中国农业科学院究生院
基工程原理复题
名词解释
1 原核基（Prokaryotic gene）：原核生物（肠杆菌）基组编码基高等生物细胞器线粒体基组叶绿体基组等编码基统称原核基
2 真核基（Eukaryotic gene）：真核生物基组DNA编码基感染
真核细胞DNA病毒反转录病毒基组编码基统称真核基
3 前导序列（Leader sequence）：前导序列区5＇非翻译区（5＇UTR）系指位mRNA5＇起始密码子前段长数百核苷酸翻译RNA区段
4 尾序列（Tai1er sequence）：称尾序列区3＇非翻译区（3＇UTR）系指位mRNA3＇终止密码子段100核苷酸翻译RNA区段
5 复制子（Replicon）： 指复制起始区（oriC）起始基DNA复制单元例细菌染色体病毒基组质粒基组等DNA够进行复制遗传单元均称复制子真核细胞基组复制子指含复制起始位点DNA（RNA）复制子特称复制单元
6 增强子 （Enhancer）：增强子序列增强子元件真核基中发现 种特异序列够距离目标基50kb位置游游位置方增强该基转录活性
7 沉默子（Silencer）真核基启动子中增强子外沉默子样种远距离调控相关基转录活性式元件增强子样沉默子够启动子游游甚基部三种位置正反影响相关基启动子转录起始效率时沉默子组织特异性时间特异作方式控制基表达作增强子功效应相反沉默子抑制激活相关基转录起始活性
8 绝缘子（Insulator）增强子活性物理边界元件（physical boundary element）段够抑制隔离增强子功效应式转录调节序列绝缘子种功作发挥取决位置果位增强子启动子间便够阻断增强子功效应位增强子启动子区段外侧便够阻断增强子功作作者绝缘子称隔离邻增强子启动子激活作中间隔栅（neutral barrier）绝缘子作特异结合蛋白IBP结合发挥作意义：阻断增强子超远距离激活作影响生物发育序真核绝缘子保护序表达防义基表达
9 调节子（Regulon）：指肠杆菌基组中表达活性受种基编码蛋白质协调节组连续相邻排列结构基调节子操子处者结构基彼相邻排列调节子结构基分散染色体部位甚位染色体
10 基差异表达（Differential expression of gene ）： 真核生物特定发育阶段某特定类型细胞中般15基进行表达种生物体发育阶段组织细胞中发生基时间空间进行序表达方式基差异表达
11 基互补（Intragenic complementaion）： 系指编码样肽序列具 突变两基联合产生出种功活性蛋白质肽生化程
12 基图（Gene map）：描述染色体DNA分子基排列序间隔距离线性图包括遗传图物理图两种
遗传图（genetic map）：根遗传重组实验绘制表示染色体基（特定DNA序列区）间排列序相距离线性图图距厘摩(cM)表示
物理图（Physical map）：精确物理长度单位般核苷酸数表示基染色体DNA分子排列序间隔距离实际长度线性图
13 基簇（Gene cluster）基家族（Gene family）：系指原核生物基组中相关组相合基组成种特殊排列组合方式基簇基遗传紧密连锁属操子结构基操子结构基基家族成员基家族成员
基家族（Gene family：生物中始祖基重复突变进化具相似结构相似产物相似功特征：（1）重姓（2）紧密连锁（3）表型功方面相关性（4）核苷酸序列致性
14 基克隆（Gene cloning）：基克隆DNA克隆指外源基插入克隆载体形成重组DNA分子群体转化肠杆菌寄细胞中进行复制繁殖便分子DNADNA片段中分离纯化目基特定DNA片段实验操作做基克隆DNA克隆
15 融合基（Fusion gene）：称重组基杂种基嵌合基通常指通发突变形成利DNA重组技术构建类具两两基核苷酸序列新型基融合基形成融合蛋白融合基定形成融合蛋白
16 基剂量 （Gene dosage）：指细胞拥种基拷贝数
基剂量实验建立局部二倍体菌株基础专门检测基拷数增加编码产物合成速率影响分子遗传学研究技术
17 裂口（Gap）：双链DNA分子某条链丢失连续数核苷酸造成单链断裂
缺口（Nick）：双链DNA分子某条链相邻核苷酸间丢失磷酸二酯键造成单链断裂
18 切丁酶（Dicer）：译RNAi核酸酶种RNaseⅢ样（RNaseⅢ like）核酸切酶双链RNA（dsRNA）分子切割成21~23bp分子干扰RNA 种需ATP程
19 异裂酶（Neoschizomer）： 指组源具相识序列切割位点组核酸切限制酶称异裂酶
20 尾酶（Isocaudarner）：组源识序列异够切割形成相黏性末端核酸切酶
21 裂酶 (Isoschizomer) 类源识序列相切割产生相黏性末端核酸切酶
22 拓朴异构酶（T0poisomerase）：原核真核细胞中发现具催化单链DNA双链DNA产生瞬时断裂功具切割连接双重功导致双链构型改变抗癌研究中发展抑制拓扑异构酶活性抗癌药物开发研制具重意义
23 质粒DNA迁移作（Plasmid mobilization）：指存接合型质粒引发非接合型质粒转移程结合型质粒mob基产生迁移蛋白作存非迁移型质粒nic位点产生迁移作称质粒DNA迁移作
24 柯斯载体（Cosmid）：类工构建含λ噬菌体DNAcos序列质粒复制子特殊类型质粒载体具λ噬菌体特性具质粒载体特性具高容量克隆力DNA体外包装噬菌体外壳
25 噬菌体展示载体（Phage display vector）：根单链噬菌体表面表达蛋白质肽噬菌体表面展示技术外源基插入该载体基Ⅲ基Ⅷ编码序列中正确表达出融合蛋白类特殊途噬菌体载体
26 穿梭质粒载体（S huttle plasmid vector）： 简称穿梭载体双功载体类工构建具两种复制起点选择记号两种寄细胞（肠杆菌酿酒酵母）中进行复制存留质粒载体
27 M13克隆体系优点：
a 方便产生外源单链DNA
b 重组子组织化学方法检测
c lacZ基具克隆位点便外源DNA插入
d 定克隆外源基
28 质粒载体结构特点：
a 具复制起点（ori）
b 具抗生素抗性基（选择）
c 具干核酸切酶单切点
d 较分子量较高拷贝数
29 启动子封堵（Promoter occlusion）：游启动子驱动转录作通读游启动子时便会该启动子功受抑制现象做启动子封堵
30Ⅱ型核酸切酶特点：a 具亚基结构（单切割功）b 识双链DNA分子中靶子序列c切割形成长度限制片段 d称切割形成粘性末端 e 酶切反应需量ATP
31 表观遗传信息层（Epigenetic layer of information）：贮藏围绕DNA分子周围DNA分子结合蛋白质化学物质中表观遗传信息RNA基样令困惑甚RNA基更重
