重组表皮生长子原液车间工艺设计
重组表皮生长子原液车间工艺设计
摘
表皮生长子（hEGF）分子肽含53氨基酸PI46分子量约6000DahEGF中通常三二硫键极端素具抗性hEGF生物学功例够促进皮肤生长治疗种创伤眼角膜损伤效果EGF化妆品行业应广泛起美白皱抗皮肤老化作20世纪80年代前没hEGF进行规模工业化生产生物提取纯度低成高20世纪80年代科学家通基工程改造肠杆菌酵母菌等菌种实现hEGF工业化生产该设计生产程肠杆菌作宿细菌应高密度发酵技术通蛋白质纯化技术规模生产rhEGF储备液
该设计结合中国重组蛋白药物实际情况查阅许文件标准完成工艺流程图车间设计计算物料热衡进行关键设备设计选择
关键词：重组表皮生长子高密度发酵工艺车间设计
Process design of recombinant human epidermal growth factor stock solution workshop
Abstract
Human epidermal growth factor (hEGF) is a small molecular peptide composed of 53 amino acids with a molecular weight of about 6000 Daltons and an isoelectric point of about 46 There are three pairs of disulfide bonds in the molecule so it is physical chemical and acidic The factors are relatively stable hEGF has a wide range of biological effects and can strongly promote the growth of various epidermal tissues It has been used in medicine to treat burns ulcers various types of trauma and corneal injuries EGF can also promote the metabolism of normal epidermal cells Adding it to beauty skin care products can achieve whitening antiwrinkle and antiaging effects Before the 1980s the source of hEGF was mainly through tissue and body fluid extraction Due to the extremely small content of hEGF the extraction cost was high and the purity of the product was low which limited the application of hEGF Since the 1980s with the development of genetic engineering technology people have achieved success in the production of hEGF through genetic recombination technology using E coli yeast etc which has laid the foundation for the industrial production of genetically recombinant human epidermal growth factor Therefore the production process in this design uses E coli as the host strain applies highdensity fermentation technology and produces rhEGF stock solution on a large scale through protein purification and other technologies
This design combines the actual situation of recombinant protein drugs in China After consulting a large number of documents and standards the process flow drawing and workshop design have been completed the material balance and the heat balance have been calculated and the design and selection of the main equipment
Keywords Human epidermal growth factorHigh density fermentation processWorkshop design
目录
1绪 4
11hEGF概况 4
12hEGF结构 4
13EGF生物学效应应 5
131EGF生物学效应 5
132hEGF应 6
14高密度发酵工艺简介 6
141培养基 7
142 pH值 7
143温度 7
144溶解氧 7
145诱导条件 8
146接种量 8
147补料 8
15国外hEGF产业化现状 8
16发展前景 8
17设计意义目 9
2 hEGF生产工艺 9
21种子扩培养发酵 9
22发酵液纯化 9
23培养基配方 10
231LB培养基配方 10
232发酵培养基配方 10
233补充培养基配方 11
3物料衡算 11
31工艺基础数 11
32发酵罐物料衡算 11
33种子罐物料衡算 12
34发酵设备参数表 13
35原材料消耗计算 13
351LB培养基消耗计算 13
352发酵培养基消耗计算： 14
353补充培养基消耗计算 15
354物料总 15
36纯化工段 16
361发酵液预处理 16
362 Ni Sepharose亲层析 16
363 Source 15RPC反相层析 16
364 Source 30Q离子交换层析 17
365磷酸缓溶液配方量 17
4热量衡算 17
41发酵热计算 17
42蒸汽消耗量计算 18
43菌空气消耗计算 19
5型设备选型 20
51发酵罐选型 20
52层析系统选型 21
53层析柱选型 22
531亲层析柱选型 22
532反层析离子交换层析柱选型 23
54高压蒸汽灭菌锅选型 23
541双扉式干热灭菌柜选型 24
542湿热灭菌器选型 24
55离心机选型 25
551型冷冻离心机选型 25
552三足离心机选型 25
6车间总体布局 26
61车间组成 26
62车间布置原 26
参考文献 28
附录 29
1绪
11hEGF概况
科学家通研究鼠类颌腺分离发现种肽取名表皮生长子（EGF）相分子量约604KD该肽生长子称表皮生长子促进鼠眼睑早期张开牙齿早期萌芽直接刺激表皮增厚角化 研究员首次提取纯化hEGF类尿液中发现种肽够促进种细胞增殖促进表皮生长血生长抑制胃酸分泌科学家种肽进行测序发现53氨基酸组成hEGF胃肠道保护免疫性皮肤疾病伤口组织修复愈合密切相关[1] hEGF具广阔床应前景烧伤角膜抑制美容治疗hEGF众生物学效应具高价值
12hEGF结构
通分析hEGF基序列发现体编码hEGF基位3号4号染色体编码hEGF区域23含子24外显子[2]hEGF前体种组成细胞膜蛋白质身种生物学功例刺激体细胞增殖识特异性受体
图1示hEGF具三二硫键包含糖基具强抗性易蛋白酶水解肽两端固定N末端受体特异性结合时候发挥关键作中间变区C末端结构域促进细胞增殖功中重研究表明hEGF生物活性核心位三二硫键间构成生物活性需受体结合域
图1hEGF分子级结构
13EGF生物学效应应
131EGF生物学效应
EGF广泛存体部位行生物学功体腺体滋养层细胞够物质结合影响生物体生命活动EGF生物活性分短期效应长期效应（1）短期效应：EGF够接触短短分钟促进抑制细胞膜离子通道活性细胞中磷酸代谢（2）长期效应：细胞接触EGF够促进细胞遗传物质合成提高种酶活性增加种结构蛋白合成骨骼形成
