重组抗EGFR鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计
重组抗EGFR鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计
摘
着单抗药物日益发展现单抗药物生产力远满足市场需求具鼠源性单克隆抗体适合体体会引起HAMA反应抗鼠抗体反应通杂交瘤技术制备成单克隆抗体鼠源性解决难题方法鼠源抗体变区抗体恒定区进行拼接两者拼接形成嵌合抗体外鼠抗体变区互补决定区CDR区抗体互补决定区进行互换两者互换构成源化抗体解决HAMA反应种方法
止国外已市抗EGFR单克隆抗体3种化疗药进行较具备许特点首先靶点非常明确次毒副作较低疗效更明显次设计容设计生产西妥昔单抗车间分游动物细胞发酵培养游产物纯化两部分设计选宿细胞表达重组抗EGFR鼠嵌合单克隆抗体CHO细胞进行悬浮培养分批流加补料方式培养游采亲层析离子交换层析等产物进行纯化工艺流程物料进行物料衡算原液车间容包括:种子复苏种子扩培养发酵罐发酵蛋白纯化步骤
关键词:动物细胞培养纯化物料衡算车间设计
Process design of workshop for production of recombinant human mouse chimeric monoclonal antibody against EGFR
Abstract
Today with the development of single drug resistant capacity of the single drug resistant far cannot satisfy the demand of the market and because by hybridoma technology preparation of monoclonal antibody is the source of the rat apply to the human body inevitably cause anti mouse antibody (HAMA) response so will be the source of the rat antibodies variable area with constant region joining together to form a chimeric antibody or will be decided the mouse antibody variable area complementary area (CDR) and antibody of complementary decision of the district swap humanized antibody basically settled the problem of antibody drugs of different source sex
At present there are three kinds of antiegfr monoclonal antibodies on the market at home and abroad Compared with other chemotherapeutic drugs they have clear targets significant efficacy and low toxic and side effects and have achieved good clinical efficacy The product was approved for domestic market in 2009 This design mainly aims at the workshop production of cetuximab to carry on the design the main product is divided into animal cells fermentation culture and downstream purification two parts choose express recombinant EGFR resistant human mouse chimeric monoclonal antibody of CHO cells as a host cell suspension culture and cultivate in partial flow and feeding way downstream using affinity chromatography ion exchange chromatography for purification of product The workshop consists of several steps seed recovery seed expansion culture fermentation in ferment tank and protein purification According to the production process and the principle of zoning seeds fermentation harvest and purification are divided into several main production areas
