摘
ε聚赖氨酸种天然食品防腐剂工合成化学防腐剂相抑菌效果相差提高抑菌活性具重意义文利紫外分光光度扫描分析ε聚赖氨酸呈电荷生物聚合物相互作利孔法分析微量稀释法CTC法分析电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响紫外见分光光谱显示ε聚赖氨酸负电荷聚合物相互作带正电乳酸链球菌素硫酸鱼精蛋白提高ε聚赖氨酸抑菌活性呈负电果胶卡拉胶羧甲基纤维素钠（CMC NA）抑菌活性定抑制作未带电荷葡聚糖影响较研究ε聚赖氨酸食品防腐中提供定参考
关键词：ε聚赖氨酸生物聚合物抑菌活性肠杆菌枯草杆菌
Abstract
ε polylysine is a natural food preservative but its bacteriostatic effect is relatively poor compared with that of synthetic chemical preservatives In this paper the interaction between εpolylysine and the biopolymer with different charge was analyzed by ultraviolet spectrophotometry and the effects of different charge biopolymers on the bacteriostatic activity of εpolylysine were analyzed by drilling method microdilution method and CTC method Uvvis spectra show that εpolylysine interacts with negatively charged polymers The bacteriostatic activity of εpolylysine was enhanced by positive streptococcus lactis and protamine sulfate The e negatively charged pectin carrageenan and sodium carboxymethyl cellulose (CMC NA) have a certain inhibitory effect on its antibacterial activity while the uncharged glucan has less effect This study can provide a reference for εpolylysine in food preservation
Key words：εPLbiopolymersAntibacterial activity ofE coliBacillus subtilis
目 录
1 引 言 5
11 食品防腐剂 5
12 天然防腐剂研究现状 5
13 ε聚赖氨酸研究综述 6
131 源性质 6
132 抑菌机制 6
133 ε聚赖氨酸前景 7
14 目意义研究容 7
2 材料方法 8
21 材料试剂仪器 8
211材料试剂 8
212 仪器 8
213 供试菌种 8
214 培养液培养基 8
215 抑菌剂配制 8
22 方法 9
221 菌种活化 9
222 培养 9
223 单素实验 9
224 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 9
225 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物相互作研究 9
226ε聚赖氨酸电荷生物聚合物抑菌浓度测定 10
227 CTC活性染色 10
3 结果分析 11
31 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 11
311阳离子ε聚赖氨酸抑菌活性影响 11
312 阴离子聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 12
313 中性生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 13
32 抑菌浓度测定 17
33 CTC活性染色 19
4 讨结 21
参 考 文 献 22
致 谢 24
电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
1 引 言
11 食品防腐剂
食品腐败变质直全社会关注重问题现社会应食品腐败变质问题广泛食品添防腐剂应食品腐败变质问题食品防腐剂效抑制食品腐败延长食品储藏期食品防腐剂量极少效果显著食品身风味色泽营养明显影响甚食品影响忽略计中现社会应广泛工合成食品防腐剂国标中规定安全添加量中会体造成影响合法量工合成食品防腐剂毒素会体中堆积体造成法避免伤害天然防腐剂体没顾虑抑菌效果理想防腐效果突出等原法广泛天然食品添加剂系列缺点已然成食品科学研究工作者工作重点容
12 天然防腐剂研究现状
天然防腐剂分三类：植物源动物源微生物源[22]
微生物源天然防腐剂现社会理想天然食品防腐剂具毒安全高效副作优点符合未食品防腐剂发展求食品行业越越广泛ε聚赖氨酸曲酸乳酸链球菌等ε聚赖氨酸赖氨酸残基通羧基氨基形成酰胺键连接成短肽带负电荷阴离子较强静电作2530赖氨酸残基具抑菌谱广水溶性安全性高热稳定性抑菌 pH 范围广等优点
13 ε聚赖氨酸研究综述
131 源性质
1977年日学者Shima[3]等微生物中筛选Dargendorff Positive物质时观察株稳定量产生DP物质放线菌白色链霉菌Streptomyces albulus现培养液滤种德拉根道夫实验呈阳性化合物该物质证实种单赖氨酸α羟基ε氨基形成酰胺键连接成聚氨基酸[4]20～30赖氨酸单体ε聚赖氨酸 (εpolyLlysineεPL)
ε聚赖氨酸种溶水微溶乙醇肽物质种重生物碱生物降解物理性质青黄色通常呈粉末状具较强湿特性空间结构呈直链状赖氨酸组成具高热稳定性杀菌力较强水溶性热稳定性pH值产生影响熔点固定般温度高250℃时软化分解ε聚赖氨酸抑菌活性受分子量影响抑菌活性佳分子量36004300分子量低1300时失抑菌活性红外光谱分析反映出ε聚赖氨酸强吸收峰值约1680～1640cm 115801520cm1[6]