EGF许生物学功叙述[3]：
1EGF够加快体细胞增殖遗传物质合成够加快肺生长分化种广谱促分裂原组织成熟生毛囊细胞鳞状细胞癌细胞具抗增殖作够促进种非创伤愈修复植皮烧伤手术创口等眼角膜移植起关键作EGF体物质功修复例修复胃肠道系统溃疡作注射起观疗效副作会引起体白细胞升高许门诊患者治疗神胶质瘤hEGF毒素乳腺皮肤肿瘤已达特定效果
伤口愈合复杂生物学程步骤炎症清细胞分裂血生成EGF程中够起促进创口修复作时成纤维细胞血皮细胞中促分裂原细胞分裂信号触发覆盖伤口区域时够促进种结构蛋白生成加快创口愈合EGF细胞修复作浓度呈抛物线关系EGF够促进种细胞组织修复增值收广泛关注科学家床实践中EGF作营养子促进神系统发育
2 EGF促进种离子运输交换够肝细胞中钙离子浓度升高调节血糖浓度调节前列腺素合成成骨细胞破骨细胞生物学活性消化系统钙吸收
3甲基胆蒽遇EGF时致癌效果会放增强种脱羧酶活性抑制胃肠道系统活性促进肝脏细胞脂肪细胞生成
4胶原酶够促进创口愈合某细胞生长EGF够加强体胶原酶活性
5EGF常常作组织培养基中成分 EGF改变细胞特性增加胶原细胞中角蛋白成分产生刺激绒毛膜促性腺激素分泌拮抗甲状腺刺激激素 EGF调节细胞外液纤溶酶原激活剂（PA）癌细胞发生变性
6EGF含三二硫键抗性强进入消化系统够抑制胃酸分泌刺激遗传物质合成加快血流量修护消化系统粘膜等
体EGF细胞特异性结合够加快增殖修复消化系统愈合程中分泌唾液胃液中EGF含量高表明EGF够修复消化系统溃疡
132hEGF应
1321基础研究方面
EGF组织培养基中必少成分探索细胞调节机制重成分促进科学家癌细胞发生研究[4]
（1）hEGF够促进体种细胞生长例皮细胞结缔细胞等加速烧伤创伤伤口愈合
（2）hEGF够促进眼角膜移植术愈合生长等生物学功创伤性角膜溃疡角膜溃疡角膜损伤角膜化学物质烧伤治疗具重意义促进生长 眼角膜移植手术愈合加快
（3）EGF具修复加快消化道溃疡愈合hEGF正研究治疗类胃肠道溃疡
（4）年量hEGF毒素组合适治疗肿瘤皮肤癌乳腺癌等方面发挥定作 古巴科学家9例鳞状细胞癌患者皮肤鳞状细胞量hEGF软膏（10ug g）治疗3周6名病癌症明显改善
1322畜牧业
EGF作饲料添剂加入动物饲料中
14高密度发酵工艺简介
年着基工程工业培养技术日益成熟生物发酵技术医药制品中广泛应表达迄止法种表达系统中获量蛋白质进行蛋白表达时通常会选择细胞结构相简单遗传背景清晰繁殖快生物常肠杆菌作发酵工程菌肠杆菌发酵时常常会高密度发酵技术相联系[5]
高细胞密度培养（HCDC）定培养环境中获细胞数达目标产物数量 意味着正常培养相某培养技术设备增加细菌细胞发酵密度显着提高细菌细胞密度提高相关产品表达量般认高密度发酵细胞培养基中密度达超50gL技术仅节省培养基分离纯化简化降低生产成周期提高生产效率
通常规模发酵生产实验室阶段开始包括种子复苏逐级扩培养直罐发酵逐级扩时肠杆菌表达目蛋白量低达量提取目蛋白目规模生产时必须发酵培养物获更高产量正常发酵培养物摇瓶培养物产生更物质公司济成代价存量浪费需高密度发酵降低游生产成通常许素会影响高密度发酵例细胞生长需营养面讨影响高密度发酵关键素[6]
141培养基
培养基分合成培养基半合成培养基复合培养基培养基选择肠杆菌高密度发酵中起着重作培养基营养源碳源氮源源碳氢氧氮硫磷6种元素外培养基中需添加微生物生长必需生长子维生素氨基酸等[7]
常碳源糖脂肪机酸 中葡萄糖生产中广泛 特异性低效提高肠杆菌生长速度方便测试中间产品 应根细菌消耗量添加培养程中添加葡萄糖量 葡萄糖含量会加速乙酸代谢合成 乙酸会抑制目蛋白生成
氮源分机机发酵程中消耗氮源通常机机机氮源重作促进细菌旺盛生长培养基中氮源碳源例宜高否微生物细胞会发酵初期迅速生长发酵期生长速率会提高代谢废物逐渐积累细菌液体粘度增加会影响溶解培养基中氧气量果溶解氧量减少整培养程变异常目标产品表示会受影响整产品批次终会失败高密度发酵程中考虑养分添加
钙离子镁离子钾离子钠离子常见机盐离子维持微生物生长重元素进行发酵时应该考虑适添加机盐离子实验表明肠杆菌发酵肿瘤坏死子中菌种受磷酸盐浓度影响磷酸盐浓度015M时适少会影响目蛋白表达
肠杆菌生长时会产生种次生产物会目蛋白起抑制生成作二氧化碳含光合作生物说种剧毒物质会细菌进行氧发酵产生酸引起酸中毒干扰肠杆菌细胞生长正常代谢活性
142 pH值
细菌生长程中适pH值细菌保持强劲生长乙酸等机酸会高密度培养程中碳源浓度高时生成时培养基环境发生变化产品法正确表达 发酵程控制中通添加酸碱调节培养基pH值确保细菌处适pH值范围避免生长程中pH值急剧变化引起利影响影响细菌新陈代谢
143温度
种微生物发酵程中适宜生长温度适宜温度细菌够快速繁殖产生目蛋白
144溶解氧
影响氧微生物生长重素溶解氧通常细菌指数期时需消耗量氧气培养基中溶氧量非常低 切断氧气供应发酵液中氧气会快消耗掉杀死细菌 发酵结束时反应器中细胞密度增加发酵液变粘 生物反应器供氧力限发酵液中氧浓度低界值 氧溶解传递细菌生长中起着限制作
145诱导条件
目标产物表达通常涉诱导环节转基细菌需早期构建程中添加强诱导启动子通种方式细菌预培养分两步骤：细胞生长产物表达生长程旨增加细胞密度表达程旨获更目标产物强启动子表达外源基时宿细胞承受该外源基高效表达影响细胞生长影响目标产物质粒肠杆菌发酵程中常诱导剂异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）[8]
146接种量
种子液体积培养液体积接种量决定细菌培养基中生长速率生长周期
接种量增加导致营养素更充分利较短孵育时间 种子含许水解酶代谢产物进入合成早期阶段 果接种量高细菌早期阶段生长快增加营养消耗减少溶解氧导致细菌溶 接种物太会增加生长速率细菌数生长期长度微生物生成目蛋白实际发酵程中根具体情况确定接种量
147补料
菌种发酵会量消耗培养基中营养物通常分批进行营养补充 前生产程中常批量进料方法 通常反馈法非反馈法进行菌体发酵时补料
15国外hEGF产业化现状
二十世纪九十年代开始hEGF直科学家研究热点rhEGF具许生物学功1988年瑞士生产种 Gentel药品眼睛疾病许国公司生产出许含hEGF美容品 Eurekaep1 外中国科学院暨南学海生物化学研究中国医学科学院等基础医学专业毕业生国家八五计划九五计划方面取进展 带领 年度计划中许产品获国家I类新药证书[9]
16发展前景
EGF真正解1940年1980年左右着基工程技术发展科学家开始进行研究1990年熟练掌握rhEGF生产工艺技术面进步研究成两方进行关转基细菌生产hEGF研究：hEGF效生产分离hEGF机理应
rhEGF规模发酵生产效率言hEGF前输出效率仅78mg Lh肠杆菌短双歧杆菌表达系统 1999年hEGF香港市场价格然高克210102万美元 rhEGF分离纯化观点分泌重组细菌中分离hEGF具许步骤低产率（通常总产率20％40％）寻求 高度分离rhEGF方法亲吸附分离方法必 外分离发酵集成化中优化培养基减少污染蛋白质分离干扰新颖想法
hEGF分子生物学角度hEGFhEGFR作机理外源性hEGF源性干预机理组织修复生理规律然准确 hEGFEGFR肿瘤饱度反馈调节机制：hEGF早期胚胎发生调节间关系
hEGF应观点目前局部药物研究hEGF药代动力学药代动力学药理学没研究口服hEGF药物研究少[10]
17设计意义目
重组表皮生长子众功rhEGF需求增加需规模生产rhEGF设计目设计生产rhEGF原液车间设计种子扩培养发酵纯化物料衡算设备选型车间设计等
2 hEGF生产工艺
21种子扩培养发酵
级种子培养分取08ml4ml甘油冻存工程菌接种5装400mlLB液体培养基1L摇瓶中37℃220rpm振荡7时(级种子培养时间)测OD6002停止培养级种子培养液
级种子培养液10％接种量接种20L含LB液体培养基50L种子罐中37℃转速150rpm~250rpm培养12时(二级种子培养时间)测OD6003 5停止培养二级种子培养液
二级种子培养液10％接种量(二级种子培养液接种量)接种含160L培养基200L发酵罐中37℃氨水pH调节6 8保持转速150rpm~250rpm发酵期间添加成分400gL葡萄糖20gLMgSO4·7H2O补充培养基诱导前添加速度38mlLh诱导11mlL时培养8h测定发酵液OD600发酵液OD600达15时加入终浓度0 1mMIPTG开始诱导诱导2时加入终浓度体积计0 05％甘氨酸诱导10时收液
22发酵液纯化