Key words Animal cell culture PurificationMaterial balanceWorkshop design
目 录
摘 II
Abstract III
目 录 IV
1 前言 1
2 工艺流程 2
21 游细胞培养 2
22 游蛋白纯化 4
221 细胞液澄清 4
222 亲层析 4
223 低PH孵育病毒灭活中 5
224阴离子交换层析 6
225阳离子交换层析 6
3 计算 8
31 产量计算 8
32 物料衡算 8
321 培养基量计算 8
322 培养基原料量计算 9
323 纯化程中配制缓液原料量计算 10
324 水量计算 10
325 填料量计算 11
326 热量计算 11
327蒸汽量计算 11
4车间设备 13
41 车间设备 13
41 车间面布置图 14
5 总结 15
参考文献 16
谢 辞 17
附 录 18
1 前言
天止市面常见EGFR靶点治疗性药物已市十二种中四种单克隆抗体外八种分子抑制剂中四种单抗适应症非细胞肺癌头颈癌结直肠癌外八种分子抑制剂乳腺癌非细胞肺癌作适应症[1]通查找全球床试验数库结果次设计题相关床研究截日三千七百五十七中二十六早期床阶段七百二十六床期千四百八十二床二期五百四十床三期余二百七十床四期单抗药物作代全球生物技术产业热点许国家企业致力开发单抗药物
设计设计意义解决前社会单抗药物价格居高难题缓解病患单抗药物供应求严峻情况次车间设计生产产品西妥昔单抗结肠癌治疗车间分发酵纯化两部分单克隆抗体进行工业生产化关键素两部分
次设计分游动物细胞培养游蛋白纯化两体容动物细胞培养阶段需注重点细胞生长条件严格控检测细胞处生长适条件便程度收获细胞液收获更目蛋白[2]游细胞培养阶段结束收获液需进行蛋白纯化高纯度目蛋白简言产品纯度取决纯化阶段工作效率[3]层析步骤填料选择纯化设备选择等等纯化率起关键作续工作中需着重注意点
完成游细胞培养游纯化目蛋白收获产品需整生产程中涉物料量耗热量蒸汽量等等进行衡算整车间布置济消耗进行规划
2 工艺流程
21 游细胞培养
单克隆抗体生产工艺中动物细胞规模培养已成重关键技术哺乳动物细胞表达系统中发生生物分子特定翻译修饰数重组蛋白分泌胞外特点产物提取减少许工作量动物发酵培养成单克隆抗体生产游工艺首选
游工作分步骤首先细胞进行复苏细胞复苏置摇瓶扩增摇瓶扩增结束次进行5L30L细胞反应器进行增殖培养移200L反应器进行流加培养细胞增殖定浓度转移2000L反应器中进行流加培养培养定时间收获液[5]具体流程:
细胞株:设计选表达抗EGFR鼠嵌合单克隆抗体重组CHO细胞
(1) 细胞培养基
基础培养基配方:配方容CD FortiCHO AGT(Thermo Fisher公
司)12 5gLExCell302(SigmaAldrich公司)108gL
配制方法:取配制体积80%注射水配液容器中计算配制培养基需
原料量Excell302干粉CD FortiCHO AGT干粉称取计算量加入配液容器中搅拌30分钟5molL氢氧化钠调节pH直PH6 97 0溶液继续搅拌搅拌10分钟左右搅拌结束培养基定容配制体积进行滤培养基分装滤先进行菌验证验证结束检查滤膜否完整[6]置4℃冰箱里储存
补料培养基配方表
配制方法:取配制体积80%注射水配液容器中计算配制培养基需
原料量CellBoost 5干粉CD EfficientFeed C AGT干粉称取计算量加入配液容器中搅拌30分钟然调节pH直PH调PH92左右次加入配方中剩成分谷氨酸等溶解继续搅拌20分钟搅拌结束6molL盐酸调节PH直pH达6 97 0溶液继续搅拌搅拌10分钟左右 [3]搅拌结束培养基定容配制体积进行滤培养基分装滤先进行菌验证验证结束检查滤膜否完整置4℃冰箱里储存
(2) 种子复苏:设计选宿细胞进行37℃水浴迅速融合需断
进行搅动搅动段时间融化细胞液细胞液转移离心中取15ml离心装细胞液基础加入10ml基础培养液然进行离心弃清弃清加入70ml基础培养液进行重悬重悬转入125ml摇瓶放入37℃5%CO2摇床中培养摇床转速100rpm
(3) 摇瓶扩增:细胞125ml摇瓶中生长23天细胞密度断增长密度达
