查细胞学涂片载玻片酒精固定剂（例CytoLyt）福尔马林固定paraffin嵌入式（FFPE）组织中提取DNA会降低整体产量质量提交专门胆刷洗活组织检查获常规标进行病理学评估直接进行BiliSeq检测目标前瞻性评估群患者BiliSeq检测：（1）确定检测恶性狭窄准确性（2）较作诊断方式辅助手段表现（3）评估胆标中检测基组改变时患者理影响
患者群：
患者群匹兹堡医学中心（UPMC）标准ERCP2014年9月2016年4月期间胆狭窄患者前瞻性收集57名患者胆道标训练队列匹兹堡学资助病理学系完成培训队列2016年9月2018年8月期间累计195名患者进行验证Pittsburgh学精准医学研究提供部分资助总收集163胆道刷172胆道活检组织进行病理学评估收集160刷牙135活组织检查BiliSeq测试胆标提交UPMC解剖病理学实验室进行常规细胞病理学病理学评估UPMC分子基组病理学（MGP）实验室ERCP程序2448时进行BiliSeq检测医疗记录进行审查记录患者口统计学床表现ERCP发现发镜超声（EUS）EUS细针穿刺（FNA）血清CA199水相应刷牙病理诊断活组织检查重复ERCP手术进行单独分析产生24胆道刷29胆道活检病理评估24刷牙27活组织检查
BiliSeq测试狭窄病基手术切样活检标（尸检开腹腹腔镜手术切活组织检查皮穿刺ERCP获性胆道活检）诊断病理学（n 145）访12月床标准（n 75）报道胆汁刷特异性<100％刷牙标病理评估结果视诊断病理学外ERCP阴性获活检认良性病支持果重复成ERCP访12月时记录先前导异常分辨率稳定性狭窄指定良性胆病相恶性肿瘤床诊断定义没急性胆病情况放射相成质量访12月床放射学进展床放射性死亡床诊断图形确定涉胆恶性肿瘤手术切活检标根标准组织形态学标准进行诊断线补充表1中详细描述诊断床访信息包括位患者访方法标收集样ERCP程中获包括细胞学刷镊子活组织检查两者细胞学刷子狭窄部位采集次复运动样品刷子细胞病理学检查置15mL ThinPrep CytoLyt溶液（HologicMarlboroughMassachusettsUSA）中24时转移样品处理单独刷子BiliSeq测试放入含基洗涤剂DNA裂解缓液收集瓶中然收集瓶24时运送UPMC MGP实验室进行相应处理类似方法镊子生物活检单独活组织检查提交病理检查BiliSeq测试测试需标细胞数标刷牙活组织检查相
biliseq测试：
NGS作床护理部分前瞻性进行UPMC MGP实验室10天完成该实验室通CLIA认证CAP认证MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒（RocheIndianapolisIndianaUSA）Compact MagNA Pure（Roche）刷洗活检样品进行类似基组DNA分离提交刷牙活检标情况两样DNA合续分析dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher ScientificWalthamMassachusettsUSA）Qubit 20荧光计定量提取DNA基扩增靶NGS基基组区域引物（https： mgpupmccom Applications mgp Content OncoSeq_Hotspotspdf）进行：AKT1ALKATMBRAF