收集放罐培养液4℃发酵液6000rpm离心30分钟收集清清液中缓慢加入硫酸铵60％饱度0 1molL HCl调节pH6 04℃静置416时12000rpm离心10分钟收集沉淀沉淀16LpH7 020mmolL磷酸盐缓液溶解溶解清液加热60℃保持30分钟然冰浴快速降温4℃离心沉淀调节样品pH80
（1）Ni Sepharose亲层析：取cytiva公司Ni Sepharose 6 Fast Flow亲层析介质该填料结合力约40mgml需填料量：
660ml填料装入常压层析柱Ni Sepharose层析柱pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积预处理清样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A280nm穿透峰弃A280nm降基线含20mM咪唑衡缓液150cmh流速洗脱目蛋白收集含rhEGF蛋白洗脱峰
（2）Source 15RPC反相层析：取cytiva公司Source 15RPC反相层析介质该填料结合力约30mgml需填料量：
880ml填料装入中高压层析柱Source 15RPC反相层析柱pH8025mmolL磷酸缓液300cmh流速衡3柱体积rhEGF Ni Sepharose洗脱液样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A214nm穿透峰弃A214nm降基线洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）洗脱杂质蛋白洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）洗脱目蛋白收集含rhEGF蛋白洗脱峰
（3）Source 30Q离子交换层析：取cytiva公司Source 30Q离子交换层析介质该填料结合力约80mgml需填料量：
330ml填料装入中高压层析柱Source 30Q离子交换层析柱pH8025mmolL磷酸缓液300cmh流速衡3柱体积rhEGF Source 15RPC洗脱样品样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A214nm穿透峰弃A214nm降基线残留乙腈完全pH3525mmolLPB缓液洗脱收集含rhEGF蛋白洗脱峰高浓度rhEGF原液
23培养基配方
231LB培养基配方
配制1LLB培养基需配方量：胰蛋白胨 10g酵母提取物 5g氯化钠 10gNaOH调节该培养基pH达74
232发酵培养基配方
葡萄糖20gL胰蛋白胨20gL酵母提取物10gLKH2PO4 3 5gLK2HPO4 5gL(NH4)2HPO4 3 5gLNaCl 1gLMgSO4·7H2O 1gL泡敌0 3mlL微量元素溶液3mlL
微量元素溶液成分：FeSO4·7H2O 0 167gLZnSO4·7H2O 0 0193gLCoCl2·6H2O 0 12gLNa2MoO4·2H2O 0 012gLCaCl2·2H2O 0 006gLCuSO4·5H2O 1 9gLH3BO3 0 5gLHCl(37％wv)37mlL
233补充培养基配方
葡萄糖400gLMgSO4·7H2O 20gL
3物料衡算
31工艺基础数
根车间生产求该车间设计rhEGF发酵液生产力周期160L根表达量150mgL全年365天放假中修理等45天全年工作日36545320天发酵106周期年产量rhEGF
32发酵罐物料衡算
设计发酵罐1200L发酵罐填料系数
物料衡算：（设损失率）
假设正确
33种子罐物料衡算
物料衡算：
34发酵设备参数表
项目
发酵罐
种子罐
V放（L）
160
1316
V0（L）
200
50
V补料（L）
2246
—
V消 （L）
13162
1253
V接（L）
14478
13783
V种子液（L）
1316
1253
V损失（L）
658
0627
V配料（L）
11264
1072
V进（L）
16724
13783
V冷凝水（L）
1898
181
周期（h）
18
12
35原材料消耗计算
该设计生产批发酵液周期154天加发酵罐清洗灭菌时间次1天254天取整3天年工作日320天进行周期发酵
351LB培养基消耗计算
胰蛋白胨：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
酵母提取物：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
NaCl：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
352发酵培养基消耗计算：
葡萄糖：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
胰蛋白胨：
周期消耗（Kg）
年消耗（Kg）：
酵母提取物：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
KH2PO4：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
（NH4）2HPO4：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
NaCl：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
MgSO4·7H2O：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）
泡敌：
周期消耗（L）：
年消耗（L）：
微量元素溶液：
周期消耗（L）：
年消耗（L）
353补充培养基消耗计算
葡萄糖：
周期消耗量（Kg）：
年消耗（Kg）：
MgSO4·7H2O
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
354物料总
物料
周期消耗
年消耗
胰蛋白胨（Kg）
242
25652
酵母提取物（Kg）
121
12826
葡萄滩（Kg）
1146
121476
NaCl（Kg）
0273
2894
MgSO4·7H20（Kg）
0573
6074
KH2PO4（Kg）
04
424
（NH4）2HPO4（Kg）
04
424
泡敌（L）
0034
3604
微量元素溶液（L）
034
3604
36纯化工段
沉淀
离心
发酵液
反层析
亲层析
加热离心
rhEGF原液
离子交换层析
361发酵液预处理
通离心处理发酵液清液查询资料：通常发酵液中含35湿菌体清液体积：
硫酸铵量：
362 Ni Sepharose亲层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时含20mM咪唑衡缓液根验值概需3倍柱体积衡缓液量：
363 Source 15RPC反相层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时分洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）洗脱杂质蛋白洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）洗脱目蛋白根验值分概需2倍柱体积
洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）量：
洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）量：
364 Source 30Q离子交换层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时pH3525mmolLPB缓液根验值概需3倍柱体积衡缓液量：
365磷酸缓溶液配方量
配制1L磷酸缓溶液需KH2PO4 027gNa2HPO4 142gNaCl 8gKCl 02g配制18L磷酸缓液需配方量：
KH2PO4（g）：
Na2HPO4（g）
NaCl（g）：
KCl（g）：
4热量衡算
41发酵热计算
发酵程中热衡方程式
(1) 生物热
生物热通常指生物消耗葡萄糖产生热量通计算算生物热量
生物消耗葡萄糖时产生葡萄糖生物热：物料衡算知周期葡萄糖量
周期生物热
(2)搅拌热
发酵工厂设计概知书中