4× 106细胞ml加入基础培养基稀释摇瓶细胞密度达06× 106细胞ml细胞密度接种1L摇瓶[3]放入37℃5%CO2培养条件摇床中进行培养摇床转速100rpm摇床中培养3天细胞密度达4× 106细胞ml06× 106细胞ml密度细胞接入5L生物反应器中培养
(4) 反应器扩增:5L反应器培养阶段温度3637℃pH6 87 2转速150rpm
30%溶氧饱度条件培养3天细胞密度达4× 106细胞ml种子液转入30L反应器中培养[7]30L反应器温度36℃pH 70转速120rpm30%溶氧饱度条件培养接种密度0 6× 106细胞ml天取样计数葡萄糖浓度控制3gL细胞培养密度达4× 106细胞ml活率求>95%作接种200L反应器中生产种子源
(5) 200L反应器培养:CHO种子细胞培养液30L反应器转入200L规格
次性搅拌式生物反应器中首先5L反应器中转入200L反应器种子液进行密度稀释加入新鲜基础培养基调节密度细胞密度4× 106细胞ml调整06× 106细胞ml200L反应器初始转速60rpm培养条件37℃培养温度葡萄糖浓度直维持13gL种子液培养4天4天培养条件更改33℃培养温度时开始流加补料培养基加入补料培养基目促进细胞生产目蛋白[8]补料培养基天流加量固定流加量实际培养物体积4%葡萄糖浓度直维持36gL水保证细胞稳定生长细胞生长期进入生产期维持7天培养细胞密度达4× 106细胞ml细胞进入衰退期活率达80%左右时停止流加补料培养基[4]
(6) 2000L反应器培养:200L反应器中收获种子细胞培养液转入2000L次
性搅拌式生物反应器中首先补加新鲜基础培养基细胞密度调整06× 106细胞ml[4]培养温度37℃初始转速100rpm葡萄糖含量维持13gL培养6天反应器细胞密度增达4× 106细胞ml时改变培养条件培养温度更改 33℃时开始流加补料培养基加入补料培养基目促进细胞生产目蛋白补料培养基天流加量固定流加量实际培养物体积4%葡萄糖含量维持36gL细胞开始处生长期培养阶段慢慢进入生产期生产期会维持9天期间产物浓度逐渐提高生产期结束细胞进入衰退期活率达80%左右时停止流加补料培养基结束培养
22 游蛋白纯化
设计产品纯化通细胞液澄清亲层析低PH孵育阴离子层析阳离
子层析等方法搭配产品蛋白进行纯化更高纯度蛋白样品
221 细胞液澄清
首先细胞培养结束收获培养液进行两级深层滤处理次处理收获液进行菌滤菌滤结束样亲层析柱
材料设备:
蠕动泵:LongerPumpBT3002J压力传感器:PENDO TECH Pressure MAT
样品:衡缓液细胞收获液:150mM NaCl pH 7 4 50mM TrisHAc
深层滤器:Millipore Pod A1HC 540cm2(二级)Millipore Pod D0HC 2× 540cm2(级)
菌滤器:Sartopore 2 300Sartorius
具体操作步骤:首先准备适量注射水(WFI)利WFI深层滤器A1HCD0HC分进行洗100Lm2600LMH然两D0HC联[10]A1HC串联衡缓液深层滤器进行衡深层滤器(少2倍D0HC系统死体积)衡测定A1HC流出衡液pH值求衡缓液致 [8]完成深层滤器衡首先样品进行滤处理进料速度会逐渐增加首先A1HC流出端液体弃弃液体量约0507倍整系统死体积完成弃液处理菌滤器A1HC流出段进行串联串联开始收集滤液继续进行滤滤时需保持进料速度等200LMH需级深层滤压力保持等15psi水样品滤结束需缓液深层滤膜中残留料液置换出缓液量整系统死体积两倍[4]
222 亲层析
述步骤获清液采MabSelect进行纯化MabSelecGE公司Protein A亲层析填料纯化收集洗脱峰取样检测
材料设备:
填料:MabSelect购GE公司
填料性质
产品
目标配体
粒径(μm)
毫升结合量
PH稳定性
高流速(cmh)
MabSelect
重组ProteinA
85
30mg类IgG
310
500
层析柱:型号LP2151500N径215mm柱高1500mm耐压5bar购海宸乔生物科技限公司
蛋白纯化系统:AKTA AVANT 150 GE
pH计电导计:Seven ExcellenceMultiparameter595606Mettler Toledo
分光光度计:Nanodrop 2000520161Thermo Scientific
样品:澄清处理菌滤细胞培养清液
操作步骤:首先系统路进行必处理——热原处理(保持30min)消毒利1M NaOH进行操作次需WFI系统路进行洗直洗中性然利相应缓液缓液路填满样品滤恢复室温准备样完成系列准备工作层析柱第步接入系统时做运行方法准备[10]运行层析方法收集洗脱峰洗脱峰进行取样取样送检Nanodrop2000测定蛋白浓度根蛋白浓度计算收率[5]层析方法运行结束立卸层析柱水系统路洗干净20%乙醇进行保存亲层析方法表二
223 低PH孵育病毒灭活中
步亲层析洗脱峰进行PH调节pH调节3538室温条件
