备案号 27441999
中 华 民 国 行 业 标 准
蛋 白 酶 活 力 测 定 x 10317 1创
Z B X 6 603 0 8 7
M easu rem en t o f pro tein a se activity
方法适酿造酱油时制品菌种成曲蛋白酶活力测定
福林法
1 1 试剂溶液 试剂分析纯
1 11 福林试剂 (Folin 试剂}20OOm L 磨口回流装置加入钨酸钠(NapW O 2H O ) 100g
钥酸钠 (N aM oO ·2H O ) 25g 蒸馏水700m L 850o磷酸50m L浓盐酸100m L 文火回流loh取
冷凝器加入硫酸铿 (Li04) 5馆蒸馏水50m L 混匀加滴液体澳煮沸15m in驱逐
残澳颜色溶液应呈黄色非绿色溶液绿色需加滴澳液煮沸冷
定容1000m L细菌漏斗 〔N o4^ 5)滤置棕色瓶中保存溶液时加2倍蒸馏水
稀释成已稀释福林试剂
1 1 2 0 4m ol碳酸钠溶液 称取水碳酸钠 (N aCO O 4248 定容 1000m L
1 1 3 0 4mol三氯乙酸 (TCA ) 溶液 称取三氯乙酸 (CCLCO OH ) 654g定容1000mL
114 pH7 2磷酸盐缓液 称取磷酸二氢钠 (NaH 2PO4·214 0 ) 31跄定容1000m L成
0 2mol溶液 (A 液)称取磷酸氢二钠 (N aH PO·12H}O ) 7163g定容1000m L成0 2m ol溶
液 (B 液)
取 A 液 28m L B 液 72m L 蒸馏水稀释 1 倍成 0 lm ol pH 7 2 磷酸盐缓液
115 2 酪蛋白溶液准确称取干酪素第称准0 0028加入0 1N 氢氧化钠l Om L 水浴中
加热溶解 (必时火加热煮沸)然pH7 2磷酸盐缓液定容l OOm L 成配制应
时放入冰箱保存否极易繁殖细菌引起变质
1 1 6 100pgm L 酪氨酸溶液 精确称取105℃烘箱中烘恒重酪氨酸100馆逐步加入
6raLlN 盐酸溶解0 2N 盐酸定容JOOmL 浓度1000pgm L吸取液l Om L 0 2N
盐酸定容100m L配成100pgm L 酩氨酸溶液溶液配成应时放入冰箱保存
免繁殖细菌变质
12 仪器
a 分析天 感量 0 lm g
b 581G 型光电色计72 型分光光度计
c 水浴锅
d1 2 5 100m L 移液等
1 3 操 作
国欢国搜易局19990415批准 9990415 实施
2 30S B 11 1璐171创冷
131 标准曲线绘制
1311 表配制种浓度酪氨酸溶液 (表 1)
表 1 配制种浓度酪氮酸溶液
试 剂
号
1 2 3 4 5 6
蒸馏水 L
100pgm L 酪氨酸 m L
酪氨酸终浓度pgm L
1 0
0
0
8
2
2 0
6
4
4 0
4
6
6 0
2
8
8 0
0
1 0
10 0
1312 测定步骤取6支试编号表1分吸取浓度酪氨酸1mL 加入0 4m o1碳酸钠
5m L加已稀释福林试剂1m L摇匀置水浴锅中40℃保温发色20m in 581 G 型光电
色计分测定光密度 (O D ) (滤色片 65) 72 型分光光度计进行测定 (波长660nm )般测
三次取均值 1^6 号测光密度 (O D ) 减 1 号 (蒸馏水空白试验) 测光密度
净OD 数
清楚起见列出表格 (表 2)
表 2
试 剂
号
1 2 3 4 5 6
表 1 制备浓度酪 氨酸m L 1 1 1 1 1 1
0 4m o1L N a2C 0 � m L 5 5 5 5 5 5
福林 试剂m L ’ 1 1 1 1 1 1
O D 值
1
2
3
均
净 O D 值 0
净O D 值横坐标酪氨酸浓度坐标绘制成标准曲线 (求出度O D 相酪氨
酸量K )
132 样品稀释液制备
1321 测定酶制剂称取酶粉100g加入pH7 2 磷酸盐缓液定容100m L吸取液5m L
缓液稀释 25m L 成 5000 倍酶粉稀释液
1322 测定成曲酶称取充分研细成曲5g加水100m L 40℃水浴间断搅拌lh滤
滤液0 lm olpH 7 2磷酸盐缓液稀释定倍数 (估计酶活力定)
133 样品测定 取15 X 100m 试3支编号1 2 3 (做2 )加入样品稀释掖
1m L 置 40℃水浴中预热 2m in 加入样预热酪蛋白 1m L 精确保温 l Om in 时间
立加入 0 4m ol三氯乙酸 2m L 终止反应继续置水浴中保温 20m in 残余蛋白质沉淀
离心滤然取 15 X 150m m 试 3 支编号 l 2 3加入滤液 1m L 加 4m ol碳
酸钠5m L已稀释福林试剂1m L 摇匀40℃保温发色20m in 进行光密度 ((OD ) 测定
23 1S B T 10317181均
空白试验取试3 支编号 (1) (2) (3) 测定方法唯加酪蛋白前先加0 4m ol三
氯乙酸 2m L 酶失活加入酷蛋白
清楚起见分列出表格 (见表 3 表 4)
表 3
试 剂
号
试 剂
号
1 2 3 (1 ) (2) ( 3 )