设备选型知种子罐发酵罐验值电机效率
种子罐：
发酵罐：
总搅拌热：
（3）蒸发热辐射热
实际验般
(4)发酵热
（5） 发酵液保温热量
发酵程中肠杆菌培养温度37℃通常发酵热够维持发酵液温度37℃左右需计算发酵程中保温消耗热量
42蒸汽消耗量计算
发酵罐实消程蒸汽直接发酵罐培养基混合培养温度预热85℃左右迅速温度升120℃进行保温灭菌需计算预热程中蒸汽量保温程中蒸汽量
(1)升温阶段蒸汽量计算
升温阶段蒸汽量：
式中 G加热料液量
C料液热容
加热结束时料液温度
加热开始时料液温度
蒸汽烩
热损失般
加热料液量：
料液热容
设计取
时
满足灭菌求设计取热损失
（2）保温时蒸汽量升温蒸汽量05倍
(3)周期蒸汽总量
(4)全年蒸汽量
43菌空气消耗计算
查阅参考文献知肠杆菌发酵时氧速率般耗氧速率空气流量关系式
式中耗氧速率
进口空气氧含量
出口空气氧含量
空气流量
般生产验
前面物料衡算知
分钟菌空气消耗量
5型设备选型
51发酵罐选型
发酵罐选海洋格生物工程设备技术限公司YGF300系列发酵罐参数表：
参数
YGF300
规格
全容积：50L1T
罐体
径高12罐体材质：SUS316L锈钢采优化导流设计
搅拌
徳宝机械密封顶式机械搅拌三级直叶搅拌桨级机械消泡桨4块挡板
进气
转子流量计+灭菌滤器+空气分布器
转速设置
智PID动控制德国SEW减速电机+富士变频器
DO控制
智PID动控制原装进口富士电极电缆线测量范围：0150根发酵时间发酵程序控制转速空气流量罐压补料等参数进行关联控制
PH控制
智PID动控制原装进口瑞士电极电缆线二台蠕动泵显示范围0001400控制范围：2001200
温度控制
智PID动控制恒温水箱+pt100温度传感器+电加热+电磁阀
范围：冷水温度360℃
补料控制
转空例控制设定1100动流加计量补料量曲线分析加入量累计专补料插针针套确保补料安全操作
消泡控制
智PID动控制电极检测蠕动泵补消泡剂
通气
手动调节流量计显示通气量12VVM
罐压
手动调节压力表显示范围：002MPa
灭菌
手动调节程序辅助灭菌位灭菌离位灭菌
控制系统
现场控制器德国西门子S7200系列编程序控制器核心海洋格生物YGF3000R控制软件进行数处理曲线显示数ADDA装换数采集显示控制回路PID运算整定设定值控制时序控制位通讯
52层析系统选型
层析系统选cytiva公司ÄKTAavant 25层析系统该层析系统参数表：
参数
ÄKTAavant 25
应
快速安全程开发方法优化
流量
0001mlmin25mlmin
工作压力
200Mpa
油编号
075mm
波长检测
3波长
紫外线波长
190700nm
流通池路径长度
2mm
PH监测
014
次进样
7样品
缓区选择
18缓入口选达46
步纯化
相湿度
2095（非冷凝）
长期PH稳定性
113
短期PH稳定性
114
黏度
03510cp（系统泵）0710cp（样品泵）
宽度
860mm
高度
660mm
深度
710mm
电压
220240V交流电
电消耗
800VA
防护等级
IP 21
泵类
柱塞泵
安全认证
200642EC（MD）
53层析柱选型
531亲层析柱选型
亲层析柱选cytiva公司AxiChrom 300色谱柱参数表：
参数
AxiChrom300
床高
100300500mm
床架
10μm
床容积
3521L
床体积值
1L
列截面积
71m2
连接数
25mm TC
脚架
520×1110（mm×mm）
材料（床架）
SS ASTM316LSS ASTM S32205聚丙烯聚乙烯
材质（柱）
SS ASTM 316LPMMA
物料
聚丙烯
材料（密封）
EPDMFPMFKMFFPMFFKMFEP
材料（支架）
SS ASTM316
工作压力
4bar
工作温度
230℃
重量
414475Kg
532反层析离子交换层析柱选型
反层析柱离子交换层析柱选cytiva公司FineLINE 100P色谱柱该色谱柱参数表：
参数
FineLINE100P
高压灭菌
121℃30分钟
床高
30150mm
床容积
12L
床体积值
024L
列截面积
79cm2
连接数
25mm TC
脚架
480×480（mm×mm）
材料（床架）
316L锈钢（SS）
材质（柱）
电镀锈钢（SS）316L
材料（盖）
316L锈钢（SS）
材料（支架）
锈钢（SS）
工作压力
20bar
工作温度
4℃40℃
外高
1050mm
重量
15Kg
高
350mm
气孔率
2μm
材料（密封）
乙烯丙烯二烯（EPDM）
54高压蒸汽灭菌锅选型
高压蒸汽灭菌锅选双扉灭菌柜干热湿热台参数表：
541双扉式干热灭菌柜选型
干热灭菌柜选南京维钢机械科技限公司DMH系列双扉式干热灭菌柜参数：
参数
DMH
工作室尺寸
800*800*1000（mm）
外形尺寸
1850*1200*1950（mm）
加热功率
15KW
循环风机功率
22KW
排湿冷风机功率
250W+250W
温度范围
室温350℃（调）
重量
1100KG
配套电机
1844KW
材质
锈钢316L外锈钢3042B
542湿热灭菌器选型
湿热灭菌器选河南省汇邦医疗器械限公司SQZ60型脉动蒸汽灭菌器参数表：
参数
SQZ60
容积
200L
产品形式
立式
加热方式
电加热
功率
17KW
电源
380V59HZ
外形尺寸
1190*810*1580（mm）
胆尺寸
Φ500*1000（mm）
重量
360KG
设计压力
029MPa
额定工作压力
021MPa
设计温度
150℃
工作温度
121℃
脉动次数
099次
55离心机选型
551型冷冻离心机选型
离心机选聚创环保公司JC3H168Z智高速冷冻离心机参数表：
参数
JC3H168Z
高转速
16800rmin
容量
4*100ml
离心力
19470g
标配转子
12*1520ml
转速精度
±50min
制冷系统
氟制冷压缩机组控制阀
温控范围
20℃40℃
温控精度
±1℃
运行程序
100
总功率
15KW
定时范围
199h59min
噪音
＜60dB
电源
AV220V 50HZ
重量
75KG
外形尺寸
710*630*350mm
552三足离心机选型
三足离心机选湘潭离心机限公司SGZ1000N型三足式动刮刀部卸料离心机参数表：
参数
SGZ1000N
直径
1000mm
高度
450mm
效容积
180L
装料限度
250kg
高转速
1200rmin
分离素
800
进料转速
300600rmin
卸料转速
100rmin
电机功率
15kw
工作压力（气压）
115MPa
外形尺寸
2160*1900*1900（mm）
机重量
4000kg
6车间总体布局
61车间组成
通rhEGF原液车间设备构成工艺路线研究判断原液车间需包含物料间培养基配制间接种室种子培养室发酵室层析室原液仓库洗衣房器具灭菌室等[11]
62车间布置原
（1）限度满足生产程设备维护求
（2）效率利车间建筑面积（包括空间）土
（3）车间技术济指标先进合理节等求创造条件
（4）考虑工厂发展车间扩建
（5）车间中采劳动保护防腐防火防毒防爆安全卫生等措施否符合求
（6）车间车间总体规划中处合理位置力争间运输道短方便
（7）考虑厂房区气候理位置水文等条件
（8）流物流交织
参考文献
[1]郑军 黄晓元 and 韦星 重组表皮生长子促进鼠皮肤创面愈合研究 中华整形外科杂志 215(2005)
[2]王世岭等 重组表皮生长子软膏烧伤创面修复促进作中国修复重建外科杂志 016003(2002)173176
[3]陈秋东 中等纯度重组表皮生长子（rhEGF）分离纯化美容产品中应 Diss 浙江学 2003
[4]朱厚础 重组表皮生长子研究概况 生物技术通讯 03(1994)5052
[5]陆兵等 重组表皮生长子稳定性 生物技术通讯 012003(2001)194197
[6]李姗姗等 重组表皮生长子构建表达 哈尔滨医科学学报 04(2011)58
[7]路等 底物诱导重组表皮生长子复性 细胞分子免疫学杂志 3(1998)228228
[8]海琼 and 李黄金 重组表皮生长子体外生物活性测定 广东医学 019005(1998)324325
[9]张洪斌 生物制品(灭活疫苗)车间设计 医药工程设计 03(2000)2426
[10]罗合春 校园生物化工厂设备选型布局设计 重庆工贸职业技术学院学报 009004(2013)6770
[11]周丽莉 制药设备车间设计 中国医药科技出版社 2011