132 抑菌机制
ε聚赖氨酸抑菌效率高低浓度时抑菌活性ε聚赖氨酸抑菌机制表现方面（1）作细胞壁细胞膜系统细胞膜形成孔道导致分子物质渗出细胞外液渗透压升高细胞物质合成受阻细胞膜破裂时分子物质溢出终导致细胞死亡起抑菌防腐作[7]（2）作遗传物质改变遗传性状（3）作酶者功蛋白影响蛋白质合成正常生理代谢功化学组成体必需氨基酸L赖氨酸构成肽消化变成单赖氨酸成体营养强化剂聚赖氨酸作食品防腐剂具毒副作安全性高特点盐酸柠檬酸苹果酸甘氨酸高级脂肪甘油酯等合具增效作遇酸性糖磷酸盐盐酸盐等结合活性降低时ε聚赖氨酸具定抗噬菌体力[9]
刘慧[10]等研究表明ε聚赖氨酸革兰氏阳性微球菌保加利亚乳杆菌嗜热链球菌革兰氏阴性肠杆菌沙门氏菌酵母菌明显抑制效果ε聚赖氨酸单独时革兰氏阴性菌效果明显醋酸复合枯草芽胞杆菌明显抑制作高温处理ε聚赖氨酸微球菌抑菌活性[7]显示ε聚赖氨酸具良热稳定性ε聚赖氨酸中性微酸性环境中较强抑菌性酸性碱性条件抑菌效果明显[11]
133 ε聚赖氨酸前景
民生活水断提高食品求更高：更样化更新鲜更营养更健康尤食品添加剂防腐剂求越越高[23]国食品防腐剂年直化学防腐剂天然食品防腐剂少数种ε聚赖氨酸传统化学合成防腐剂种天然防腐剂添加ε聚赖氨酸加工食品中够达防腐抑菌目ε聚赖氨酸会影响食品身风味时具安全性ε聚赖氨酸广泛应食品加工防腐[16][17][19][20][21]ε聚赖氨酸2003年10月美国食品药物理局批准安全食品保藏剂[15]日食品加工行业ε聚赖氨酸已作种食品防腐剂进行生产国2014年批准ε聚赖氨酸作种食品防腐剂添加食品保鲜
14 目意义研究容
项目革兰氏阴性菌肠杆菌阳性菌枯草芽孢杆菌指示菌采琼脂扩散法研究电荷聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响紫外见光扫描光谱分析ε聚赖氨酸带电生物聚合物96孔板测定ε聚赖氨酸抑菌浓度混合物抑菌浓度CTC活性染色测定抑菌效果ε聚赖氨酸食品中科学应提供定科学
2 材料方法
21 材料试剂仪器
211材料试剂
ε聚赖氨酸果胶卡拉胶葡聚糖溶菌酶硫酸鱼精蛋白
212 仪器
仪器
型号
生产厂家
恒温培养箱
超净工作台
全动高压灭菌锅
电热鼓风干燥箱
恒温培养摇床
电子天
DHP9272A
SWCJ2D
YXQSG46280S
DHG9070A
NRY2010C
YP802N
海飞越实验仪器限公司
苏州净化设备限公司
海博讯实业限公司
海飞越实验仪器限公司
海南荣实验设备限公司
海精密科学仪器限公司
213 供试菌种
革兰氏阳性菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
革兰氏阴性菌种
肠杆菌（Escherichia coli)
214 培养液培养基
培养基
操作步骤
营养琼脂
牛肉膏 1g酵母膏 2g蛋白胨 5gNaCL 5g琼脂15g加水定容1000ml调pH74 121℃高压灭菌15min备
营养肉汤
蛋白胨10g牛肉膏3gNaCL 5g加水定容1000ml分装30ml 121℃高压灭菌15min备
215 抑菌剂配制
2 ε聚赖氨酸：称取01克ε聚赖氨酸5mL菌水中溶解
1果胶：称取01克果胶10ml菌水中加热溶解
1葡聚糖称取01克葡聚糖10ml菌水中溶解
4鱼精蛋白：称取04克鱼精蛋白10ml菌水中溶解
2溶菌酶：称取02克溶菌酶10ml菌水中溶解
02卡拉胶称取02克卡拉胶100ml菌水中加热溶解
22 方法
221 菌种活化
超净工作台中接种环划线接种37℃培养24h活化活化菌种接种营养肉汤中200rpm摇床培养16h
222 培养
活化菌种接种装30mL营养肉汤150mL三角瓶37℃培养箱中培养24时
223 单素实验
超净工作台中取菌液（肠杆菌枯草芽孢杆菌）加入培养皿制加入约20ml营养琼脂加入1ml菌液菌液浓度约1×1037mm孔器孔注入ε聚赖氨酸测试物：ε聚赖氨酸浓度005成分浓度分0050101502025设置空白组37℃恒温箱培养24h测量抑菌圈
224 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
枯草芽孢杆菌板中加入果胶卡拉胶葡聚糖鱼精蛋白溶菌酶ε聚赖氨酸复合物例浓度223进行指示菌肠杆菌方法
225 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物相互作研究
利紫外见分光光度计进行波长扫描蒸馏水作分记录200nm500nm吸光度值扫描02mgml ε聚赖氨酸分02 mgml物质混合测试物
226 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物抑菌浓度测定
利96孔板ε聚赖氨酸电荷生物聚合物例混合聚赖氨酸组37℃恒温箱培养24h观察抑菌浓度
227 CTC活性染色
利CTC染色观察果胶葡聚糖鱼精蛋白溶菌酶卡拉胶浓度00010002000400080010002ε聚赖氨酸抑菌混合反应肠杆菌枯草杆菌菌液组ε聚赖氨酸例1100510110511混合做标记
溶液例混合观察抑菌活性利紫外见分光光度计进行波长扫描二甲基亚砜作记录470nm吸光度值
3 结果分析
31 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
311阳离子ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出添加溶菌酶提高ε聚赖氨酸抑菌活性
溶菌酶ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌性变高浓度逐渐增溶菌酶ε聚赖氨酸产生正促进作带阳离子溶菌酶样带阳离子ε聚赖氨酸产生反应抑菌效果提高明显：溶菌酶含量逐渐增加时抑菌圈增加明显ε聚赖氨酸单独抑制效果溶菌酶混合时增幅效果较着溶菌酶例增加抑菌效果增加明显
表1溶菌酶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
溶菌酶
2mm
2mm
3mm
4mm
6mm
混合