前述CDKN2ACTNNB1EGFRERBB2ERBB4FGFR1FGFR2FGFR3GNA11GNAQGNASHRASIDH1IDH2KITKRASMETNRASPDGFRAPIK3CAPTENSMAD4TP53VHL 39扩增子进行条形码化纯化特定衔接子连接2200 TapeStation（Agilent TechnologiesSanta ClaraCaliforniaUSA）进行DNA量质量检查 Ion One Touch 2One Touch ES制备丰富模板通半导体芯片离子球粒子进行测试根制造商说明书（Thermo Fisher Scientific）离子质子系统进行规模行测序Torrent Suite软件V342进行分析点突变插入缺失拷贝数改变 根2017年分子病理学协会（AMP）美国床肿瘤学会（ASCO）美国病理学家学会（CAP）联合识指南基层次系统解释癌症中序列变异变体进行优先排序40报告第级第二级第三级变体Tier ITier II变体续分析符合I级Tier II变体基组改变存认种积极BiliSeq结果BiliSeq结果确定缺乏第级第二级变体检测检测限3％突变等位基频率（AF）测试覆盖深度500？ 鉴定突变基突变等位基野生型等位基读数计算AF百分形式报告前述进行拷贝数变异分析基扩增前述存≥6拷贝变体荧光原位杂交（FISH）分析验证
靶基组改变分类床相关基组改变定义目前市场注册床试验中抗癌药物靶改变报告激酶抑制剂靶基组改变（野生型KRASNRASHRAS基组改变情况）包括：ALKBRAFEGFRERBB2FGFR1FGFR2FGFR3MET43 46 ATM中基组改变针基铂方案聚（ADP核糖）聚合酶抑制47外已开发出体IDH1IDH2突变具高度特异性药理学抑制剂
统计分析研究中训练组样量估计功效计算基机构中胆狭窄60％恶性肿瘤患病率ERCP获标病理评估检测恶性肿瘤相应40％敏感性少50名患者样量产生> 80％功率α005Fisher精确检验二分类变量较评估突变状态差异统计分析训练组Youden指数生成接收器操作特征（ROC）曲线较生物标记物性建立截止水选择终截止值通梯形方法计算曲线面积（AUC）化然考虑生物学原理模型简单性确诊诊断病理学病例标准2×2列联表计算灵敏度特异性非说明重复测试计算体敏感性特异性生物标志物SPSS Statistical软件V25（IBMArmonkNew YorkUSA）进行统计学分析统计学显着性定义p值<005
结果：
血清CA199表现病理评估培训验证队列中biliseq测试57名接受ERCP治疗胆狭窄患者培训队列前瞻性进行生物标志物分析总结表1线补充数表1中病理评估BiliSeq测试血清CA199研究胆刷活组织检查57名（98％）患者中56名进行中名患者床表现时未进行CA199测量 考虑缺乏识CA199截止值作恶性狭窄标志物进行CA199水探索性研究（线补充图1）通ROC曲线分析血清CA199区分恶性良性狭窄AUC0727Youden指数选择≥45U mL阈值时升高CA199检测恶性敏感性62％特异性77％（表2）ERCP期间获病理学评估标包括22名（39％）患者胆道刷22名（39％）患者胆道活检13名（22％）患者胆道刷活组织检查腺癌少疑病理诊断恶性肿瘤敏感性特异性分相关46％100％提交配独立胆道刷活组织检查样BiliSeq测试然时进行病理评估13例刷牙活检标患者2名患者进行配刷牙获BiliSeq检测活检标剩余11名患者提交相应刷牙标未提交活检标BiliSeq测试总57名患者59胆标BiliSeq评估基组改变仅恶性狭窄中检测良性胆病变病例中存（图1） BiliSeq鉴定基组改变敏感性特异性分63％100％前瞻性收集验证队列195名患者组成中163名（84％）患者接受访（线补充数表1）出现时163名（88％）患者中144名患者测量血清CA199提交病理评估标包括49名（30％）患者胆道刷57名（35％）患者胆道活检57名（35％）患者胆道刷活组织检查提交成独立刷牙活检标BiliSeq测试时进行病理评估57例刷牙活检标患者27例（47％）单独刷牙活检标进行BiliSeq检测剩余30名患者中分24名患者6名患者获相应刷牙活组织检查BiliSeq测试163名患者190胆标进行BiliSeq测试根≥44U