32 分子伴侣（Molecular chaperone）： 专指类功蛋白质促某蛋白质正确方式组装折叠身终形成功蛋白质组成部分类蛋白质特称分子伴侣
33 RNA干扰（RNAi）：年研究发现分子量外源双链RNA进入寄细胞便促进源源mRNA发生特异性降解作高效特异阻断体相应基活性细胞发挥基剔作种现象RNA干扰
34 生命体遗传信息三层次：
第层次编码蛋白质基组成类基组基编码序列占总DNA序列2
第二层次：仅编码RNA编码蛋白质基组DNA组成部分DNA做非编码DNA转录产物称非编码RNA（包括tRNArRNAsnoRNA）相应基称RNA基类基隐藏巨非编码染色体DNA序列中称隐藏基（cryptic gene）
第三层次：表观遗传信息层（epigenetic layer of information）
贮藏围绕DNA分子周围DNA结合蛋白质化学物质中表观遗传信息RNA基样令兴奋甚RNA基更重
35 全局调节（Global regulation system） 原核生物细菌细胞适应环境条件范围重变化单操子作局部调节显然够需种够时调节许相关操子特殊调节体系种调节体系称全局调节体系许单调控途交织组成种复杂调控网络应付外界环境压力时适时快速作出反应
36 线性 （Collinearity）：谓线性包括4种情况：
指位条染色体DNA分子条DNA分子基位置排列关系种情况时特称线性（Synteny）
二指物种相关染色体DNA分子间基排列序致性
三指位DNA分子转录RNA分子间核苷酸碱基排列序 致性
四指位DNA分子mRNA分子遗传密码子排列序相应蛋白质肽链氨基酸排列序间致性
37 基工程诞生理基础技术基础什？
（1） 理基础：
（a） 世纪40年代明确遗传物质携带者DNA蛋白质明确基载体
（b）世纪50年代相继揭示DNA双螺旋结构模型半保留复制机理解决基复制
（c） 世纪50 世纪末60年代初相继提出中心法操子学说成破译遗传密码子解决遗传信息流基表达问题
（2） 技术基础：
（a） DNA分子体外切割连接技术
（b） DNA测序技术
（c） 基克隆载体发展应
（d）肠杆菌转化技术
（e）琼酯糖凝胶电泳技术
（f） 核酸杂交技术
38 RNA编辑（RNA editing）：
基转录加工程中会量尿嘧啶核苷酸（Us）加入前体mRNA（premRNA）核苷酸序列中premRNA核苷酸序列中删甚会发生核苷酸碱基取代反应种RNA转录成熟修饰程中发生核苷酸加入删取代现象做RNA编辑（RNA editing）
碱基饰变结果RNA转录核苷酸序列应DNA链核苷酸编码序列完全匹配饰变mRNA转译蛋白质肽链氨基酸序列结构便基核苷酸序列推导出差
39（1）微RNA(microRNAmiRNA)：
真核细胞中发现类调节型非编码蛋白质分子量单链RNAmiRNA源基组编码转录成PrimiRNA果蝇酶切割生成7080ntpremiRNA折叠成双链发夹结构进入细胞质切丁酶进步切割单链环形成21～25bp双链体(miRNA：miRNA*)分子双链体解离出单链存留链miRNA目标mRNA结合阻止翻译条消失链miRNA*降解
39（2）miRNAsiRNA较
相似点：
（1） 分子结构十分相似长度均21～25分子量RNA 5端具P基团3端具0H基团
（2） 通RISC结合方式发挥功作
（3） 终极作抑制mRNA翻译活性导致基沉默
点：
（1） 生物合成途径
siRNA外源导入双链(dsRNA)切割产生少数源dsRNA切割产生
miRNA然源基组编码转录成PrimiRNA果蝇酶切割生成7080ntpremiRNApremiRNA存回文结构折叠成双链发夹结构→输出蛋白作进入细胞质切丁酶进步切割加工成21～25bp片段单链环形成双链miRNA双链体(miRNA：miRNA*)分子解离出单链存留链miRNA目标mRNA结合阻止翻译条消失链miRNA*降解
（2）抑制翻译方式
siRNA通目标mRNA编码区中靶序列结合引导RISC复合物中切段酶靶序列中间部位切割断裂mRNA分子抑制翻译
miRNA通目标基mRNA 3UTR序列中结合位点序列互补作促mRNA失翻译活性miRNA作程中然目标蛋白质数量减少mRNA丰度没明显变化
（3）碱基互补水
siRNA靶序列间核苷酸碱基互补水达百分百完全匹配
miRNA材料源差异两种情况植物mRNA靶序列核苷酸碱基百分百完全匹配动物miRNA结合位点核苷酸碱基完全互补两者间存着干非配碱基
40 微量碱法分离纯化质粒DNA原理点：
（1）根质粒DNA染色体线性 DNA拓扑学差异质粒DNA（cccDNA）价闭合双链超盘旋构型分子DNA细胞染色体DNA细胞裂解分离程中断裂成线性DNA（LDNA）然化学质没质区高级结构拓扑学存差异
（2） 差异碱变性pH 120125高pH条件线性DNA容易变性解链质粒DNA易变性少变性
（3） 酸复性pH48条件cccDNA快复性线性染色体DNA逆变性蛋白质RNA形成沉淀物通离心LDNAcccDNA分开cccDNA清液中
（4） 酒精沉淀cccDNA 25倍95 酒精沉淀质粒DNA(浓度66沉淀)保存TE（pH8o）缓液中放置－20Co保存备
41 图示λZAP载体组成结构优点：
T3MCS T7
___________________________＼／____________________
cos_｜ ｜ ｜ pBluescriptSK噬菌粒 ｜ ｜ ___｜
｜______｜____｜________________________｜______｜__｜cos
I LacZ T
结构组成：（1）含具删特性pBluescriptSK噬菌粒
（2）pBluescriptSK噬菌粒两端具f1起始子（I）终止子（T）
（3）pBluescriptSK噬菌粒部具两端带T3T7启动子克隆位点MCS
（4）pBluescript部带缺陷LacZ基
（5）该载体两端具cos末端
λZAP特点：
（1）种具删特性插入型λ噬菌体载体
（2）克隆10kb外源DNA
（3）外源DNA插入取读码结构正确表达出融合蛋白质抗体筛选
（4）外源DNA插入克隆位点β半乳糖苷酶失活Xgal显色组织化学筛选重组子（白色重组子）
（5）克隆外源DNA体pBluescript噬菌粒删省常规亚克隆
（6）利T3T7噬菌体RNA聚合酶方便制备外源插入DNA条链mRNA
删源理：含外源DNA插入重组λZAP载体感染肠杆菌F＋菌株辅助噬菌体M13（f1） 超感染细胞辅助噬菌体基Ⅱ提供反式作蛋白质便会识位λZAp载体f1起始子终止子终导致含外源DNA插入pBluescript噬菌粒体λZAP载体删终辅助噬菌体M13蛋白质包装成单链DNA噬菌体颗粒挤出寄细胞