2mm
3mm
4mm
45mm
7mm
表2溶菌酶ε聚赖氨酸例抑制枯草杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
溶菌酶
2mm
2mm
3mm
4mm
6mm
混合
2mm
3mm
4mm
45mm
5mm
考察实验结果出硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌活性促进增强作硫酸鱼精蛋白带阳离子电细胞质膜形成孔洞破坏细菌生长ε聚赖氨酸形成协促进作抑菌活性增增加ε聚赖氨酸抑菌活性[13]
表3 硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
硫酸鱼精蛋白
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
15mm
15mm
15mm
2mm
表4 硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
硫酸鱼精蛋白
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
15mm
18mm
2mm
312 阴离子聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出例果胶ε聚赖氨酸活性抑制作浓度提高ε聚赖氨酸抑菌效果越发明显两者混合产生沉淀形成复合物光谱发生变化
ε聚赖氨酸革兰氏阴性菌具明显抑菌效果果胶酸性条件定抑菌性ε聚赖氨酸带负电荷物质具强静电作力生物膜良穿透力导致细胞死亡起抑菌防腐作果胶浓度提高ε聚赖氨酸抑菌活性定提高果胶含量进步提高ε聚赖氨酸抑菌活性逐渐降
表5 果胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
果胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
15mm
0mm
0mm
0mm
表6 果胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
果胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
0mm
0mm
0mm
0mm
考察实验结果出带阴性电卡拉胶ε聚赖氨酸例混合卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌活性定影响卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌活性抑制作卡拉胶ε聚赖氨酸混合现成沉淀卡拉胶粘性ε聚赖氨酸扩散困难含量越ε聚赖氨酸负面影响越
表7卡拉胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
卡拉胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
表8卡拉胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
卡拉胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
313 中性生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出葡聚糖ε聚赖氨酸抑菌活性定影响肠杆菌中影响明显枯草杆菌中着定影响影响明
表8葡聚糖ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
葡聚糖
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
1mm
15mm
16mm
表9葡聚糖ε聚赖氨酸例抑制枯草杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
葡聚糖
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
1mm
0mm
0mm
314 阳性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
311实验中出添加溶菌酶提高ε聚赖氨酸抑菌活性图31基紫外见扫描光谱出两者间定相互作
图31 溶菌酶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
实验311中出硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌活性促进增强作图32知两者混合物太变化两者未产生新聚合物
图32 鱼精蛋白ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
315 阴性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
312实验中出果胶ε聚赖氨酸活性抑制作两者混合产生沉淀形成复合物光谱发生明显变化
图33果胶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
卡拉胶ε聚赖氨酸混合反应现成沉淀产生复合物光谱明显变化卡拉胶ε聚赖氨酸混合现成沉淀ε聚赖氨酸扩散困难知含量越ε聚赖氨酸负面影响越
图34卡拉胶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
316 中性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
实验313中知葡聚糖ε聚赖氨酸抑菌活性定影响两者混合两者混合物紫外见分光扫描光谱图35知葡聚糖ε聚赖氨酸混合物光谱理值较差
图35葡聚糖ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
32 抑菌浓度测定
含浓度抑菌剂培养基制备 肉汤培养基加入96孔板孔中含浓度抑菌剂培养基制备 稀释00010002000300040005观察ε聚赖氨酸抑菌浓度抑菌浓度003ε聚赖氨酸带电荷聚合物1002100310041005102103104105混合菌浓约1×10337℃恒温培养24h