mL界值验证组血清CA199少高级胆道发育良敏感性81％特异性65％（表2）训练组相似病理评估BiliSeq测试表现分49％98％76％100％敏感性特异性相关包括220名访患者训练组验证组进行总体分析显示血清CA199病理评估BiliSeq检测敏感性特异性分76％69％48％99％73％100％病理评估BiliSeq测试组合两种测定灵敏度提高83％保持99％高特异性病理学评估BiliSeq测试中加入血清CA199进步敏感性提高95％特异性降低68％胆标亚型分析PsC历史重复ErCP生物标志物检测132胆刷114胆道活检组配病理评估BiliSeq检测（表3）胆道刷胆道活检病理评估敏感性特异性分35％98％52％100％相胆汁刷胆道活检BiliSeq测试分71％75％更高灵敏度相关特异性100％114例胆道活检中28例通数字胆镜检查获余标通胆造影获没统计学意义
胆镜引导胆造影引导胆道活检中确定敏感性特异性差异（线补充表2）29名患者提交病理评估BiliSeq测试匹配胆道刷胆道活检标病例刷洗活组织检查病理评估BiliSeq刷牙活组织检查测试敏感性分26％39％70％78％特异性100％ EUSFNA改善恶性远端胆狭窄诊断总141例患者接受远端胆狭窄发EUS86例患者FNA进行61例患者61例发ERCPEUSFNA患者中基ERCP获胆道标EUSFNA标病理评估检测恶性远端胆狭窄敏感性特异性分59％95％58分％100％相BiliSeq测试产生敏感性76％特异性100％外获ERCP标BiliSeq检测病理评估相结合恶性肿瘤敏感性90％特异性95％加入EUSFNA评估敏感性增加93％特异性保持95％ 220例（17％）患者中37例PSC记录该队列包括12胆狭窄少高级胆道发育良25胆狭窄伴良性胆病根美国肝病研究协会（AASLD）指南血清CA199> 129 U mL高风险群中疑似胆癌种标志物50基129 U mL界值血清CA199少高级胆汁敏感性67％特异性84％发育良病理评估敏感性仅8％特异性100％相BiliSeq测试灵敏度特异性分83％100％血清CA199BiliSeq测试相结合灵敏度提高92％特异性降低84％BiliSeq测试添加病理学评估未改善单独BiliSeq敏感性220名（9％）患者中20名（线补充表3）进行病理评估Biliseq测试重复ERCP具胆道刷活组织检查16名患者重复该程次两名患者重复该程两次两名患者重复三次访基础15名患者患严重狭窄5名患者患良性狭窄15例恶性狭窄患者中8例患者BiliSeq检测初始重复胆基组改变然初始胆道刷活组织检查相应病理评估恶性肿瘤阴性事实8例恶性狭窄中5例未出现少疑恶性肿瘤术前诊断剩7名患者通BiliSeq测试两名患者进行病理评估检测基组改变（阳性）重复生物标志物测试恶性病理学阴性BiliSeq两名患者阳性两种诊断方式名患者均阴性重复ERCP包含略微增加病理评估敏感性特异性BiliSeq测试组合两种测定分51％99％75％100％87％99％成ErCP获胆标诊断病理标较biliseq测试诊断病理学材料220名（66％）患者中145名包括134名恶性肿瘤11名良性胆病134例（40％）恶性肿瘤中54例（线补充表4）诊断病理学标进行BiliSeq测试54例患者中检测基组改变中包括12例ERCP获胆标标BiliSeq基组改变呈阴性剩余42肿瘤中4病例基组谱中包括ERCP获胆标BiliSeq检测基组改变治疗相关基组改变治疗数根先前报道行目标化疗反应预测标志物ERCP获胆标进行BiliSeq检测确定150例（13％）癌症中20例治疗相关基组改变（线补充图2） ）涉受体酪氨酸激酶（RTK） Ras 丝裂原活化蛋白（MAP）激酶信号通路基改变包括ERBB2（n 6）MET（n 4）ALK（n 2）FGFR2数情况（n 1365％）检测（n 3）FGFR3（n 2）ATM（n 2）IDH1（n 