42 M13克隆体系中β半乳糖苷酶Xgal显色原理
M13克隆体系包括M13克隆载体M13特殊寄菌株两部分组成β半乳糖苷(LacZ)四聚体时具活性色Xgal切割成半乳糖深蓝色靛蓝Xgal作β半乳糖苷酶活性种指示剂LacZ基分子量太基互补作原理利基工程方法编码样蛋白质肽链序列具突变序列种载体转入特殊寄菌株中便组成具功活性肽生化程根原理M13克隆载体种LacZ－HindⅡ片段具β半乳糖苷酶第292位氨基酸肠杆菌F子带缺失第1142位氨基酸缺陷性LacZ(简称M15基)M13载体感染种M13特殊寄菌株JM101便会产生具功活性β半乳糖苷酶含指示剂Xgal诱导物IPTG培养基中会出现蓝色噬菌斑外源基插入M13克隆载体时法形成四聚体具活性LacZ切割Xgal白色噬菌斑重组子
43 DNA标签法分离产物未知基原理步骤
根DNA插入突变作原理已知插入序列探针分离产物未知基方法插入DNA序列知目基加标签 称DNA标签法
步骤：（1） 段特定DNA标签序列插入野生型基部附位点时便会诱发该基发生突变形成突变体（2） 已知标签序列作DNA分子探针突变体基组DNA文库中筛选出突变基（3） 利筛选突变基标签序列外序列作探针野生型基组DNA文库中筛选出目基
44 克隆真核基肠杆菌表达体系优点条件
肠杆菌表达体系优点：
（1） 背景知识清楚分子生物学遗传学基础研究特表达调控知识丰富
（2） 具完善安全基工程体系包括安全寄菌株载体系统
（3） 早期转基表达调控研究扎实许基胰岛素基生长素基等肠杆菌中高效效表达
（4） 易工业化批量生产培养方便操作简单成低廉特药蛋白 发酵生产
实现真核基肠杆菌中效表达条件：
（1）真核基编码序列必须连续cDNA原核细胞中具备剪辑加工酶
（2）原核启动子诱导型强启动子
（3）融合蛋白质形式表达稳定性
45酵母 双杂交体系原理途什？
酵母双杂交体系简称Y2H世纪90年代初转录子结构基础发展出种敏感体鉴定基方法效分离知靶蛋白相互作种蛋白质编码基分离某种特定启动子调控元件结合特异性转录子效手段
许真核生物转录子样酵母β半乳糖苷酶转录子GAL4含两结构分开功相互独立结构域DNA结合域(DNA_BD)转录激活域(AD)应DNA重组技术GAL4转录子两结构域分开果放置酵母细胞中产生GAL4 DNABDAD肽彼间会直接发生相互作具转录子功活性法激活相关基转录应DNA重组技术两分开GAL4 DNABDAD甚分两转录子DNABDAD重组成转录子(空间彼)重新获转录子功活性激活相关基转录酵母双杂交体系根种原理建立
酵母双杂交体系包括两种肠杆菌酵母菌穿梭载体种特殊缺失源GAL4转录子酵母寄菌株
第种穿梭载体DNABD质粒载体：
具色氨酸合成酶基知靶基正确读码结构取插入该载体克隆位点便GAL4 DNABD肽形成第种杂种蛋白(X)
第二种穿梭载体AD质粒载体：
具亮氨酸合成酶基（leu）构建cDNA表达文库专载体克隆cDNA片段正确读码结构取插入该载体克隆位（构成cDNA文库）cDNA编码蛋白质便GAL4AD肽融合成第二种杂种蛋白（Y）
酵母寄菌株：
述两种杂种质粒转化酵母双杂交体系专寄菌株特点：（1）种菌株丧失源GAL4转录子力（2）具LacZhis3报告基（3）具trpleu转化标记缺少TrpLeu缺陷性培养基法生长
转化酵母细胞涂布缺少亮氨酸(Leu）色氨酸（Trp）SD培养基果笫种质粒表达靶蛋白第二种质粒表达cDNA文库编码种蛋白质发生相互作样DNABDAD会空间彼具色氨酸亮氨酸编码基缺陷性选择培养生长便构成功活性GAL4转录子启动游报告基LacZ表达含Xgal诱导物IPTG条件β半乳糖苷酶Xgal切割选择出蓝色阳性克隆分离含靶蛋白相互作种蛋白编码基 酵母双杂交体系产物未知基分离新基功鉴定
46表达载体组成：
（1） 原核启动子诱导型强启动子外源基蛋白表达量占总蛋白1030 果表达毒蛋白启动子应呈现低限基础转录水
（2） 克隆位点(MCS)插入外源基
（3） 抗生素抗性基作选择标记
（4） 复制起点(ori)决定外源基拷贝数
（5） 转录终止子防止启动子通读作提高蛋白质稳定性
（6） 翻译起始序列转译增强子
（7） 翻译终止子防止核糖体跳跃(Skipping)采四联核苷酸UAAU 效果更
47 简述构建cDNA克隆定义步骤优越性？
（1) 定义：cDNA克隆：mRNA出发反转录载体分子重组转化寄细胞增殖目基克隆化程称cDNA克隆理讲该生物种mRNA应克隆称cDNA文库
（2） 步骤：
第步：提取处特定发育阶段真核生物体特定器官组织中总RNA 根mRNA poly(A)尾特点Oligo(dT)柱分离纯化出mRNA
第二步：利适引物(般Oligo(dT)反转录酶获 cDNAmRNA杂合分子
第三步：碱处理降解RNaseH酶切割cDNAmRNA杂合分子中mRNA链获cDNA第链第链cDNA合成第二链cDNA
第四步：双链DNA适载体重组重组体群体导入肠杆菌寄细胞中增殖构成cDNA文库
（3）cDNA文库优点：
（a） mRNA材料出发RNA病毒特适
（b）库容量（相DNA文库15％）筛选工作量
（c） 假阳性例种mRNA应克隆
（d） 具特殊途：① 克隆真核基原核中表达需cDNA
② 核苷酸序列测定
③ 发育程中时空表达基研究分析
48 柯斯质粒载体结构特点什？
定义：柯斯质粒载体工构建带λ噬菌体cos位点Ecoli质粒复制子新型质粒载体具质粒载体特点λ噬菌体特点
结构： （a） 具质粒复制起点（ori）
（b）具干质粒载体选择记（12）
（c）具相数量质粒核酸切酶单切点
（d）具λ噬菌体cos位点
特点：（1）λ噬菌体特点：a导入寄细胞重新环化起
b体外包装转导效率提高
c法进入溶菌周期形成噬菌体颗粒
（2）具质粒载体特点：a寄细胞质粒DNA样复制
b氯霉素作扩增
c具抗生素抗性记号
（3）具高容量克隆力：限45kb限30kb
（4）带源序列质粒DNA重组
49 分叙述原核基组真核基组结构特点
（1）原核基组结构特点：
（a）高效遗传信息利率
① 没必额外重复序列极少存功冗余序列
② 基组９８％核苷酸序列编码基
③ 基排列紧凑操子基间间隔距离般超 ２０bp中存着转录起始信号终止信号
④ 存着编码序列彼重叠编码蛋白质重叠基
（b）双链ＤＮＡ编码功
（c）基聚集排列成操子结构形式
（d）染色体基组拷贝数均细胞11条富裕培养基中高达3～4条
（2）真核基组结构特点：
（a）包装成特定染色体结构
（b）基组倍性
（c）具量重复序列
（d） 高例非编码DNA序列例非编码序列占基组总长98蛋白质编码基序列基组总长2包括基基间非编码DNA序列基部非编码DNA序列
（e） 庞基数量
拟南芥：25000左右水稻：40000左右鼠：30000左右类：24000左右