表1 ε聚赖氨酸枯草杆菌肠杆菌抑菌浓度
浓度
0001
0002
0003
0004
0005
枯草杆菌
++
+
肠杆菌
+
+
注 表中表示微生物生长+表示少量微生物生长+++++分表示微生物生长量
已知抑菌浓度ε聚赖氨酸（0003）1果胶1葡聚糖4鱼精蛋白2溶菌酶02卡拉胶1002100310041005102103104105混合浓度菌浓约1×10337℃恒温培养24h
表2 ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合肠杆菌抑菌浓度
例
εpl+葡聚糖
εpl+果胶
εpl+卡拉胶
εpl+溶菌酶
εpl+硫酸鱼精蛋白
1002
+
+
+
1003
1004
+
1005
+
102
++
+
103
++
++
104
+
+++
+++
105
+
+++
+++
表3 ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合枯草杆菌抑菌浓度
例
εpl+葡聚糖
εpl+果胶
εpl+卡拉胶
εpl+溶菌酶
εpl+硫酸鱼精蛋白
1002
+
+
1003
1004
1005
102
++
+
103
++
+
104
+
+++
+
105
++
+++
++
观察96孔板微生物生长情况ε聚赖氨酸（0003）葡聚糖（1）1002100310041005102103混合时抑菌效果明显葡聚糖浓度增加ε聚赖氨酸（0003）影响变ε聚赖氨酸（0003）抑菌效果变ε聚赖氨酸（0003）果胶（1）混合时ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌效果变差着混合例增加ε聚赖氨酸枯草杆菌抑菌效果效果明显变差ε聚赖氨酸（0003）卡拉胶（02）100310041005例混合ε聚赖氨酸抑菌效果明显着卡拉胶例增加抑菌效果明显变差ε聚赖氨酸（0003）溶菌酶（2）混合抑菌效果显著肠杆菌枯草芽孢杆菌生长ε聚赖氨酸（0003）硫酸鱼精蛋白（4）混合抑菌效果显著肠杆菌枯草芽孢杆菌生长
33 CTC活性染色
（1）菌悬液制备移液分取肠杆菌枯草杆菌菌液03mL离心中5000rmin离心5min弃清液加入菌水10mL搅拌均匀离心5min清液加菌水10mL充分混匀
（2）取15mL离心取03mL肠杆菌枯草芽孢杆菌菌液组取离心加002ε聚赖氨酸余五次加入测试物001果胶001葡聚糖004鱼精蛋白002溶菌酶002卡拉胶组002ε聚赖氨酸1100510110511混合做标记
（3）37℃恒温培养作1h加入3μL增强剂12μL染色剂混匀继续作30min5000rmin离心5min弃清液加入二甲基亚砜5mL混匀混合均匀5000rmin离心5min观察颜色变化
观察实验结果组果胶葡聚糖卡拉胶抑菌效果颜色深红色鱼精蛋白微抑菌效果红色ε聚赖氨酸溶菌酶明显抑菌效果淡红色例混合带阴离子果胶卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌效果明显抑制颜色变化红色微生物存活率较高带阳离子溶菌酶鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强颜色淡红色着例增加颜色色微生物存活率降低带中性电葡聚糖ε聚赖氨酸影响着例增加影响明显颜色淡红色橙色着例增加微生物存活率降低
36 CTC活性染色肠杆菌枯草芽孢杆菌活菌制剂微生物存活率
4 讨结
考察电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响利紫外见光扫描光谱分析ε聚赖氨酸带电生物聚合物阳离子肽相互作结：
果胶卡拉胶分ε聚赖氨酸混合形成沉淀溶菌酶ε聚赖氨酸产生聚合物光谱发生明显变化浓度例ε聚赖氨酸抑菌活性提高带电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响阳离子聚合物浓度提高ε聚赖氨酸抑菌活性增强带负电聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性利影响卡拉胶影响果胶影响浓度进步提高ε聚赖氨酸抑菌效果降低带电中性聚合物仅ε聚赖氨酸产生轻微影响观察抑菌圈硫酸鱼精蛋白溶菌酶活性增效效果强
利96孔板观察ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合知ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌浓度0003枯草杆菌抑菌浓度0003中例混合溶菌酶聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强效果葡聚糖ε聚赖氨酸反应：葡聚糖ε聚赖氨酸明显影响鱼精蛋白ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强效果果胶ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌明显减弱着果胶例增加ε聚赖氨酸影响增加卡拉胶ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显减弱着例浓度增强ε聚赖氨酸抑菌效果影响增强
利CTC活性染色实验结果表明带阴性点果胶卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌效果抑制作带阳性电溶菌酶硫酸鱼精蛋白增强作带中性电葡聚糖ε聚赖氨酸影响着浓度例增加抑制效果增加
着社会发展开始食品安全性食品添加剂意识提高化学防腐剂面挑战 天然毒副作高效食品防腐剂成社会发展趋势ε聚赖氨酸种天然生物代谢产品杀菌力热稳定性种良防腐性生物防腐剂ε聚赖氨酸年成国家食品安全添加剂研究重点尤日ε聚赖氨酸研究相较成熟进行批量产品生产着学者研究深入ε聚赖氨酸潜力发掘ε聚赖氨酸药食品防腐剂巨潜力供研究开发开发投入
参 考 文 献
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[18]邹凯华 展海军ε聚赖氨酸作食品防腐剂应河南工业学化学化工学院 河南 郑州 450052