附录
附录1：车间面设计图
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重组表皮生长子原液车间工艺设计
重组表皮生长子原液车间工艺设计
摘
表皮生长子（hEGF）分子肽含53氨基酸PI46分子量约6000DahEGF中通常三二硫键极端素具抗性hEGF生物学功例够促进皮肤生长治疗种创伤眼角膜损伤效果EGF化妆品行业应广泛起美白皱抗皮肤老化作20世纪80年代前没hEGF进行规模工业化生产生物提取纯度低成高20世纪80年代科学家通基工程改造肠杆菌酵母菌等菌种实现hEGF工业化生产该设计生产程肠杆菌作宿细菌应高密度发酵技术通蛋白质纯化技术规模生产rhEGF储备液
该设计结合中国重组蛋白药物实际情况查阅许文件标准完成工艺流程图车间设计计算物料热衡进行关键设备设计选择
关键词：重组表皮生长子高密度发酵工艺车间设计
Process design of recombinant human epidermal growth factor stock solution workshop
Abstract
Human epidermal growth factor (hEGF) is a small molecular peptide composed of 53 amino acids with a molecular weight of about 6000 Daltons and an isoelectric point of about 46 There are three pairs of disulfide bonds in the molecule so it is physical chemical and acidic The factors are relatively stable hEGF has a wide range of biological effects and can strongly promote the growth of various epidermal tissues It has been used in medicine to treat burns ulcers various types of trauma and corneal injuries EGF can also promote the metabolism of normal epidermal cells Adding it to beauty skin care products can achieve whitening antiwrinkle and antiaging effects Before the 1980s the source of hEGF was mainly through tissue and body fluid extraction Due to the extremely small content of hEGF the extraction cost was high and the purity of the product was low which limited the application of hEGF Since the 1980s with the development of genetic engineering technology people have achieved success in the production of hEGF through genetic recombination technology using E coli yeast etc which has laid the foundation for the industrial production of genetically recombinant human epidermal growth factor Therefore the production process in this design uses E coli as the host strain applies highdensity fermentation technology and produces rhEGF stock solution on a large scale through protein purification and other technologies
This design combines the actual situation of recombinant protein drugs in China After consulting a large number of documents and standards the process flow drawing and workshop design have been completed the material balance and the heat balance have been calculated and the design and selection of the main equipment
Keywords Human epidermal growth factorHigh density fermentation processWorkshop design
目录
1绪 4
11hEGF概况 4
12hEGF结构 4
13EGF生物学效应应 5
131EGF生物学效应 5
132hEGF应 6
14高密度发酵工艺简介 6
141培养基 7
142 pH值 7
143温度 7
144溶解氧 7
145诱导条件 8
146接种量 8
147补料 8
15国外hEGF产业化现状 8
16发展前景 8
17设计意义目 9
2 hEGF生产工艺 9
21种子扩培养发酵 9
22发酵液纯化 9
23培养基配方 10
231LB培养基配方 10
232发酵培养基配方 10
233补充培养基配方 11
3物料衡算 11
31工艺基础数 11
32发酵罐物料衡算 11
33种子罐物料衡算 12
34发酵设备参数表 13
35原材料消耗计算 13
351LB培养基消耗计算 13
352发酵培养基消耗计算： 14
353补充培养基消耗计算 15
354物料总 15
36纯化工段 16
361发酵液预处理 16
362 Ni Sepharose亲层析 16
363 Source 15RPC反相层析 16
364 Source 30Q离子交换层析 17
365磷酸缓溶液配方量 17
4热量衡算 17
41发酵热计算 17
42蒸汽消耗量计算 18
43菌空气消耗计算 19
5型设备选型 20
51发酵罐选型 20
52层析系统选型 21
53层析柱选型 22
531亲层析柱选型 22
532反层析离子交换层析柱选型 23
54高压蒸汽灭菌锅选型 23
541双扉式干热灭菌柜选型 24
542湿热灭菌器选型 24
55离心机选型 25
551型冷冻离心机选型 25
552三足离心机选型 25
6车间总体布局 26
61车间组成 26
62车间布置原 26
参考文献 28
附录 29
1绪
11hEGF概况
科学家通研究鼠类颌腺分离发现种肽取名表皮生长子（EGF）相分子量约604KD该肽生长子称表皮生长子促进鼠眼睑早期张开牙齿早期萌芽直接刺激表皮增厚角化 研究员首次提取纯化hEGF类尿液中发现种肽够促进种细胞增殖促进表皮生长血生长抑制胃酸分泌科学家种肽进行测序发现53氨基酸组成hEGF胃肠道保护免疫性皮肤疾病伤口组织修复愈合密切相关[1] hEGF具广阔床应前景烧伤角膜抑制美容治疗hEGF众生物学效应具高价值
12hEGF结构
通分析hEGF基序列发现体编码hEGF基位3号4号染色体编码hEGF区域23含子24外显子[2]hEGF前体种组成细胞膜蛋白质身种生物学功例刺激体细胞增殖识特异性受体
图1示hEGF具三二硫键包含糖基具强抗性易蛋白酶水解肽两端固定N末端受体特异性结合时候发挥关键作中间变区C末端结构域促进细胞增殖功中重研究表明hEGF生物活性核心位三二硫键间构成生物活性需受体结合域
图1hEGF分子级结构
13EGF生物学效应应
131EGF生物学效应