（f）基分布密度均基分布富集区荒漠区分
50 基克隆？实验步骤
定义：基克隆DNA克隆指外源基插入适克隆载体形成重组DNA分子群体转化肠杆菌寄细胞中进行复制繁殖便分子DNADNA片段中分离纯化出目基特定DNA片段实验操作做基克隆DNA克隆
步骤：
（1） DNA片段化：实验材料分离纯化基组DNA机械方法酶
消化超声波等方法获定长度DNA片段
（2） 体外重组：片段化DNA适载体分子重组
（3） 重组子转化：重组子转入适寄菌株中进行增殖
（4） 重组子筛选：量转化细胞中筛选阳性克隆重组子
（5） 目基分离：种酶切走凝胶电泳探针进行杂交分离出目基DNA 克隆M13载体进行测序
(6） 目基表达功鉴定
51 DNA转录复制差？
基转录复制程生物化学酶学方面十分相似二者特核酸酶RNA聚合酶DNA聚合酶催化合成出条DNA模板链互补新核苷酸链基转录（RNA合成）基复制（DNA合成）间然存着方面差：
（1）引物需求 基复制中需时存模板链引物DNA聚合酶启动DNA新链合成基转录需引物RNA聚合酶便启动RNA新链合成
（2）底物样DNARNA分子核苷酸组成成分基复制转录底物样：前者脱氧核糖核苷三磷酸：dATPdGTPdTTPdCTP者核糖核苷三磷酸：ATPGTPTTPCTP
（3）模板结合状态异基复制半保留方式进行新生成两条子代DNA分子中新生链模板链始终结合起基转录新合成RNA链终模板解离
（4）精确性程度差异悬殊基转录程中错误参入RNA链核苷酸频率10－4说参入10000核苷酸会出现错误（万分错误率）基 复制核苷酸错误参入频率10－7说参入10000000核苷酸仅出现次错误（千万分错误率）说DNA复制精确度超转录1000倍
（5）涉范围基复制整基组头尾逐步进行涉范围包括整基组中DNA基基转录涉范围复制通常基操子
52 基扩增方式？
基扩增指某种基拷贝数增现象
方式：（1）利PCR 技术某基拷贝数增
（2）隆基导入寄细胞量繁殖基扩增(单拷贝基扩增约1x106拷贝)
（3）环境压力影响某种基适应性扩增
（4）程序性基扩增非洲爪蟾形成卵发育程中rRNA量扩增
（5）生物进化程中某种基扩增
53真核基原核基表达调解机理差异
（1）源细胞结构水差异真核细胞转录翻译分细胞核细胞质中分开进行没涉mRNA运送程调节原核细胞转录翻译细胞质中偶联发生
（2）源染色体结构水差异真核细胞基组包装成染色体存细胞质关蛋白质子（TF）进入细胞核必须克服染色体层层屏障式元件结合
（3）源基排列结构差异真核基单反子断裂基转录加工复杂原核基反子转录加工简单
54 说明mRNA差显示分离产物未知基基原理评述优缺点
答：（1）mRNA差显示：建立基差表达理基础通较体体组织发育阶段间mRNA种差应反转录PCR技术发展出种分离产物未知基方法mRNA差显示反转录PCR简称DDRTPCR
（2）原理：根真核基3端mRNA分子poly（A）尾巴前2位碱基mRNA分子分成12种类群1碱基分3类群根3端锚定引物5端设计机引物数理统计推算实验验3种锚定引物80种机引物(3×80＝240）240组合体涵盖95mRNA
（3）mRNA差显示优点：
（a）简单方便PCR扩增序列胶电泳技术简单快捷
（b）灵敏度高实验利PCR技术序列电泳技术位素
影技术具极高灵敏度
（c）性时较样品间基表达差异④直观性步骤均直观检测
（4）mRNA差显示缺点：
（a）假阳性率高
（b）扩增片段分子量较
（c）工作量
55 影响酶切反应素：
答：（1）DNA分子性质：（a）酶切位点周围碱基成分
（b）酶切位点密度
（c）DNA分子构型
（d）NA分子甲基化程度
（2）酶切温度
（3）DNA制剂纯度
56 产生酶切星号活性素：
（1）μg样品酶切量超10单位
（2）酶切反应体系中甘油浓度超5
（3）金属离子取代二价Mg
（4）金属镁离子低25mmolL
（5）pH超8
（6）样品中机溶剂污染影响
57 种基产生种蛋白质原分析
答：（1）原：（a） 许基拥启动子类基组中少半基具启动子真核断裂基转录程中变启动子常常涉位转录起点变首位外显子（alternative first exon）变启动子成员驱动相应变首位外显子开始转录反应已基变首位外显子作全阵列（whole arrays）分析结果证明变首位外显子具身专启动子变首位外显子产生蛋白质产物
（b） 初级转录变剪接产生种蛋白变剪接（alternative splicing）称差异剪接（differential splicing）变mRNA剪接指真核断裂基初级转录类型处发育阶段细胞中发生形式剪接作结果生成具序列结构特征编码蛋白质异形体成熟mRNA分子说变剪接基初级转录终翻译出种功蛋白质分子果蝇Dscam基例形成38016种蛋白质异形体见变剪接造成种基种蛋白质现象种重原
（2）次原：（c） RNA编辑致mRNA分子核苷酸序列结构出现变化种RNA编辑具种效应诸产生出新起始密码子终止密码子造成肽链编码序列出现变化RNA编辑结果改变源基DNA模板链遗传信息翻译出基原编码新蛋白质肽
（d） 基重排均产生蛋白基区段转位作机连接造成基变区固排列序改变基重排（gene rearrangement）DNA重排基产生蛋白
58 控制真核基表达调节方式：
（1）基重排调节方式
（2）基扩增调节方式
（3）基调节蛋白质转录调节方式
（4）RNA加工调节方式
（5）核质mRNA转调节方式
（6）mRNA稳定性调节方式
（7）mRNA翻译调节方式
59 真核基表达调节特点：
（1）真核生物原核生物基表达调节方面相似性已知少肠杆菌中出现调节机理原适真核生物例：i 两者转录调节通DNA结合蛋白质基启动子中特异性式元件结合作进行ii 两者DNA结合蛋白质肽基序序列结构相
（2）真核生物原核生物基表达调节方面差异性：i 真核生物细胞类型样性原核相特高等植物动物具数百种功异细胞类型ii真核生物具细胞核结构基转录翻译分细胞核细胞质中分步进行iii真核生物具庞基组 长度超原核700倍iii真核生活物基拥量种类型基总数达数万种相原核生物20倍
（3）真核基表达调节方面原核基相复杂性特殊性：i发育调节基表达发育阶段性调节器官组织特异性调节ii分化调节受精卵究竟分化出具特定功形状态特征类组织器官细胞？iii表达序性复杂细胞生命体中基表达序性调节机理iv生命体中细胞间生命活活动间协调相稳定性息样维持v选择性表达相基组什红细胞前体中会选择性表达编码血红蛋白基胰腺细胞中选择性表达胰岛素基种精确控制基差异表达分子机理解释呢？
(2014412北京学生命学院黄美娟提供)
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基工程原理复题