[19]侯伟峰谢 晶林永艳ε 聚赖氨酸南美白虾保鲜应海海洋学食品学院海 201306
[20]沈佳佳 张晓军 周晓云 ε聚赖氨酸研究进展 浙江工业学生物工程系浙江杭州 310014
[21]邹凯华 展海军ε聚赖氨酸作食品防腐剂应 河南工业学化学化工学院 河南 郑州 450052
[22] 吴京新型微生物源天然食品防腐剂抑菌性[J]江西食品工业2011(01)4648+40
[23] 王宇 食品添加剂安全问题伦理思考[D]武汉理工学2010
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摘
ε聚赖氨酸种天然食品防腐剂工合成化学防腐剂相抑菌效果相差提高抑菌活性具重意义文利紫外分光光度扫描分析ε聚赖氨酸呈电荷生物聚合物相互作利孔法分析微量稀释法CTC法分析电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响紫外见分光光谱显示ε聚赖氨酸负电荷聚合物相互作带正电乳酸链球菌素硫酸鱼精蛋白提高ε聚赖氨酸抑菌活性呈负电果胶卡拉胶羧甲基纤维素钠（CMC NA）抑菌活性定抑制作未带电荷葡聚糖影响较研究ε聚赖氨酸食品防腐中提供定参考
关键词：ε聚赖氨酸生物聚合物抑菌活性肠杆菌枯草杆菌
Abstract
ε polylysine is a natural food preservative but its bacteriostatic effect is relatively poor compared with that of synthetic chemical preservatives In this paper the interaction between εpolylysine and the biopolymer with different charge was analyzed by ultraviolet spectrophotometry and the effects of different charge biopolymers on the bacteriostatic activity of εpolylysine were analyzed by drilling method microdilution method and CTC method Uvvis spectra show that εpolylysine interacts with negatively charged polymers The bacteriostatic activity of εpolylysine was enhanced by positive streptococcus lactis and protamine sulfate The e negatively charged pectin carrageenan and sodium carboxymethyl cellulose (CMC NA) have a certain inhibitory effect on its antibacterial activity while the uncharged glucan has less effect This study can provide a reference for εpolylysine in food preservation
Key words：εPLbiopolymersAntibacterial activity ofE coliBacillus subtilis
目 录
1 引 言 5
11 食品防腐剂 5
12 天然防腐剂研究现状 5
13 ε聚赖氨酸研究综述 6
131 源性质 6
132 抑菌机制 6
133 ε聚赖氨酸前景 7
14 目意义研究容 7
2 材料方法 8
21 材料试剂仪器 8
211材料试剂 8
212 仪器 8
213 供试菌种 8
214 培养液培养基 8
215 抑菌剂配制 8
22 方法 9
221 菌种活化 9
222 培养 9
223 单素实验 9
224 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 9
225 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物相互作研究 9
226ε聚赖氨酸电荷生物聚合物抑菌浓度测定 10
227 CTC活性染色 10
3 结果分析 11
31 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 11
311阳离子ε聚赖氨酸抑菌活性影响 11
312 阴离子聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 12
313 中性生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响 13
32 抑菌浓度测定 17
33 CTC活性染色 19
4 讨结 21
参 考 文 献 22
致 谢 24
电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
1 引 言
11 食品防腐剂
食品腐败变质直全社会关注重问题现社会应食品腐败变质问题广泛食品添防腐剂应食品腐败变质问题食品防腐剂效抑制食品腐败延长食品储藏期食品防腐剂量极少效果显著食品身风味色泽营养明显影响甚食品影响忽略计中现社会应广泛工合成食品防腐剂国标中规定安全添加量中会体造成影响合法量工合成食品防腐剂毒素会体中堆积体造成法避免伤害天然防腐剂体没顾虑抑菌效果理想防腐效果突出等原法广泛天然食品添加剂系列缺点已然成食品科学研究工作者工作重点容
12 天然防腐剂研究现状
天然防腐剂分三类：植物源动物源微生物源[22]
微生物源天然防腐剂现社会理想天然食品防腐剂具毒安全高效副作优点符合未食品防腐剂发展求食品行业越越广泛ε聚赖氨酸曲酸乳酸链球菌等ε聚赖氨酸赖氨酸残基通羧基氨基形成酰胺键连接成短肽带负电荷阴离子较强静电作2530赖氨酸残基具抑菌谱广水溶性安全性高热稳定性抑菌 pH 范围广等优点