预热酶液m L 1 1 1 预热酶液 m L 1 1 1
预热 2 酪 蛋白m L 1 1 1 4m 1三氯 乙酸m L 2 2 2
作 10m in (精确计时) 作 l Om in (精 确计 时)
0 4m o1 三抓乙酸 m L 2 2 2 预热 2写酪蛋白 L 1 1 1
表 4
试 剂
号
1 2 3 (1) (2) (3 )
滤 液 L I 1 1 1 1 1
04m o1 N a2C O 3 m L 5 5 5 5 5 5
福林试 剂m L 1 1 1 1 1 1
O D 值
均 O D 值
净 O D 值 0
样品均光密度 (O D ) 空白均光密度 (O D ) 二净O D 值
14 计算
40℃分钟水解酪蛋白产生 lug 酪氨酸定义 1 蛋白酶活力单位
_ _~ _ _ A _ 1
砰重曰附沽刀单仅 l十量) X 4 X IV X 玉 少 I U 工 — 1 1
式中 A — 样品测 O D 值查标准曲线相酪氨酸微克数 ( O D 值X K )
4 4 毫升反应液取出 1m L 测定 ( 4 倍)
N 酶液稀释倍数
10— 反应10min
W — 样品水分百分含量
15 注意事项
介绍方法测定中性蛋白酶 (pH 7 2)测定酸性蛋白酶碱性蛋白酶配制酷
蛋白溶液稀释酶液pH 缓液换成相应 pH 缓掖现种常pH 缓液配方提供

15 pH 7 5 磷酸盐缓液 (0 02m o1L )
称取磷酸氢二钠 (N a2H P0 · 12H 20 ) 602g 磷酸二氢钠 (N aH 2PO · 2H 20 ) 05g 蒸馏水溶
23 2S B 胭 10917 186 8
解定容1000mL e
152 pH 2 5 乳酸乳酸钠缓液 (0 05m ol )
A 液 称取80 90 乳酸10 6g加蒸馏水稀释定容1000mL o
B 液 称取70肠乳酸钠16g加水稀释定容1000m L o
取A 液16m L B 液1mL 混合稀释倍成
153 pH 30 乳酸乳酸钠缓液 (0 05m ol )
A 液 称取 80 90 乳酸 10 6g 水定容 1000m L e
B 液 称取70 乳酸钠16g 蒸馏水溶解定容1000m L o
取A 液8m L B 液1m L 混合稀释倍成
1 5 4 pH 10硼砂氢氧化钠缓液
A 液 称取硼砂 19 08g 蒸馏水溶解定容 1000m L (005m ol)
B 液 称取氢氧化钠 8g 蒸馏水溶解定容1000m L (02N )
取A 液250m L B 液215m L 混合蒸馏水稀释定容1000mL 成
155 pH 110硼砂氢氧化钠缓液
A 液 称取硼砂19 08g蒸馏水定容1000mL
B 液 称取氢氧化钠4g蒸馏水定容1000m L
取 A 液B 液等量混合
156 2 酪蛋白溶液配成酸性时须先加数滴浓乳酸湿润加速溶解
2 甲醛法
成曲蛋白酶活力测定福林法测确困难时甲醛法测定作渡
21 仪器 _
a 分析天 感量01g
b 水浴锅
c 电烘箱
d 容量瓶吸滴定等
22 试剂溶液
a 1写酚酞指示剂
6010o庸香草酚蓝
c 0 1N 氢氧化钠液甲醛 (试剂配制法氨基态氮测定见GBT 5009391996氨基态氮测定
法
23 操作
231 目测法
称取研细均匀成曲样品1鲍放250m L 锥形瓶中加55 `C 温水80m L 充分摇匀置55)C
水浴锅中保温3h取出加热煮沸破坏酶活力冷定容100mL 充分摇匀脱脂棉滤吸
取滤液l Om L 移150mL 锥形瓶中加水50m L 1 酚酞指示剂2mL 0 1 N 氢氧化钠标准溶
液滴定刚显微红色 (pH 8 2)记滴定数作总酸继续加甲醛l omL 1N 氢氧化钠液滴定
深红色 (pH 8 5 ) 终点加庸香草酚蓝lm L 作指示剂滴紫红色终点记滴定数减
空白数计算成氨基态氮称取曲log做水分折算成干基数
232 酸度计法
仪器药品操作方法等氨基态氮测定法(见GBi T 5009391996 )o
24 计算
23 3B IT 103171989
蛋白酶活力 (克氨基态氮1009) (干基)
(V ＇V o) X N X 0 0 14
l o x _10100 _100X lW ········ (2)
式中 V — 加入甲醛氢氧化钠标准液滴定数m L
V o — 甲醛空白滴定数m L
W — 曲水分
N 氢氧化钠标准溶液量数N
0014 氮毫克量数
附加说明
标准国家国贸易局提出
标准海市酿造科学研究起草
标准起草须凤高
法 实质 定温度 定时 间 成曲利 身蛋 白酶 身原料 中蛋 白质水解 成氨 基酸 测 定氨基 态氮橄
衡量蛋白酶活力数值 培养堆放程 环境温度身含水分已少量氮基酸生成福林法酶活力进行
空白试验扣课差方法取曲样开始时成曲酶活杀灭余操作步软完全相 杀酶方法煮沸蒸馏
水 70m L 倾入log 成曲中马继续成曲液煮沸分钟余操作样品成曲甲醛空白起算成 V
2 34

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