名词解释
1 原核基（Prokaryotic gene）：原核生物（肠杆菌）基组编码基高等生物细胞器线粒体基组叶绿体基组等编码基统称原核基
2 真核基（Eukaryotic gene）：真核生物基组DNA编码基感染
真核细胞DNA病毒反转录病毒基组编码基统称真核基
3 前导序列（Leader sequence）：前导序列区5＇非翻译区（5＇UTR）系指位mRNA5＇起始密码子前段长数百核苷酸翻译RNA区段
4 尾序列（Tai1er sequence）：称尾序列区3＇非翻译区（3＇UTR）系指位mRNA3＇终止密码子段100核苷酸翻译RNA区段
5 复制子（Replicon）： 指复制起始区（oriC）起始基DNA复制单元例细菌染色体病毒基组质粒基组等DNA够进行复制遗传单元均称复制子真核细胞基组复制子指含复制起始位点DNA（RNA）复制子特称复制单元
6 增强子 （Enhancer）：增强子序列增强子元件真核基中发现 种特异序列够距离目标基50kb位置游游位置方增强该基转录活性
7 沉默子（Silencer）真核基启动子中增强子外沉默子样种远距离调控相关基转录活性式元件增强子样沉默子够启动子游游甚基部三种位置正反影响相关基启动子转录起始效率时沉默子组织特异性时间特异作方式控制基表达作增强子功效应相反沉默子抑制激活相关基转录起始活性
8 绝缘子（Insulator）增强子活性物理边界元件（physical boundary element）段够抑制隔离增强子功效应式转录调节序列绝缘子种功作发挥取决位置果位增强子启动子间便够阻断增强子功效应位增强子启动子区段外侧便够阻断增强子功作作者绝缘子称隔离邻增强子启动子激活作中间隔栅（neutral barrier）绝缘子作特异结合蛋白IBP结合发挥作意义：阻断增强子超远距离激活作影响生物发育序真核绝缘子保护序表达防义基表达
9 调节子（Regulon）：指肠杆菌基组中表达活性受种基编码蛋白质协调节组连续相邻排列结构基调节子操子处者结构基彼相邻排列调节子结构基分散染色体部位甚位染色体
10 基差异表达（Differential expression of gene ）： 真核生物特定发育阶段某特定类型细胞中般15基进行表达种生物体发育阶段组织细胞中发生基时间空间进行序表达方式基差异表达
11 基互补（Intragenic complementaion）： 系指编码样肽序列具 突变两基联合产生出种功活性蛋白质肽生化程
12 基图（Gene map）：描述染色体DNA分子基排列序间隔距离线性图包括遗传图物理图两种
遗传图（genetic map）：根遗传重组实验绘制表示染色体基（特定DNA序列区）间排列序相距离线性图图距厘摩(cM)表示
物理图（Physical map）：精确物理长度单位般核苷酸数表示基染色体DNA分子排列序间隔距离实际长度线性图
13 基簇（Gene cluster）基家族（Gene family）：系指原核生物基组中相关组相合基组成种特殊排列组合方式基簇基遗传紧密连锁属操子结构基操子结构基基家族成员基家族成员
基家族（Gene family：生物中始祖基重复突变进化具相似结构相似产物相似功特征：（1）重姓（2）紧密连锁（3）表型功方面相关性（4）核苷酸序列致性
14 基克隆（Gene cloning）：基克隆DNA克隆指外源基插入克隆载体形成重组DNA分子群体转化肠杆菌寄细胞中进行复制繁殖便分子DNADNA片段中分离纯化目基特定DNA片段实验操作做基克隆DNA克隆
15 融合基（Fusion gene）：称重组基杂种基嵌合基通常指通发突变形成利DNA重组技术构建类具两两基核苷酸序列新型基融合基形成融合蛋白融合基定形成融合蛋白
16 基剂量 （Gene dosage）：指细胞拥种基拷贝数
基剂量实验建立局部二倍体菌株基础专门检测基拷数增加编码产物合成速率影响分子遗传学研究技术
17 裂口（Gap）：双链DNA分子某条链丢失连续数核苷酸造成单链断裂
缺口（Nick）：双链DNA分子某条链相邻核苷酸间丢失磷酸二酯键造成单链断裂
18 切丁酶（Dicer）：译RNAi核酸酶种RNaseⅢ样（RNaseⅢ like）核酸切酶双链RNA（dsRNA）分子切割成21~23bp分子干扰RNA 种需ATP程
19 异裂酶（Neoschizomer）： 指组源具相识序列切割位点组核酸切限制酶称异裂酶
20 尾酶（Isocaudarner）：组源识序列异够切割形成相黏性末端核酸切酶
21 裂酶 (Isoschizomer) 类源识序列相切割产生相黏性末端核酸切酶
22 拓朴异构酶（T0poisomerase）：原核真核细胞中发现具催化单链DNA双链DNA产生瞬时断裂功具切割连接双重功导致双链构型改变抗癌研究中发展抑制拓扑异构酶活性抗癌药物开发研制具重意义
23 质粒DNA迁移作（Plasmid mobilization）：指存接合型质粒引发非接合型质粒转移程结合型质粒mob基产生迁移蛋白作存非迁移型质粒nic位点产生迁移作称质粒DNA迁移作
24 柯斯载体（Cosmid）：类工构建含λ噬菌体DNAcos序列质粒复制子特殊类型质粒载体具λ噬菌体特性具质粒载体特性具高容量克隆力DNA体外包装噬菌体外壳
25 噬菌体展示载体（Phage display vector）：根单链噬菌体表面表达蛋白质肽噬菌体表面展示技术外源基插入该载体基Ⅲ基Ⅷ编码序列中正确表达出融合蛋白类特殊途噬菌体载体
26 穿梭质粒载体（S huttle plasmid vector）： 简称穿梭载体双功载体类工构建具两种复制起点选择记号两种寄细胞（肠杆菌酿酒酵母）中进行复制存留质粒载体
27 M13克隆体系优点：
a 方便产生外源单链DNA
b 重组子组织化学方法检测
c lacZ基具克隆位点便外源DNA插入
d 定克隆外源基
28 质粒载体结构特点：
a 具复制起点（ori）
b 具抗生素抗性基（选择）
c 具干核酸切酶单切点
d 较分子量较高拷贝数
29 启动子封堵（Promoter occlusion）：游启动子驱动转录作通读游启动子时便会该启动子功受抑制现象做启动子封堵
30Ⅱ型核酸切酶特点：a 具亚基结构（单切割功）b 识双链DNA分子中靶子序列c切割形成长度限制片段 d称切割形成粘性末端 e 酶切反应需量ATP
31 表观遗传信息层（Epigenetic layer of information）：贮藏围绕DNA分子周围DNA分子结合蛋白质化学物质中表观遗传信息RNA基样令困惑甚RNA基更重