13 ε聚赖氨酸研究综述
131 源性质
1977年日学者Shima[3]等微生物中筛选Dargendorff Positive物质时观察株稳定量产生DP物质放线菌白色链霉菌Streptomyces albulus现培养液滤种德拉根道夫实验呈阳性化合物该物质证实种单赖氨酸α羟基ε氨基形成酰胺键连接成聚氨基酸[4]20～30赖氨酸单体ε聚赖氨酸 (εpolyLlysineεPL)
ε聚赖氨酸种溶水微溶乙醇肽物质种重生物碱生物降解物理性质青黄色通常呈粉末状具较强湿特性空间结构呈直链状赖氨酸组成具高热稳定性杀菌力较强水溶性热稳定性pH值产生影响熔点固定般温度高250℃时软化分解ε聚赖氨酸抑菌活性受分子量影响抑菌活性佳分子量36004300分子量低1300时失抑菌活性红外光谱分析反映出ε聚赖氨酸强吸收峰值约1680～1640cm 115801520cm1[6]
132 抑菌机制
ε聚赖氨酸抑菌效率高低浓度时抑菌活性ε聚赖氨酸抑菌机制表现方面（1）作细胞壁细胞膜系统细胞膜形成孔道导致分子物质渗出细胞外液渗透压升高细胞物质合成受阻细胞膜破裂时分子物质溢出终导致细胞死亡起抑菌防腐作[7]（2）作遗传物质改变遗传性状（3）作酶者功蛋白影响蛋白质合成正常生理代谢功化学组成体必需氨基酸L赖氨酸构成肽消化变成单赖氨酸成体营养强化剂聚赖氨酸作食品防腐剂具毒副作安全性高特点盐酸柠檬酸苹果酸甘氨酸高级脂肪甘油酯等合具增效作遇酸性糖磷酸盐盐酸盐等结合活性降低时ε聚赖氨酸具定抗噬菌体力[9]
刘慧[10]等研究表明ε聚赖氨酸革兰氏阳性微球菌保加利亚乳杆菌嗜热链球菌革兰氏阴性肠杆菌沙门氏菌酵母菌明显抑制效果ε聚赖氨酸单独时革兰氏阴性菌效果明显醋酸复合枯草芽胞杆菌明显抑制作高温处理ε聚赖氨酸微球菌抑菌活性[7]显示ε聚赖氨酸具良热稳定性ε聚赖氨酸中性微酸性环境中较强抑菌性酸性碱性条件抑菌效果明显[11]
133 ε聚赖氨酸前景
民生活水断提高食品求更高：更样化更新鲜更营养更健康尤食品添加剂防腐剂求越越高[23]国食品防腐剂年直化学防腐剂天然食品防腐剂少数种ε聚赖氨酸传统化学合成防腐剂种天然防腐剂添加ε聚赖氨酸加工食品中够达防腐抑菌目ε聚赖氨酸会影响食品身风味时具安全性ε聚赖氨酸广泛应食品加工防腐[16][17][19][20][21]ε聚赖氨酸2003年10月美国食品药物理局批准安全食品保藏剂[15]日食品加工行业ε聚赖氨酸已作种食品防腐剂进行生产国2014年批准ε聚赖氨酸作种食品防腐剂添加食品保鲜
14 目意义研究容
项目革兰氏阴性菌肠杆菌阳性菌枯草芽孢杆菌指示菌采琼脂扩散法研究电荷聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响紫外见光扫描光谱分析ε聚赖氨酸带电生物聚合物96孔板测定ε聚赖氨酸抑菌浓度混合物抑菌浓度CTC活性染色测定抑菌效果ε聚赖氨酸食品中科学应提供定科学
2 材料方法
21 材料试剂仪器
211材料试剂
ε聚赖氨酸果胶卡拉胶葡聚糖溶菌酶硫酸鱼精蛋白
212 仪器
仪器
型号
生产厂家
恒温培养箱
超净工作台
全动高压灭菌锅
电热鼓风干燥箱
恒温培养摇床
电子天
DHP9272A
SWCJ2D
YXQSG46280S
DHG9070A
NRY2010C
YP802N
海飞越实验仪器限公司
苏州净化设备限公司
海博讯实业限公司
海飞越实验仪器限公司
海南荣实验设备限公司
海精密科学仪器限公司
213 供试菌种
革兰氏阳性菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
革兰氏阴性菌种
肠杆菌（Escherichia coli)
214 培养液培养基
培养基
操作步骤
营养琼脂
牛肉膏 1g酵母膏 2g蛋白胨 5gNaCL 5g琼脂15g加水定容1000ml调pH74 121℃高压灭菌15min备
营养肉汤
蛋白胨10g牛肉膏3gNaCL 5g加水定容1000ml分装30ml 121℃高压灭菌15min备
215 抑菌剂配制
2 ε聚赖氨酸：称取01克ε聚赖氨酸5mL菌水中溶解
1果胶：称取01克果胶10ml菌水中加热溶解
1葡聚糖称取01克葡聚糖10ml菌水中溶解
4鱼精蛋白：称取04克鱼精蛋白10ml菌水中溶解
2溶菌酶：称取02克溶菌酶10ml菌水中溶解
02卡拉胶称取02克卡拉胶100ml菌水中加热溶解
22 方法
221 菌种活化
超净工作台中接种环划线接种37℃培养24h活化活化菌种接种营养肉汤中200rpm摇床培养16h
222 培养
活化菌种接种装30mL营养肉汤150mL三角瓶37℃培养箱中培养24时
223 单素实验
超净工作台中取菌液（肠杆菌枯草芽孢杆菌）加入培养皿制加入约20ml营养琼脂加入1ml菌液菌液浓度约1×1037mm孔器孔注入ε聚赖氨酸测试物：ε聚赖氨酸浓度005成分浓度分0050101502025设置空白组37℃恒温箱培养24h测量抑菌圈
224 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
枯草芽孢杆菌板中加入果胶卡拉胶葡聚糖鱼精蛋白溶菌酶ε聚赖氨酸复合物例浓度223进行指示菌肠杆菌方法
225 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物相互作研究
利紫外见分光光度计进行波长扫描蒸馏水作分记录200nm500nm吸光度值扫描02mgml ε聚赖氨酸分02 mgml物质混合测试物
226 ε聚赖氨酸电荷生物聚合物抑菌浓度测定
利96孔板ε聚赖氨酸电荷生物聚合物例混合聚赖氨酸组37℃恒温箱培养24h观察抑菌浓度
227 CTC活性染色
利CTC染色观察果胶葡聚糖鱼精蛋白溶菌酶卡拉胶浓度00010002000400080010002ε聚赖氨酸抑菌混合反应肠杆菌枯草杆菌菌液组ε聚赖氨酸例1100510110511混合做标记
溶液例混合观察抑菌活性利紫外见分光光度计进行波长扫描二甲基亚砜作记录470nm吸光度值
3 结果分析
31 电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
311阳离子ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出添加溶菌酶提高ε聚赖氨酸抑菌活性