孵育24h孵育结束进行病毒灭活完成病毒灭活中pH5558中产品进行菌滤处理
设备:pH计电导计:Seven ExcellenceMultiparameter595606Mettler
Toledo分光光度计:Nanodrop 2000520161Thermo Scientific
样品:亲层析洗脱收集峰
滴定液: 1M Tris Base(调碱)1M Citric Acid(调酸)
菌滤器:Bottle Top FilterExpress Plus022微米Millipore
方法结果:
先洗脱收集液里取3mL样品测定pH加入1M Citric Acid调pH3 53 8根加入1M Citric Acid量加入百分进行计算[5]根算百分1M Citric Acid算例加入洗脱收集液中洗脱液进行调节边加入1M Citric Acid时边停搅拌[8]两者混匀取3mL样品置室温时24h24h进行pH测定确认根3mL样品调节pH达5 55 8时需加入Tris百分进行推算需加入1M Citric Acid例1M Tris Base例加入混匀取3mL样品进行pH测定确认中样品进行菌滤
224阴离子交换层析
低pH病毒灭活中样品调pH6 9作阴离子交换层析样收集阴离子层析流穿峰取样进行检测
材料设备
填料:Super Q 650M(TOSOH)
层析柱:型号HSMS100径100mm柱高2000mm耐压<3barCV628L购
华盛色谱科技限公司
填料性质:粒径4090μm离子交换容量020030meqmL吸附容量105mgml
pH计电导计:Seven ExcellenceMultiparameter595606Mettler Toledo
分光光度计:Nanodrop 2000520161Thermo Scientific
样品:病毒灭活中样品样前调pH69
菌滤器:Bottle Top FilterExpress Plus022微米Millipore
操作步骤:首先1M NaOH 系统路进行热原处理(保持30min)
消毒需WFI洗系统路中性时相应缓液充满缓液路样品滤恢复室温准备样层析柱接入系统准备运行方法[10]运行层析方法收集洗脱峰取样送检Nanodrop测定蛋白浓度计算收率[5]层析方法运行结束层析柱卸系统路水洗净20%乙醇进行保存层析方法表三
225阳离子交换层析
述阴离子层析流穿收集峰进行PH值调节调节pH5 0作阳离子交换层析样收集阳离子层析洗脱峰洗脱峰进行取样检测
材料设备
层析柱:型号HSMS100径100mm柱高2000mm耐压<5barCV628L购华盛色谱科技限公司
填料:Poros XS(购赛默飞公司)
填料性质:粒径50μm动态载量100mgmlPH范围114耐压100bar
pH计电导计:Seven ExcellenceMultiparameter595606Mettler Toledo分光光度计:Nanodrop 2000520161Thermo Scientific
样品:阴离子层析流穿峰调pH5 0
菌滤器:Bottle Top FilterExpress Plus022微米Millipore
操作步骤:首先系统路进行必处理——热原处理(保持30min)消毒利1M NaOH进行操作次需WFI系统路进行洗直洗中性然利相应缓液缓液路填满样品进行滤处理样品恢复室温准备样层析柱接入系统准备运行方法[10]运行层析方法收集洗脱峰取样送检Nanodrop测定蛋白浓度计算收率[5]层析方法运行结束层析柱卸系统路水洗净20%乙醇进行保存层析方法表四
3 计算
31 产量计算
生产周期14天年生产340天年生产22批制剂规格100mg50ml
支批纯化终产品蛋白含量2000mgL发酵液1600L生产周期收获蛋白量1600L×2000mgL3200000mg
批次产品量:3200000mg÷100mg支32000支
年产品量:32000×22704000支
32 物料衡算
321 培养基量计算
生产周期培养基量:
复苏:基础培养基80ml10ml融化细胞液混合离心70ml重悬
种子扩增:复苏细胞125ml摇瓶培养细胞密度达4×106细胞ml稀释06×106细胞ml密度接种1L摇瓶中1L摇瓶中细胞液总量:70×4×10606×106467ml基础培养基量:46770397ml取400ml
5L反应器扩增:1L摇瓶中细胞培养细胞密度达4×106细胞ml稀释06×106细胞ml密度接种5L反应器5L反应器中细胞液总量467×4×10606×1063114ml基础培养基量:31144672647ml取2700ml
30L反应器扩增:5L反应器中细胞培养细胞密度达4×106细胞ml稀释06×106细胞ml密度接种30L反应器30L反应器中细胞液总量3114×4×10606×10620760ml基础培养基量:20760311417646ml取17700ml