32 分子伴侣（Molecular chaperone）： 专指类功蛋白质促某蛋白质正确方式组装折叠身终形成功蛋白质组成部分类蛋白质特称分子伴侣
33 RNA干扰（RNAi）：年研究发现分子量外源双链RNA进入寄细胞便促进源源mRNA发生特异性降解作高效特异阻断体相应基活性细胞发挥基剔作种现象RNA干扰
34 生命体遗传信息三层次：
第层次编码蛋白质基组成类基组基编码序列占总DNA序列2
第二层次：仅编码RNA编码蛋白质基组DNA组成部分DNA做非编码DNA转录产物称非编码RNA（包括tRNArRNAsnoRNA）相应基称RNA基类基隐藏巨非编码染色体DNA序列中称隐藏基（cryptic gene）
第三层次：表观遗传信息层（epigenetic layer of information）
贮藏围绕DNA分子周围DNA结合蛋白质化学物质中表观遗传信息RNA基样令兴奋甚RNA基更重
35 全局调节（Global regulation system） 原核生物细菌细胞适应环境条件范围重变化单操子作局部调节显然够需种够时调节许相关操子特殊调节体系种调节体系称全局调节体系许单调控途交织组成种复杂调控网络应付外界环境压力时适时快速作出反应
36 线性 （Collinearity）：谓线性包括4种情况：
指位条染色体DNA分子条DNA分子基位置排列关系种情况时特称线性（Synteny）
二指物种相关染色体DNA分子间基排列序致性
三指位DNA分子转录RNA分子间核苷酸碱基排列序 致性
四指位DNA分子mRNA分子遗传密码子排列序相应蛋白质肽链氨基酸排列序间致性
37 基工程诞生理基础技术基础什？
（1） 理基础：
（a） 世纪40年代明确遗传物质携带者DNA蛋白质明确基载体
（b）世纪50年代相继揭示DNA双螺旋结构模型半保留复制机理解决基复制
（c） 世纪50 世纪末60年代初相继提出中心法操子学说成破译遗传密码子解决遗传信息流基表达问题
（2） 技术基础：
（a） DNA分子体外切割连接技术
（b） DNA测序技术
（c） 基克隆载体发展应
（d）肠杆菌转化技术
（e）琼酯糖凝胶电泳技术
（f） 核酸杂交技术
38 RNA编辑（RNA editing）：
基转录加工程中会量尿嘧啶核苷酸（Us）加入前体mRNA（premRNA）核苷酸序列中premRNA核苷酸序列中删甚会发生核苷酸碱基取代反应种RNA转录成熟修饰程中发生核苷酸加入删取代现象做RNA编辑（RNA editing）
碱基饰变结果RNA转录核苷酸序列应DNA链核苷酸编码序列完全匹配饰变mRNA转译蛋白质肽链氨基酸序列结构便基核苷酸序列推导出差
39（1）微RNA(microRNAmiRNA)：
真核细胞中发现类调节型非编码蛋白质分子量单链RNAmiRNA源基组编码转录成PrimiRNA果蝇酶切割生成7080ntpremiRNA折叠成双链发夹结构进入细胞质切丁酶进步切割单链环形成21～25bp双链体(miRNA：miRNA*)分子双链体解离出单链存留链miRNA目标mRNA结合阻止翻译条消失链miRNA*降解
39（2）miRNAsiRNA较
相似点：
（1） 分子结构十分相似长度均21～25分子量RNA 5端具P基团3端具0H基团
（2） 通RISC结合方式发挥功作
（3） 终极作抑制mRNA翻译活性导致基沉默
点：
（1） 生物合成途径
siRNA外源导入双链(dsRNA)切割产生少数源dsRNA切割产生
miRNA然源基组编码转录成PrimiRNA果蝇酶切割生成7080ntpremiRNApremiRNA存回文结构折叠成双链发夹结构→输出蛋白作进入细胞质切丁酶进步切割加工成21～25bp片段单链环形成双链miRNA双链体(miRNA：miRNA*)分子解离出单链存留链miRNA目标mRNA结合阻止翻译条消失链miRNA*降解
（2）抑制翻译方式
siRNA通目标mRNA编码区中靶序列结合引导RISC复合物中切段酶靶序列中间部位切割断裂mRNA分子抑制翻译
miRNA通目标基mRNA 3UTR序列中结合位点序列互补作促mRNA失翻译活性miRNA作程中然目标蛋白质数量减少mRNA丰度没明显变化
（3）碱基互补水
siRNA靶序列间核苷酸碱基互补水达百分百完全匹配
miRNA材料源差异两种情况植物mRNA靶序列核苷酸碱基百分百完全匹配动物miRNA结合位点核苷酸碱基完全互补两者间存着干非配碱基
40 微量碱法分离纯化质粒DNA原理点：
（1）根质粒DNA染色体线性 DNA拓扑学差异质粒DNA（cccDNA）价闭合双链超盘旋构型分子DNA细胞染色体DNA细胞裂解分离程中断裂成线性DNA（LDNA）然化学质没质区高级结构拓扑学存差异
（2） 差异碱变性pH 120125高pH条件线性DNA容易变性解链质粒DNA易变性少变性
（3） 酸复性pH48条件cccDNA快复性线性染色体DNA逆变性蛋白质RNA形成沉淀物通离心LDNAcccDNA分开cccDNA清液中
（4） 酒精沉淀cccDNA 25倍95 酒精沉淀质粒DNA(浓度66沉淀)保存TE（pH8o）缓液中放置－20Co保存备
41 图示λZAP载体组成结构优点：
T3MCS T7
___________________________＼／____________________
cos_｜ ｜ ｜ pBluescriptSK噬菌粒 ｜ ｜ ___｜
｜______｜____｜________________________｜______｜__｜cos
I LacZ T
结构组成：（1）含具删特性pBluescriptSK噬菌粒
（2）pBluescriptSK噬菌粒两端具f1起始子（I）终止子（T）
（3）pBluescriptSK噬菌粒部具两端带T3T7启动子克隆位点MCS
（4）pBluescript部带缺陷LacZ基
（5）该载体两端具cos末端
λZAP特点：
（1）种具删特性插入型λ噬菌体载体
（2）克隆10kb外源DNA
（3）外源DNA插入取读码结构正确表达出融合蛋白质抗体筛选
（4）外源DNA插入克隆位点β半乳糖苷酶失活Xgal显色组织化学筛选重组子（白色重组子）
（5）克隆外源DNA体pBluescript噬菌粒删省常规亚克隆
（6）利T3T7噬菌体RNA聚合酶方便制备外源插入DNA条链mRNA
删源理：含外源DNA插入重组λZAP载体感染肠杆菌F＋菌株辅助噬菌体M13（f1） 超感染细胞辅助噬菌体基Ⅱ提供反式作蛋白质便会识位λZAp载体f1起始子终止子终导致含外源DNA插入pBluescript噬菌粒体λZAP载体删终辅助噬菌体M13蛋白质包装成单链DNA噬菌体颗粒挤出寄细胞
42 M13克隆体系中β半乳糖苷酶Xgal显色原理