1）IDH2（n 2）中发现行改变ERBB2改变恶性肿瘤中两名患者（腺癌具ERBB2拷贝数增加）接受针HER2 neu靶化疗单独标准化疗第位患者名老年妇女患黄疸腹痛加剧周肝功检查升高血清CA19955 U mLCT扫描显示胆结石肝胆扩张 ERCP显示肝胆狭窄病理评估BiliSeq测试胆道刷病理评估显示高度典型皮细胞疑腺癌然BiliSeq测试检测ERBB2拷贝数增加TP53突变（pC242fs * 5c723delC）2周三期CT扫描显示段4B 5中21cm转移性肝脏病变（图2A）血清CA1994224U mL重复ERCP确认恶性肿瘤胆刷活组织检查均侵袭性中分化腺癌床认肝胆细胞癌患者开始吉西滨铂曲妥珠单抗治疗3月血清CA199降14 U mL转移性肝脏病变降06 cm外访ERCP指出患者胆狭窄改善（线补充图3）诊断年患者目前活血清CA199继续处正常范围转移性病变尺寸03cm（图2B）第二名患者（线补充表1患者166）名中年男性患黄疸腹痛肝功检查升高血清CA199升高2383 U mL肺门周围胆增厚关MRCP肝门部严重MRCPERCP胆刷确定铋IIIa狭窄活检腺癌阳性患者相应BiliSeq测试显示ERBB2拷贝数增加TP53CDKN2A拷贝数丢失该患者转诊进行肝移植进步检查发现78段26 cm转移灶（图2C）血清CA1997959 U mL时患者开始吉西滨铂曲妥珠单抗治疗床周围胆癌 3月患者血清CA199标准化94 U mL诊断8月患者目前活血清CA199继续处正常范围转移病灶尺寸降07cm（图2D）
讨：横断面成血清研究镜技术病理评估方面改进良性恶性胆狭窄间区然诊断难题目前研究中开发独立床验证靶NGS检测评估胆狭窄发现靶NGS检测BiliSeq单独病理评估具更高敏感性（73％48％）更高特异性（100％99％）检测少涉胆高度胆道发育良外两种测试（BiliSeq病理评估）组合单独测试（83％）具更高灵敏度时保持高特异性（99％）迄止研究已研究靶NGS胆狭窄中应Bankov等发表项BiliSeq类似设计NGS检测结果采回顾性队列分析16例确定胆活检胆癌患者访作者未评估胆道刷洗标获NGS DNAFFPE组织块中提取该作者承认FFPE组织低输入低质量DNA续分析需DNA富集技术然良性组未较测定灵敏度81％BiliSeq相 Dudley等报道胆标NGS检测更全面评估作者评估73胆8胰刷牙标队列Bankov等相反研究队列包括胆生物学外获专门DNA分离刷CytoLyt保存标中提取DNA酒精固定导致DNA降解73（11％）刷牙标中8未通NGS测试出意料研究中没胆道刷牙活检标未通BiliSeq测试剩65胆道刷牙标中Dudley等报道敏感性68％特异性97％优病理评估然作者确定假阳性结果种情况NGS检测访时间清楚根作者排胆系统发育良性BiliSeq未发现假阳性病例重复检测37例（25％）假阴性病例确定假阴性NGS结果原37种恶性肿瘤中12种诊断病理材料进行BiliSeq检测分子组中检测28基中少基组改变考虑胆标采集技术困难已知采样失败发生狭窄采样充分解释者低标肿瘤细胞性素NGS测定低检测限突变等位基约3％者杂合突变例KRAS6％肿瘤细胞性果肿瘤细胞例低6％BiliSeq法检测致病基组改变然发现视技术限制控制BiliSeq敏感性益特特定基前手术切材料研究证实低度胆道发育良良性胆病变KRAS突变52增加BiliSeqKRAS突变敏感性导致少高级胆道发育良特异性降低样重强调涉胆部分恶性肿瘤包含未测试分析基组改变例染色质重塑基（ARID1A）FGFR2融合基突变存高达20％肝胆癌中BiliSeq敏感性通靶扩增改善富集技术扩展基组研究趣初步观察结果BiliSeqPSC患者中少高度胆道发育良病理评估间敏感性存显着差异 PSC种身免疫疾病胆癌终身发病率相关范围6％36％5356PSC诊断前2年胆癌风险高提示早期机会窗口然炎症性狭窄背景中胆癌特难通病理评估进行取样挑战进行诊断然队列中PSC患者数量相较少病理评估敏感性仅8％