EGF广泛存体部位行生物学功体腺体滋养层细胞够物质结合影响生物体生命活动EGF生物活性分短期效应长期效应（1）短期效应：EGF够接触短短分钟促进抑制细胞膜离子通道活性细胞中磷酸代谢（2）长期效应：细胞接触EGF够促进细胞遗传物质合成提高种酶活性增加种结构蛋白合成骨骼形成
EGF许生物学功叙述[3]：
1EGF够加快体细胞增殖遗传物质合成够加快肺生长分化种广谱促分裂原组织成熟生毛囊细胞鳞状细胞癌细胞具抗增殖作够促进种非创伤愈修复植皮烧伤手术创口等眼角膜移植起关键作EGF体物质功修复例修复胃肠道系统溃疡作注射起观疗效副作会引起体白细胞升高许门诊患者治疗神胶质瘤hEGF毒素乳腺皮肤肿瘤已达特定效果
伤口愈合复杂生物学程步骤炎症清细胞分裂血生成EGF程中够起促进创口修复作时成纤维细胞血皮细胞中促分裂原细胞分裂信号触发覆盖伤口区域时够促进种结构蛋白生成加快创口愈合EGF细胞修复作浓度呈抛物线关系EGF够促进种细胞组织修复增值收广泛关注科学家床实践中EGF作营养子促进神系统发育
2 EGF促进种离子运输交换够肝细胞中钙离子浓度升高调节血糖浓度调节前列腺素合成成骨细胞破骨细胞生物学活性消化系统钙吸收
3甲基胆蒽遇EGF时致癌效果会放增强种脱羧酶活性抑制胃肠道系统活性促进肝脏细胞脂肪细胞生成
4胶原酶够促进创口愈合某细胞生长EGF够加强体胶原酶活性
5EGF常常作组织培养基中成分 EGF改变细胞特性增加胶原细胞中角蛋白成分产生刺激绒毛膜促性腺激素分泌拮抗甲状腺刺激激素 EGF调节细胞外液纤溶酶原激活剂（PA）癌细胞发生变性
6EGF含三二硫键抗性强进入消化系统够抑制胃酸分泌刺激遗传物质合成加快血流量修护消化系统粘膜等
体EGF细胞特异性结合够加快增殖修复消化系统愈合程中分泌唾液胃液中EGF含量高表明EGF够修复消化系统溃疡
132hEGF应
1321基础研究方面
EGF组织培养基中必少成分探索细胞调节机制重成分促进科学家癌细胞发生研究[4]
（1）hEGF够促进体种细胞生长例皮细胞结缔细胞等加速烧伤创伤伤口愈合
（2）hEGF够促进眼角膜移植术愈合生长等生物学功创伤性角膜溃疡角膜溃疡角膜损伤角膜化学物质烧伤治疗具重意义促进生长 眼角膜移植手术愈合加快
（3）EGF具修复加快消化道溃疡愈合hEGF正研究治疗类胃肠道溃疡
（4）年量hEGF毒素组合适治疗肿瘤皮肤癌乳腺癌等方面发挥定作 古巴科学家9例鳞状细胞癌患者皮肤鳞状细胞量hEGF软膏（10ug g）治疗3周6名病癌症明显改善
1322畜牧业
EGF作饲料添剂加入动物饲料中
14高密度发酵工艺简介
年着基工程工业培养技术日益成熟生物发酵技术医药制品中广泛应表达迄止法种表达系统中获量蛋白质进行蛋白表达时通常会选择细胞结构相简单遗传背景清晰繁殖快生物常肠杆菌作发酵工程菌肠杆菌发酵时常常会高密度发酵技术相联系[5]
高细胞密度培养（HCDC）定培养环境中获细胞数达目标产物数量 意味着正常培养相某培养技术设备增加细菌细胞发酵密度显着提高细菌细胞密度提高相关产品表达量般认高密度发酵细胞培养基中密度达超50gL技术仅节省培养基分离纯化简化降低生产成周期提高生产效率
通常规模发酵生产实验室阶段开始包括种子复苏逐级扩培养直罐发酵逐级扩时肠杆菌表达目蛋白量低达量提取目蛋白目规模生产时必须发酵培养物获更高产量正常发酵培养物摇瓶培养物产生更物质公司济成代价存量浪费需高密度发酵降低游生产成通常许素会影响高密度发酵例细胞生长需营养面讨影响高密度发酵关键素[6]
141培养基
培养基分合成培养基半合成培养基复合培养基培养基选择肠杆菌高密度发酵中起着重作培养基营养源碳源氮源源碳氢氧氮硫磷6种元素外培养基中需添加微生物生长必需生长子维生素氨基酸等[7]
常碳源糖脂肪机酸 中葡萄糖生产中广泛 特异性低效提高肠杆菌生长速度方便测试中间产品 应根细菌消耗量添加培养程中添加葡萄糖量 葡萄糖含量会加速乙酸代谢合成 乙酸会抑制目蛋白生成
氮源分机机发酵程中消耗氮源通常机机机氮源重作促进细菌旺盛生长培养基中氮源碳源例宜高否微生物细胞会发酵初期迅速生长发酵期生长速率会提高代谢废物逐渐积累细菌液体粘度增加会影响溶解培养基中氧气量果溶解氧量减少整培养程变异常目标产品表示会受影响整产品批次终会失败高密度发酵程中考虑养分添加
钙离子镁离子钾离子钠离子常见机盐离子维持微生物生长重元素进行发酵时应该考虑适添加机盐离子实验表明肠杆菌发酵肿瘤坏死子中菌种受磷酸盐浓度影响磷酸盐浓度015M时适少会影响目蛋白表达
肠杆菌生长时会产生种次生产物会目蛋白起抑制生成作二氧化碳含光合作生物说种剧毒物质会细菌进行氧发酵产生酸引起酸中毒干扰肠杆菌细胞生长正常代谢活性
142 pH值
细菌生长程中适pH值细菌保持强劲生长乙酸等机酸会高密度培养程中碳源浓度高时生成时培养基环境发生变化产品法正确表达 发酵程控制中通添加酸碱调节培养基pH值确保细菌处适pH值范围避免生长程中pH值急剧变化引起利影响影响细菌新陈代谢
143温度
种微生物发酵程中适宜生长温度适宜温度细菌够快速繁殖产生目蛋白
144溶解氧
影响氧微生物生长重素溶解氧通常细菌指数期时需消耗量氧气培养基中溶氧量非常低 切断氧气供应发酵液中氧气会快消耗掉杀死细菌 发酵结束时反应器中细胞密度增加发酵液变粘 生物反应器供氧力限发酵液中氧浓度低界值 氧溶解传递细菌生长中起着限制作
145诱导条件
目标产物表达通常涉诱导环节转基细菌需早期构建程中添加强诱导启动子通种方式细菌预培养分两步骤：细胞生长产物表达生长程旨增加细胞密度表达程旨获更目标产物强启动子表达外源基时宿细胞承受该外源基高效表达影响细胞生长影响目标产物质粒肠杆菌发酵程中常诱导剂异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）[8]
146接种量
种子液体积培养液体积接种量决定细菌培养基中生长速率生长周期
接种量增加导致营养素更充分利较短孵育时间 种子含许水解酶代谢产物进入合成早期阶段 果接种量高细菌早期阶段生长快增加营养消耗减少溶解氧导致细菌溶 接种物太会增加生长速率细菌数生长期长度微生物生成目蛋白实际发酵程中根具体情况确定接种量
147补料
菌种发酵会量消耗培养基中营养物通常分批进行营养补充 前生产程中常批量进料方法 通常反馈法非反馈法进行菌体发酵时补料
15国外hEGF产业化现状
二十世纪九十年代开始hEGF直科学家研究热点rhEGF具许生物学功1988年瑞士生产种 Gentel药品眼睛疾病许国公司生产出许含hEGF美容品 Eurekaep1 外中国科学院暨南学海生物化学研究中国医学科学院等基础医学专业毕业生国家八五计划九五计划方面取进展 带领 年度计划中许产品获国家I类新药证书[9]
16发展前景
EGF真正解1940年1980年左右着基工程技术发展科学家开始进行研究1990年熟练掌握rhEGF生产工艺技术面进步研究成两方进行关转基细菌生产hEGF研究：hEGF效生产分离hEGF机理应
rhEGF规模发酵生产效率言hEGF前输出效率仅78mg Lh肠杆菌短双歧杆菌表达系统 1999年hEGF香港市场价格然高克210102万美元 rhEGF分离纯化观点分泌重组细菌中分离hEGF具许步骤低产率（通常总产率20％40％）寻求 高度分离rhEGF方法亲吸附分离方法必 外分离发酵集成化中优化培养基减少污染蛋白质分离干扰新颖想法
hEGF分子生物学角度hEGFhEGFR作机理外源性hEGF源性干预机理组织修复生理规律然准确 hEGFEGFR肿瘤饱度反馈调节机制：hEGF早期胚胎发生调节间关系
hEGF应观点目前局部药物研究hEGF药代动力学药代动力学药理学没研究口服hEGF药物研究少[10]
17设计意义目
重组表皮生长子众功rhEGF需求增加需规模生产rhEGF设计目设计生产rhEGF原液车间设计种子扩培养发酵纯化物料衡算设备选型车间设计等
2 hEGF生产工艺
21种子扩培养发酵
级种子培养分取08ml4ml甘油冻存工程菌接种5装400mlLB液体培养基1L摇瓶中37℃220rpm振荡7时(级种子培养时间)测OD6002停止培养级种子培养液
级种子培养液10％接种量接种20L含LB液体培养基50L种子罐中37℃转速150rpm~250rpm培养12时(二级种子培养时间)测OD6003 5停止培养二级种子培养液
二级种子培养液10％接种量(二级种子培养液接种量)接种含160L培养基200L发酵罐中37℃氨水pH调节6 8保持转速150rpm~250rpm发酵期间添加成分400gL葡萄糖20gLMgSO4·7H2O补充培养基诱导前添加速度38mlLh诱导11mlL时培养8h测定发酵液OD600发酵液OD600达15时加入终浓度0 1mMIPTG开始诱导诱导2时加入终浓度体积计0 05％甘氨酸诱导10时收液