溶菌酶ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌性变高浓度逐渐增溶菌酶ε聚赖氨酸产生正促进作带阳离子溶菌酶样带阳离子ε聚赖氨酸产生反应抑菌效果提高明显：溶菌酶含量逐渐增加时抑菌圈增加明显ε聚赖氨酸单独抑制效果溶菌酶混合时增幅效果较着溶菌酶例增加抑菌效果增加明显
表1溶菌酶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
溶菌酶
2mm
2mm
3mm
4mm
6mm
混合
2mm
3mm
4mm
45mm
7mm
表2溶菌酶ε聚赖氨酸例抑制枯草杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
溶菌酶
2mm
2mm
3mm
4mm
6mm
混合
2mm
3mm
4mm
45mm
5mm
考察实验结果出硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌活性促进增强作硫酸鱼精蛋白带阳离子电细胞质膜形成孔洞破坏细菌生长ε聚赖氨酸形成协促进作抑菌活性增增加ε聚赖氨酸抑菌活性[13]
表3 硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
硫酸鱼精蛋白
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
15mm
15mm
15mm
2mm
表4 硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
硫酸鱼精蛋白
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
15mm
18mm
2mm
312 阴离子聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出例果胶ε聚赖氨酸活性抑制作浓度提高ε聚赖氨酸抑菌效果越发明显两者混合产生沉淀形成复合物光谱发生变化
ε聚赖氨酸革兰氏阴性菌具明显抑菌效果果胶酸性条件定抑菌性ε聚赖氨酸带负电荷物质具强静电作力生物膜良穿透力导致细胞死亡起抑菌防腐作果胶浓度提高ε聚赖氨酸抑菌活性定提高果胶含量进步提高ε聚赖氨酸抑菌活性逐渐降
表5 果胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
果胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
15mm
0mm
0mm
0mm
表6 果胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
果胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
0mm
0mm
0mm
0mm
考察实验结果出带阴性电卡拉胶ε聚赖氨酸例混合卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌活性定影响卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌活性抑制作卡拉胶ε聚赖氨酸混合现成沉淀卡拉胶粘性ε聚赖氨酸扩散困难含量越ε聚赖氨酸负面影响越
表7卡拉胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
卡拉胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
表8卡拉胶ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
卡拉胶
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
313 中性生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响
考察实验结果出葡聚糖ε聚赖氨酸抑菌活性定影响肠杆菌中影响明显枯草杆菌中着定影响影响明
表8葡聚糖ε聚赖氨酸例抑制肠杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
葡聚糖
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
1mm
15mm
16mm
表9葡聚糖ε聚赖氨酸例抑制枯草杆菌活性影响
溶液 浓度
05
01
015
02
025
ε聚赖氨酸
1mm
葡聚糖
0mm
0mm
0mm
0mm
0mm
混合
1mm
1mm
1mm
0mm
0mm
314 阳性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
311实验中出添加溶菌酶提高ε聚赖氨酸抑菌活性图31基紫外见扫描光谱出两者间定相互作
图31 溶菌酶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
实验311中出硫酸鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌活性促进增强作图32知两者混合物太变化两者未产生新聚合物
图32 鱼精蛋白ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
315 阴性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
312实验中出果胶ε聚赖氨酸活性抑制作两者混合产生沉淀形成复合物光谱发生明显变化
图33果胶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
卡拉胶ε聚赖氨酸混合反应现成沉淀产生复合物光谱明显变化卡拉胶ε聚赖氨酸混合现成沉淀ε聚赖氨酸扩散困难知含量越ε聚赖氨酸负面影响越
图34卡拉胶ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