M13克隆体系包括M13克隆载体M13特殊寄菌株两部分组成β半乳糖苷(LacZ)四聚体时具活性色Xgal切割成半乳糖深蓝色靛蓝Xgal作β半乳糖苷酶活性种指示剂LacZ基分子量太基互补作原理利基工程方法编码样蛋白质肽链序列具突变序列种载体转入特殊寄菌株中便组成具功活性肽生化程根原理M13克隆载体种LacZ－HindⅡ片段具β半乳糖苷酶第292位氨基酸肠杆菌F子带缺失第1142位氨基酸缺陷性LacZ(简称M15基)M13载体感染种M13特殊寄菌株JM101便会产生具功活性β半乳糖苷酶含指示剂Xgal诱导物IPTG培养基中会出现蓝色噬菌斑外源基插入M13克隆载体时法形成四聚体具活性LacZ切割Xgal白色噬菌斑重组子
43 DNA标签法分离产物未知基原理步骤
根DNA插入突变作原理已知插入序列探针分离产物未知基方法插入DNA序列知目基加标签 称DNA标签法
步骤：（1） 段特定DNA标签序列插入野生型基部附位点时便会诱发该基发生突变形成突变体（2） 已知标签序列作DNA分子探针突变体基组DNA文库中筛选出突变基（3） 利筛选突变基标签序列外序列作探针野生型基组DNA文库中筛选出目基
44 克隆真核基肠杆菌表达体系优点条件
肠杆菌表达体系优点：
（1） 背景知识清楚分子生物学遗传学基础研究特表达调控知识丰富
（2） 具完善安全基工程体系包括安全寄菌株载体系统
（3） 早期转基表达调控研究扎实许基胰岛素基生长素基等肠杆菌中高效效表达
（4） 易工业化批量生产培养方便操作简单成低廉特药蛋白 发酵生产
实现真核基肠杆菌中效表达条件：
（1）真核基编码序列必须连续cDNA原核细胞中具备剪辑加工酶
（2）原核启动子诱导型强启动子
（3）融合蛋白质形式表达稳定性
45酵母 双杂交体系原理途什？
酵母双杂交体系简称Y2H世纪90年代初转录子结构基础发展出种敏感体鉴定基方法效分离知靶蛋白相互作种蛋白质编码基分离某种特定启动子调控元件结合特异性转录子效手段
许真核生物转录子样酵母β半乳糖苷酶转录子GAL4含两结构分开功相互独立结构域DNA结合域(DNA_BD)转录激活域(AD)应DNA重组技术GAL4转录子两结构域分开果放置酵母细胞中产生GAL4 DNABDAD肽彼间会直接发生相互作具转录子功活性法激活相关基转录应DNA重组技术两分开GAL4 DNABDAD甚分两转录子DNABDAD重组成转录子(空间彼)重新获转录子功活性激活相关基转录酵母双杂交体系根种原理建立
酵母双杂交体系包括两种肠杆菌酵母菌穿梭载体种特殊缺失源GAL4转录子酵母寄菌株
第种穿梭载体DNABD质粒载体：
具色氨酸合成酶基知靶基正确读码结构取插入该载体克隆位点便GAL4 DNABD肽形成第种杂种蛋白(X)
第二种穿梭载体AD质粒载体：
具亮氨酸合成酶基（leu）构建cDNA表达文库专载体克隆cDNA片段正确读码结构取插入该载体克隆位（构成cDNA文库）cDNA编码蛋白质便GAL4AD肽融合成第二种杂种蛋白（Y）
酵母寄菌株：
述两种杂种质粒转化酵母双杂交体系专寄菌株特点：（1）种菌株丧失源GAL4转录子力（2）具LacZhis3报告基（3）具trpleu转化标记缺少TrpLeu缺陷性培养基法生长
转化酵母细胞涂布缺少亮氨酸(Leu）色氨酸（Trp）SD培养基果笫种质粒表达靶蛋白第二种质粒表达cDNA文库编码种蛋白质发生相互作样DNABDAD会空间彼具色氨酸亮氨酸编码基缺陷性选择培养生长便构成功活性GAL4转录子启动游报告基LacZ表达含Xgal诱导物IPTG条件β半乳糖苷酶Xgal切割选择出蓝色阳性克隆分离含靶蛋白相互作种蛋白编码基 酵母双杂交体系产物未知基分离新基功鉴定
46表达载体组成：
（1） 原核启动子诱导型强启动子外源基蛋白表达量占总蛋白1030 果表达毒蛋白启动子应呈现低限基础转录水
（2） 克隆位点(MCS)插入外源基
（3） 抗生素抗性基作选择标记
（4） 复制起点(ori)决定外源基拷贝数
（5） 转录终止子防止启动子通读作提高蛋白质稳定性
（6） 翻译起始序列转译增强子
（7） 翻译终止子防止核糖体跳跃(Skipping)采四联核苷酸UAAU 效果更
47 简述构建cDNA克隆定义步骤优越性？
（1) 定义：cDNA克隆：mRNA出发反转录载体分子重组转化寄细胞增殖目基克隆化程称cDNA克隆理讲该生物种mRNA应克隆称cDNA文库
（2） 步骤：
第步：提取处特定发育阶段真核生物体特定器官组织中总RNA 根mRNA poly(A)尾特点Oligo(dT)柱分离纯化出mRNA
第二步：利适引物(般Oligo(dT)反转录酶获 cDNAmRNA杂合分子
第三步：碱处理降解RNaseH酶切割cDNAmRNA杂合分子中mRNA链获cDNA第链第链cDNA合成第二链cDNA
第四步：双链DNA适载体重组重组体群体导入肠杆菌寄细胞中增殖构成cDNA文库
（3）cDNA文库优点：
（a） mRNA材料出发RNA病毒特适
（b）库容量（相DNA文库15％）筛选工作量
（c） 假阳性例种mRNA应克隆
（d） 具特殊途：① 克隆真核基原核中表达需cDNA
② 核苷酸序列测定
③ 发育程中时空表达基研究分析
48 柯斯质粒载体结构特点什？
定义：柯斯质粒载体工构建带λ噬菌体cos位点Ecoli质粒复制子新型质粒载体具质粒载体特点λ噬菌体特点
结构： （a） 具质粒复制起点（ori）
（b）具干质粒载体选择记（12）
（c）具相数量质粒核酸切酶单切点
（d）具λ噬菌体cos位点
特点：（1）λ噬菌体特点：a导入寄细胞重新环化起
b体外包装转导效率提高
c法进入溶菌周期形成噬菌体颗粒
（2）具质粒载体特点：a寄细胞质粒DNA样复制
b氯霉素作扩增
c具抗生素抗性记号
（3）具高容量克隆力：限45kb限30kb
（4）带源序列质粒DNA重组
49 分叙述原核基组真核基组结构特点
（1）原核基组结构特点：
（a）高效遗传信息利率
① 没必额外重复序列极少存功冗余序列
② 基组９８％核苷酸序列编码基
③ 基排列紧凑操子基间间隔距离般超 ２０bp中存着转录起始信号终止信号
④ 存着编码序列彼重叠编码蛋白质重叠基
（b）双链ＤＮＡ编码功
（c）基聚集排列成操子结构形式
（d）染色体基组拷贝数均细胞11条富裕培养基中高达3～4条
（2）真核基组结构特点：
（a）包装成特定染色体结构
（b）基组倍性
（c）具量重复序列
（d） 高例非编码DNA序列例非编码序列占基组总长98蛋白质编码基序列基组总长2包括基基间非编码DNA序列基部非编码DNA序列
（e） 庞基数量
拟南芥：25000左右水稻：40000左右鼠：30000左右类：24000左右