22发酵液纯化
收集放罐培养液4℃发酵液6000rpm离心30分钟收集清清液中缓慢加入硫酸铵60％饱度0 1molL HCl调节pH6 04℃静置416时12000rpm离心10分钟收集沉淀沉淀16LpH7 020mmolL磷酸盐缓液溶解溶解清液加热60℃保持30分钟然冰浴快速降温4℃离心沉淀调节样品pH80
（1）Ni Sepharose亲层析：取cytiva公司Ni Sepharose 6 Fast Flow亲层析介质该填料结合力约40mgml需填料量：
660ml填料装入常压层析柱Ni Sepharose层析柱pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积预处理清样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A280nm穿透峰弃A280nm降基线含20mM咪唑衡缓液150cmh流速洗脱目蛋白收集含rhEGF蛋白洗脱峰
（2）Source 15RPC反相层析：取cytiva公司Source 15RPC反相层析介质该填料结合力约30mgml需填料量：
880ml填料装入中高压层析柱Source 15RPC反相层析柱pH8025mmolL磷酸缓液300cmh流速衡3柱体积rhEGF Ni Sepharose洗脱液样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A214nm穿透峰弃A214nm降基线洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）洗脱杂质蛋白洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）洗脱目蛋白收集含rhEGF蛋白洗脱峰
（3）Source 30Q离子交换层析：取cytiva公司Source 30Q离子交换层析介质该填料结合力约80mgml需填料量：
330ml填料装入中高压层析柱Source 30Q离子交换层析柱pH8025mmolL磷酸缓液300cmh流速衡3柱体积rhEGF Source 15RPC洗脱样品样pH8025mmolL磷酸缓液150cmh流速衡3柱体积进行复衡复衡检测A214nm穿透峰弃A214nm降基线残留乙腈完全pH3525mmolLPB缓液洗脱收集含rhEGF蛋白洗脱峰高浓度rhEGF原液
23培养基配方
231LB培养基配方
配制1LLB培养基需配方量：胰蛋白胨 10g酵母提取物 5g氯化钠 10gNaOH调节该培养基pH达74
232发酵培养基配方
葡萄糖20gL胰蛋白胨20gL酵母提取物10gLKH2PO4 3 5gLK2HPO4 5gL(NH4)2HPO4 3 5gLNaCl 1gLMgSO4·7H2O 1gL泡敌0 3mlL微量元素溶液3mlL
微量元素溶液成分：FeSO4·7H2O 0 167gLZnSO4·7H2O 0 0193gLCoCl2·6H2O 0 12gLNa2MoO4·2H2O 0 012gLCaCl2·2H2O 0 006gLCuSO4·5H2O 1 9gLH3BO3 0 5gLHCl(37％wv)37mlL
233补充培养基配方
葡萄糖400gLMgSO4·7H2O 20gL
3物料衡算
31工艺基础数
根车间生产求该车间设计rhEGF发酵液生产力周期160L根表达量150mgL全年365天放假中修理等45天全年工作日36545320天发酵106周期年产量rhEGF
32发酵罐物料衡算
设计发酵罐1200L发酵罐填料系数
物料衡算：（设损失率）
假设正确
33种子罐物料衡算
物料衡算：
34发酵设备参数表
项目
发酵罐
种子罐
V放（L）
160
1316
V0（L）
200
50
V补料（L）
2246
—
V消 （L）
13162
1253
V接（L）
14478
13783
V种子液（L）
1316
1253
V损失（L）
658
0627
V配料（L）
11264
1072
V进（L）
16724
13783
V冷凝水（L）
1898
181
周期（h）
18
12
35原材料消耗计算
该设计生产批发酵液周期154天加发酵罐清洗灭菌时间次1天254天取整3天年工作日320天进行周期发酵
351LB培养基消耗计算
胰蛋白胨：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
酵母提取物：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
NaCl：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
352发酵培养基消耗计算：
葡萄糖：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
胰蛋白胨：
周期消耗（Kg）
年消耗（Kg）：
酵母提取物：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
KH2PO4：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
（NH4）2HPO4：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
NaCl：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
MgSO4·7H2O：
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）
泡敌：
周期消耗（L）：
年消耗（L）：
微量元素溶液：
周期消耗（L）：
年消耗（L）
353补充培养基消耗计算
葡萄糖：
周期消耗量（Kg）：
年消耗（Kg）：
MgSO4·7H2O
周期消耗（Kg）：
年消耗（Kg）：
354物料总
物料
周期消耗
年消耗
胰蛋白胨（Kg）
242
25652
酵母提取物（Kg）
121
12826
葡萄滩（Kg）
1146
121476
NaCl（Kg）
0273
2894
MgSO4·7H20（Kg）
0573
6074
KH2PO4（Kg）
04
424
（NH4）2HPO4（Kg）
04
424
泡敌（L）
0034
3604
微量元素溶液（L）
034
3604
36纯化工段
沉淀
离心
发酵液
反层析
亲层析
加热离心
rhEGF原液
离子交换层析
361发酵液预处理
通离心处理发酵液清液查询资料：通常发酵液中含35湿菌体清液体积：
硫酸铵量：
362 Ni Sepharose亲层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时含20mM咪唑衡缓液根验值概需3倍柱体积衡缓液量：
363 Source 15RPC反相层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时分洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）洗脱杂质蛋白洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）洗脱目蛋白根验值分概需2倍柱体积
洗脱液Ⅰ（35乙腈衡缓液）量：
洗脱液Ⅱ（40乙腈衡缓液）量：
364 Source 30Q离子交换层析
层析柱衡复衡时3倍柱体积pH8025mmolL磷酸缓液6倍柱体积磷酸缓液量：
洗脱时pH3525mmolLPB缓液根验值概需3倍柱体积衡缓液量：
365磷酸缓溶液配方量
配制1L磷酸缓溶液需KH2PO4 027gNa2HPO4 142gNaCl 8gKCl 02g配制18L磷酸缓液需配方量：
KH2PO4（g）：
Na2HPO4（g）
NaCl（g）：
KCl（g）：
4热量衡算
41发酵热计算
发酵程中热衡方程式
(1) 生物热
生物热通常指生物消耗葡萄糖产生热量通计算算生物热量
生物消耗葡萄糖时产生葡萄糖生物热：物料衡算知周期葡萄糖量
周期生物热
(2)搅拌热
发酵工厂设计概知书中
设备选型知种子罐发酵罐验值电机效率
种子罐：
发酵罐：
总搅拌热：
（3）蒸发热辐射热
实际验般
(4)发酵热
（5） 发酵液保温热量