316 中性生物聚合物ε聚赖氨酸混合两者混合物紫外分光扫描光谱
实验313中知葡聚糖ε聚赖氨酸抑菌活性定影响两者混合两者混合物紫外见分光扫描光谱图35知葡聚糖ε聚赖氨酸混合物光谱理值较差
图35葡聚糖ε聚赖氨酸两者混合物200350nm紫外分光扫描光谱
32 抑菌浓度测定
含浓度抑菌剂培养基制备 肉汤培养基加入96孔板孔中含浓度抑菌剂培养基制备 稀释00010002000300040005观察ε聚赖氨酸抑菌浓度抑菌浓度003ε聚赖氨酸带电荷聚合物1002100310041005102103104105混合菌浓约1×10337℃恒温培养24h
表1 ε聚赖氨酸枯草杆菌肠杆菌抑菌浓度
浓度
0001
0002
0003
0004
0005
枯草杆菌
++
+
肠杆菌
+
+
注 表中表示微生物生长+表示少量微生物生长+++++分表示微生物生长量
已知抑菌浓度ε聚赖氨酸（0003）1果胶1葡聚糖4鱼精蛋白2溶菌酶02卡拉胶1002100310041005102103104105混合浓度菌浓约1×10337℃恒温培养24h
表2 ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合肠杆菌抑菌浓度
例
εpl+葡聚糖
εpl+果胶
εpl+卡拉胶
εpl+溶菌酶
εpl+硫酸鱼精蛋白
1002
+
+
+
1003
1004
+
1005
+
102
++
+
103
++
++
104
+
+++
+++
105
+
+++
+++
表3 ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合枯草杆菌抑菌浓度
例
εpl+葡聚糖
εpl+果胶
εpl+卡拉胶
εpl+溶菌酶
εpl+硫酸鱼精蛋白
1002
+
+
1003
1004
1005
102
++
+
103
++
+
104
+
+++
+
105
++
+++
++
观察96孔板微生物生长情况ε聚赖氨酸（0003）葡聚糖（1）1002100310041005102103混合时抑菌效果明显葡聚糖浓度增加ε聚赖氨酸（0003）影响变ε聚赖氨酸（0003）抑菌效果变ε聚赖氨酸（0003）果胶（1）混合时ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌效果变差着混合例增加ε聚赖氨酸枯草杆菌抑菌效果效果明显变差ε聚赖氨酸（0003）卡拉胶（02）100310041005例混合ε聚赖氨酸抑菌效果明显着卡拉胶例增加抑菌效果明显变差ε聚赖氨酸（0003）溶菌酶（2）混合抑菌效果显著肠杆菌枯草芽孢杆菌生长ε聚赖氨酸（0003）硫酸鱼精蛋白（4）混合抑菌效果显著肠杆菌枯草芽孢杆菌生长
33 CTC活性染色
（1）菌悬液制备移液分取肠杆菌枯草杆菌菌液03mL离心中5000rmin离心5min弃清液加入菌水10mL搅拌均匀离心5min清液加菌水10mL充分混匀
（2）取15mL离心取03mL肠杆菌枯草芽孢杆菌菌液组取离心加002ε聚赖氨酸余五次加入测试物001果胶001葡聚糖004鱼精蛋白002溶菌酶002卡拉胶组002ε聚赖氨酸1100510110511混合做标记
（3）37℃恒温培养作1h加入3μL增强剂12μL染色剂混匀继续作30min5000rmin离心5min弃清液加入二甲基亚砜5mL混匀混合均匀5000rmin离心5min观察颜色变化
观察实验结果组果胶葡聚糖卡拉胶抑菌效果颜色深红色鱼精蛋白微抑菌效果红色ε聚赖氨酸溶菌酶明显抑菌效果淡红色例混合带阴离子果胶卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌效果明显抑制颜色变化红色微生物存活率较高带阳离子溶菌酶鱼精蛋白ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强颜色淡红色着例增加颜色色微生物存活率降低带中性电葡聚糖ε聚赖氨酸影响着例增加影响明显颜色淡红色橙色着例增加微生物存活率降低
36 CTC活性染色肠杆菌枯草芽孢杆菌活菌制剂微生物存活率
4 讨结
考察电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响利紫外见光扫描光谱分析ε聚赖氨酸带电生物聚合物阳离子肽相互作结：
果胶卡拉胶分ε聚赖氨酸混合形成沉淀溶菌酶ε聚赖氨酸产生聚合物光谱发生明显变化浓度例ε聚赖氨酸抑菌活性提高带电荷生物聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性影响阳离子聚合物浓度提高ε聚赖氨酸抑菌活性增强带负电聚合物ε聚赖氨酸抑菌活性利影响卡拉胶影响果胶影响浓度进步提高ε聚赖氨酸抑菌效果降低带电中性聚合物仅ε聚赖氨酸产生轻微影响观察抑菌圈硫酸鱼精蛋白溶菌酶活性增效效果强
利96孔板观察ε聚赖氨酸电荷聚合物例混合知ε聚赖氨酸肠杆菌抑菌浓度0003枯草杆菌抑菌浓度0003中例混合溶菌酶聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强效果葡聚糖ε聚赖氨酸反应：葡聚糖ε聚赖氨酸明显影响鱼精蛋白ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显增强效果果胶ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌明显减弱着果胶例增加ε聚赖氨酸影响增加卡拉胶ε聚赖氨酸反应：ε聚赖氨酸抑菌效果明显减弱着例浓度增强ε聚赖氨酸抑菌效果影响增强
利CTC活性染色实验结果表明带阴性点果胶卡拉胶ε聚赖氨酸抑菌效果抑制作带阳性电溶菌酶硫酸鱼精蛋白增强作带中性电葡聚糖ε聚赖氨酸影响着浓度例增加抑制效果增加
着社会发展开始食品安全性食品添加剂意识提高化学防腐剂面挑战 天然毒副作高效食品防腐剂成社会发展趋势ε聚赖氨酸种天然生物代谢产品杀菌力热稳定性种良防腐性生物防腐剂ε聚赖氨酸年成国家食品安全添加剂研究重点尤日ε聚赖氨酸研究相较成熟进行批量产品生产着学者研究深入ε聚赖氨酸潜力发掘ε聚赖氨酸药食品防腐剂巨潜力供研究开发开发投入
参 考 文 献
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