（f）基分布密度均基分布富集区荒漠区分
50 基克隆？实验步骤
定义：基克隆DNA克隆指外源基插入适克隆载体形成重组DNA分子群体转化肠杆菌寄细胞中进行复制繁殖便分子DNADNA片段中分离纯化出目基特定DNA片段实验操作做基克隆DNA克隆
步骤：
（1） DNA片段化：实验材料分离纯化基组DNA机械方法酶
消化超声波等方法获定长度DNA片段
（2） 体外重组：片段化DNA适载体分子重组
（3） 重组子转化：重组子转入适寄菌株中进行增殖
（4） 重组子筛选：量转化细胞中筛选阳性克隆重组子
（5） 目基分离：种酶切走凝胶电泳探针进行杂交分离出目基DNA 克隆M13载体进行测序
(6） 目基表达功鉴定
51 DNA转录复制差？
基转录复制程生物化学酶学方面十分相似二者特核酸酶RNA聚合酶DNA聚合酶催化合成出条DNA模板链互补新核苷酸链基转录（RNA合成）基复制（DNA合成）间然存着方面差：
（1）引物需求 基复制中需时存模板链引物DNA聚合酶启动DNA新链合成基转录需引物RNA聚合酶便启动RNA新链合成
（2）底物样DNARNA分子核苷酸组成成分基复制转录底物样：前者脱氧核糖核苷三磷酸：dATPdGTPdTTPdCTP者核糖核苷三磷酸：ATPGTPTTPCTP
（3）模板结合状态异基复制半保留方式进行新生成两条子代DNA分子中新生链模板链始终结合起基转录新合成RNA链终模板解离
（4）精确性程度差异悬殊基转录程中错误参入RNA链核苷酸频率10－4说参入10000核苷酸会出现错误（万分错误率）基 复制核苷酸错误参入频率10－7说参入10000000核苷酸仅出现次错误（千万分错误率）说DNA复制精确度超转录1000倍
（5）涉范围基复制整基组头尾逐步进行涉范围包括整基组中DNA基基转录涉范围复制通常基操子
52 基扩增方式？
基扩增指某种基拷贝数增现象
方式：（1）利PCR 技术某基拷贝数增
（2）隆基导入寄细胞量繁殖基扩增(单拷贝基扩增约1x106拷贝)
（3）环境压力影响某种基适应性扩增
（4）程序性基扩增非洲爪蟾形成卵发育程中rRNA量扩增
（5）生物进化程中某种基扩增
53真核基原核基表达调解机理差异
（1）源细胞结构水差异真核细胞转录翻译分细胞核细胞质中分开进行没涉mRNA运送程调节原核细胞转录翻译细胞质中偶联发生
（2）源染色体结构水差异真核细胞基组包装成染色体存细胞质关蛋白质子（TF）进入细胞核必须克服染色体层层屏障式元件结合
（3）源基排列结构差异真核基单反子断裂基转录加工复杂原核基反子转录加工简单
54 说明mRNA差显示分离产物未知基基原理评述优缺点
答：（1）mRNA差显示：建立基差表达理基础通较体体组织发育阶段间mRNA种差应反转录PCR技术发展出种分离产物未知基方法mRNA差显示反转录PCR简称DDRTPCR
（2）原理：根真核基3端mRNA分子poly（A）尾巴前2位碱基mRNA分子分成12种类群1碱基分3类群根3端锚定引物5端设计机引物数理统计推算实验验3种锚定引物80种机引物(3×80＝240）240组合体涵盖95mRNA
（3）mRNA差显示优点：
（a）简单方便PCR扩增序列胶电泳技术简单快捷
（b）灵敏度高实验利PCR技术序列电泳技术位素
影技术具极高灵敏度
（c）性时较样品间基表达差异④直观性步骤均直观检测
（4）mRNA差显示缺点：
（a）假阳性率高
（b）扩增片段分子量较
（c）工作量
55 影响酶切反应素：
答：（1）DNA分子性质：（a）酶切位点周围碱基成分
（b）酶切位点密度
（c）DNA分子构型
（d）NA分子甲基化程度
（2）酶切温度
（3）DNA制剂纯度
56 产生酶切星号活性素：
（1）μg样品酶切量超10单位
（2）酶切反应体系中甘油浓度超5
（3）金属离子取代二价Mg
（4）金属镁离子低25mmolL
（5）pH超8
（6）样品中机溶剂污染影响
57 种基产生种蛋白质原分析
答：（1）原：（a） 许基拥启动子类基组中少半基具启动子真核断裂基转录程中变启动子常常涉位转录起点变首位外显子（alternative first exon）变启动子成员驱动相应变首位外显子开始转录反应已基变首位外显子作全阵列（whole arrays）分析结果证明变首位外显子具身专启动子变首位外显子产生蛋白质产物
（b） 初级转录变剪接产生种蛋白变剪接（alternative splicing）称差异剪接（differential splicing）变mRNA剪接指真核断裂基初级转录类型处发育阶段细胞中发生形式剪接作结果生成具序列结构特征编码蛋白质异形体成熟mRNA分子说变剪接基初级转录终翻译出种功蛋白质分子果蝇Dscam基例形成38016种蛋白质异形体见变剪接造成种基种蛋白质现象种重原
（2）次原：（c） RNA编辑致mRNA分子核苷酸序列结构出现变化种RNA编辑具种效应诸产生出新起始密码子终止密码子造成肽链编码序列出现变化RNA编辑结果改变源基DNA模板链遗传信息翻译出基原编码新蛋白质肽
（d） 基重排均产生蛋白基区段转位作机连接造成基变区固排列序改变基重排（gene rearrangement）DNA重排基产生蛋白
58 控制真核基表达调节方式：
（1）基重排调节方式
（2）基扩增调节方式
（3）基调节蛋白质转录调节方式
（4）RNA加工调节方式
（5）核质mRNA转调节方式
（6）mRNA稳定性调节方式
（7）mRNA翻译调节方式
59 真核基表达调节特点：
（1）真核生物原核生物基表达调节方面相似性已知少肠杆菌中出现调节机理原适真核生物例：i 两者转录调节通DNA结合蛋白质基启动子中特异性式元件结合作进行ii 两者DNA结合蛋白质肽基序序列结构相
（2）真核生物原核生物基表达调节方面差异性：i 真核生物细胞类型样性原核相特高等植物动物具数百种功异细胞类型ii真核生物具细胞核结构基转录翻译分细胞核细胞质中分步进行iii真核生物具庞基组 长度超原核700倍iii真核生活物基拥量种类型基总数达数万种相原核生物20倍
（3）真核基表达调节方面原核基相复杂性特殊性：i发育调节基表达发育阶段性调节器官组织特异性调节ii分化调节受精卵究竟分化出具特定功形状态特征类组织器官细胞？iii表达序性复杂细胞生命体中基表达序性调节机理iv生命体中细胞间生命活活动间协调相稳定性息样维持v选择性表达相基组什红细胞前体中会选择性表达编码血红蛋白基胰腺细胞中选择性表达胰岛素基种精确控制基差异表达分子机理解释呢？
(2014412北京学生命学院黄美娟提供)
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