发酵程中肠杆菌培养温度37℃通常发酵热够维持发酵液温度37℃左右需计算发酵程中保温消耗热量
42蒸汽消耗量计算
发酵罐实消程蒸汽直接发酵罐培养基混合培养温度预热85℃左右迅速温度升120℃进行保温灭菌需计算预热程中蒸汽量保温程中蒸汽量
(1)升温阶段蒸汽量计算
升温阶段蒸汽量：
式中 G加热料液量
C料液热容
加热结束时料液温度
加热开始时料液温度
蒸汽烩
热损失般
加热料液量：
料液热容
设计取
时
满足灭菌求设计取热损失
（2）保温时蒸汽量升温蒸汽量05倍
(3)周期蒸汽总量
(4)全年蒸汽量
43菌空气消耗计算
查阅参考文献知肠杆菌发酵时氧速率般耗氧速率空气流量关系式
式中耗氧速率
进口空气氧含量
出口空气氧含量
空气流量
般生产验
前面物料衡算知
分钟菌空气消耗量
5型设备选型
51发酵罐选型
发酵罐选海洋格生物工程设备技术限公司YGF300系列发酵罐参数表：
参数
YGF300
规格
全容积：50L1T
罐体
径高12罐体材质：SUS316L锈钢采优化导流设计
搅拌
徳宝机械密封顶式机械搅拌三级直叶搅拌桨级机械消泡桨4块挡板
进气
转子流量计+灭菌滤器+空气分布器
转速设置
智PID动控制德国SEW减速电机+富士变频器
DO控制
智PID动控制原装进口富士电极电缆线测量范围：0150根发酵时间发酵程序控制转速空气流量罐压补料等参数进行关联控制
PH控制
智PID动控制原装进口瑞士电极电缆线二台蠕动泵显示范围0001400控制范围：2001200
温度控制
智PID动控制恒温水箱+pt100温度传感器+电加热+电磁阀
范围：冷水温度360℃
补料控制
转空例控制设定1100动流加计量补料量曲线分析加入量累计专补料插针针套确保补料安全操作
消泡控制
智PID动控制电极检测蠕动泵补消泡剂
通气
手动调节流量计显示通气量12VVM
罐压
手动调节压力表显示范围：002MPa
灭菌
手动调节程序辅助灭菌位灭菌离位灭菌
控制系统
现场控制器德国西门子S7200系列编程序控制器核心海洋格生物YGF3000R控制软件进行数处理曲线显示数ADDA装换数采集显示控制回路PID运算整定设定值控制时序控制位通讯
52层析系统选型
层析系统选cytiva公司ÄKTAavant 25层析系统该层析系统参数表：
参数
ÄKTAavant 25
应
快速安全程开发方法优化
流量
0001mlmin25mlmin
工作压力
200Mpa
油编号
075mm
波长检测
3波长
紫外线波长
190700nm
流通池路径长度
2mm
PH监测
014
次进样
7样品
缓区选择
18缓入口选达46
步纯化
相湿度
2095（非冷凝）
长期PH稳定性
113
短期PH稳定性
114
黏度
03510cp（系统泵）0710cp（样品泵）
宽度
860mm
高度
660mm
深度
710mm
电压
220240V交流电
电消耗
800VA
防护等级
IP 21
泵类
柱塞泵
安全认证
200642EC（MD）
53层析柱选型
531亲层析柱选型
亲层析柱选cytiva公司AxiChrom 300色谱柱参数表：
参数
AxiChrom300
床高
100300500mm
床架
10μm
床容积
3521L
床体积值
1L
列截面积
71m2
连接数
25mm TC
脚架
520×1110（mm×mm）
材料（床架）
SS ASTM316LSS ASTM S32205聚丙烯聚乙烯
材质（柱）
SS ASTM 316LPMMA
物料
聚丙烯
材料（密封）
EPDMFPMFKMFFPMFFKMFEP
材料（支架）
SS ASTM316
工作压力
4bar
工作温度
230℃
重量
414475Kg
532反层析离子交换层析柱选型
反层析柱离子交换层析柱选cytiva公司FineLINE 100P色谱柱该色谱柱参数表：
参数
FineLINE100P
高压灭菌
121℃30分钟
床高
30150mm
床容积
12L
床体积值
024L
列截面积
79cm2
连接数
25mm TC
脚架
480×480（mm×mm）
材料（床架）
316L锈钢（SS）
材质（柱）
电镀锈钢（SS）316L
材料（盖）
316L锈钢（SS）
材料（支架）
锈钢（SS）
工作压力
20bar
工作温度
4℃40℃
外高
1050mm
重量
15Kg
高
350mm
气孔率
2μm
材料（密封）
乙烯丙烯二烯（EPDM）
54高压蒸汽灭菌锅选型
高压蒸汽灭菌锅选双扉灭菌柜干热湿热台参数表：
541双扉式干热灭菌柜选型
干热灭菌柜选南京维钢机械科技限公司DMH系列双扉式干热灭菌柜参数：
参数
DMH
工作室尺寸
800*800*1000（mm）
外形尺寸
1850*1200*1950（mm）
加热功率
15KW
循环风机功率
22KW
排湿冷风机功率
250W+250W
温度范围
室温350℃（调）
重量
1100KG
配套电机
1844KW
材质
锈钢316L外锈钢3042B
542湿热灭菌器选型
湿热灭菌器选河南省汇邦医疗器械限公司SQZ60型脉动蒸汽灭菌器参数表：
参数
SQZ60
容积
200L
产品形式
立式
加热方式
电加热
功率
17KW
电源
380V59HZ
外形尺寸
1190*810*1580（mm）
胆尺寸
Φ500*1000（mm）
重量
360KG
设计压力
029MPa
额定工作压力
021MPa
设计温度
150℃
工作温度
121℃
脉动次数
099次
55离心机选型
551型冷冻离心机选型
离心机选聚创环保公司JC3H168Z智高速冷冻离心机参数表：
参数
JC3H168Z
高转速
16800rmin
容量
4*100ml
离心力
19470g
标配转子
12*1520ml
转速精度
±50min
制冷系统
氟制冷压缩机组控制阀
温控范围
20℃40℃
温控精度
±1℃
运行程序
100
总功率
15KW
定时范围
199h59min
噪音
＜60dB
电源
AV220V 50HZ
重量
75KG
外形尺寸
710*630*350mm
552三足离心机选型
三足离心机选湘潭离心机限公司SGZ1000N型三足式动刮刀部卸料离心机参数表：
参数
SGZ1000N
直径
1000mm
高度
450mm
效容积
180L
装料限度
250kg
高转速
1200rmin
分离素
800
进料转速
300600rmin
卸料转速
100rmin
电机功率
15kw
工作压力（气压）
115MPa
外形尺寸
2160*1900*1900（mm）
机重量
4000kg
6车间总体布局
61车间组成
通rhEGF原液车间设备构成工艺路线研究判断原液车间需包含物料间培养基配制间接种室种子培养室发酵室层析室原液仓库洗衣房器具灭菌室等[11]
62车间布置原
（1）限度满足生产程设备维护求
（2）效率利车间建筑面积（包括空间）土
（3）车间技术济指标先进合理节等求创造条件
（4）考虑工厂发展车间扩建
（5）车间中采劳动保护防腐防火防毒防爆安全卫生等措施否符合求
（6）车间车间总体规划中处合理位置力争间运输道短方便
（7）考虑厂房区气候理位置水文等条件
（8）流物流交织
参考文献
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[2]王世岭等 重组表皮生长子软膏烧伤创面修复促进作中国修复重建外科杂志 016003(2002)173176
[3]陈秋东 中等纯度重组表皮生长子（rhEGF）分离纯化美容产品中应 Diss 浙江学 2003
[4]朱厚础 重组表皮生长子研究概况 生物技术通讯 03(1994)5052
[5]陆兵等 重组表皮生长子稳定性 生物技术通讯 012003(2001)194197
[6]李姗姗等 重组表皮生长子构建表达 哈尔滨医科学学报 04(2011)58
[7]路等 底物诱导重组表皮生长子复性 细胞分子免疫学杂志 3(1998)228228
[8]海琼 and 李黄金 重组表皮生长子体外生物活性测定 广东医学 019005(1998)324325
[9]张洪斌 生物制品(灭活疫苗)车间设计 医药工程设计 03(2000)2426
[10]罗合春 校园生物化工厂设备选型布局设计 重庆工贸职业技术学院学报 009004(2013)6770
[11]周丽莉 制药设备车间设计 中国医药科技出版社 2011
附录
附录1：车间面设计图
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