相BiliSeq少高度胆道发育良敏感性达83％提供令信服证进步探索改善高危患者群床结果潜力NGS测试外床开发种辅助技术评估胆狭窄例数字图分析单基测序染色体体性焦点FISH辅助研究中色FISH已成许学术机构十年采工具15类似BiliSeq色FISH前提发现涉胆发育良恶性肿瘤常常高频率特征数字染色体异常然年中该测试通常实现35％60％灵敏度技术改进13 15 18色FISH价格昂贵劳动强度容易出现观解释错误需量技术专业知识事实色FISH解释需验丰富病理学家需样进行成形态学评估确保正评估感兴趣皮细胞染色体异常然没BiliSeq色FISH进行正式较Dudley等[6]发现NGS检测色FISH具更高敏感性奇怪NGS测试检测基中拷贝数改变单核苷酸变体外着成降低单次批量处理样力NGS测试已广泛应学术非学术机构评估胆标时NGS测试色FISH更优选选择证明BiliSeqERCP获胆道标床行性NGS检测进步应非侵入性标类型（胆汁血清（循环肿瘤DNA外泌体））奠定基础5861外早期检测广泛采NGS技术推动力实体肿瘤基分型出现二次涉胆系统恶性肿瘤通常顽固前标准化疗方案限功效相关线二线化疗复发进展中部分肿瘤进行全面基组分析已确定作特定治疗反应靶预测标志物改变[26]例已报道肝ERBB2扩增胆癌肺门周围远端胆癌胆囊腺癌患病率分5％17％19％288例ERBB2扩增HER2 neu度表达胆囊腺癌患者中Javle等[46]报道3例患胆囊癌病情稳定4例部分反应1例靶治疗（曲妥珠单抗曲妥珠单抗帕妥珠单抗）完全反应值注意8名患者中5名接受靶治疗前接受线化疗化学放疗研究中BiliSeq测试确定两名ERBB2扩增患者：名肝胆癌名肺门周围胆癌两名患者均接受曲妥珠单抗联合标准线化疗（吉西滨铂）两者均表现出测量放射学反应血清CA199正常化两者目前均存活良然认识标准化学疗法处似理认化疗方案中纳入曲妥珠单抗负责
两患者中观察显着延长治疗效果应该强调诊断时识靶改变助性化治疗方法外ERBB2BiliSeq检测唯赋予抗癌治疗易感性基组改变承认项研究存局限性量胆标进行分析仅66％患者获访诊断病理学然数涉胆系统恶性肿瘤患者通常出现时具切疾病者良手术候选者外确保NGS测试足够DNA病理评估样单独胆样进行BiliSeq测试该协议解释病例评估BiliSeq测试间病例致结果外研究未涉基NGS分子检测胆狭窄评估相结合佳基组方法限度减少重复采样需通常初始ERCP时具潜恶性病变患者进行BiliSeq BiliSeq阳性结果加速适手术肿瘤学专科医生转诊程 BiliSeq阴性结果阴性病理评估提供额外保证诊断方式均未达> 95％敏感性基阴性BiliSeq少患者完全免监测色FISH投资者采类似方法样重认识胆镜检查新进展EUSFNA增加会改善恶性肿瘤检测然研究中少数患者通胆镜检查进行评估发现类似诊断性特征报道EUSFNA应胆狭窄特远端狭窄传统ERCP方法相增强组织采集然研究队列中两种技术进行评估患者未进行胆镜检查胆造影显示统计学显着敏感性差异事实BiliSeq单独ERCPEUSFNA产生更高敏感性种方法组合检测远端恶性狭窄敏感性提高少90％靶基组改变定义基数研究集合进行前瞻性床试验前定药物特定基组改变真实床效未知然够通基组改变（例ERBB2扩增）特异性抗癌疗法（例曲妥珠单抗）配证明床益处少轶事证总报告前瞻性研究检验基NGS分子（BiliSeq）检测评估胆狭窄中作结果支持BiliSeq胆标标准病理评估相结合床效外BiliSeq具识靶基组改变潜力特定化疗方案患者进行分层然未研究需探索BiliSeq类似基NGS检测方法整合胆狭窄患者前监测理指南中
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