200L反应器培养:30L反应器中细胞培养细胞密度达4×106细胞ml稀释06×106细胞ml密度接种200L反应器200L反应器中细胞液总量20760×4×10606×106138400ml基础培养基量:13840020760117640ml取117700ml培养4天开始加入补料培养基天流加量实际培养物体积4%维持7天补料培养基量:138400×4%×738752ml取388L
2000L反应器培养:200L反应器中细胞培养细胞密度达4×106细胞ml稀释06×106细胞ml密度接种2000L反应器流加培养7天200L反应器细胞液总量138400+38800177200ml2000L反应器中细胞液总量177200×4×10606×1061181334ml基础培养基量:11813341772001004134ml取1004200ml培养4天开始加入补料培养基天流加量实际培养物体积4%维持9天补料培养基量1004200×4%×9425280ml取425300ml
基础培养基总量:80+400+2700+17700+117700+10042001142780ml114278L取1143L补料培养基总量:38800+425300464100ml4641L取465L
生产年培养基量:
基础培养基量:1143×2225146L补料培养基量:465×2210230L
322 培养基原料量计算
321知基础培养基配方原料补料培养基配方原料根求培养基
量配制培养基物料量进行计算
生产周期物料量:
CD FortiCHO AGT(Thermo Fisher公司)量:125gL×1143L142875g
ExCell302(SigmaAldrich公司)量:108gL×1143L123444g
CD EfficientFeed C AGT(Thermo Fisher公司)量:56gL×465L26040g
Cell Boost5 (购GE Healthcare)量:21gL×465L9765g
谷氨酸量:058gL×465L2697g
酪氨酸量:102gL×465L4743g
半胱氨酸量:085gL×465L3953g
色氨酸量:04gL×465L186g
苏氨酸量:012gL×465L558g
苯丙氨酸量:017gL×465L791g
PF86(购德国BASF公司)量:15gL×465L6975g
具体表示:
基础培养基原料
生产周期量g
年生产量kg
CD FortiCHO AGT(Thermo Fisher公司)
142875
3144
ExCell302(SigmaAldrich
公司)
123444
2716
补料培养基原料
CD EfficientFeed C AGT(Thermo Fisher公司)
26040
5729
Cell Boost5
9765
2149
谷氨酸
2697
60
酪氨酸
4743
105
半胱氨酸
3953
87
色氨酸
186
41
苏氨酸
558
13
苯丙氨酸
791
18
PF86(购德国BASF公司)
6975
154
323 纯化程中配制缓液原料量计算
根述层析程通柱体积缓液浓度计算原料量
亲层析缓液(柱体积CV218L):50mM TrisHAc 7CV005×7
×218763mol150mM NaCl 7CV015×7×2182289mol1M NaCl 5CV1×5×2181090mol 50mM NaAcetate 5CV545mol50mM NaOH 2CV005×2×218218mol
阴离子层析缓液(柱体积CV628L):100mM TrisHAc 5CV01×5×628314mol 500mM TrisHAc 2CV05×2×628628mol1M NaOH 2CV1×2×6281256mol
阳离子层析缓液(柱体积CV628L): 50mM NaAcetate 9CV005×9×6282826mol65mM NaCl 5CV0065×5×6282041mol1MNaOH 2CV1×2×6281256mol
根耗原料物质量分子量计算出原料消耗量表:
原料
生产周期量g
年生产量kg
Tris
206544
45440
CH3COOH
10230
22506
NaCl
426188
93762
NaOH
10920
24024
NaAcetate
208149
45793
324 水量计算
生产周期水量
纯化水量:基础培养基补料培养基配制量1142+4651607L
注射水量层析程缓液配制量26×218+9×628+16×6287238L
根表二表三表四配制量
年水量
纯化水量:基础培养基补料培养基配制量1607×22+1600×2270554L
注射水量:层析程缓液配制量7238×22159236L
325 填料量计算
根填料载量收获液蛋白含量计算出需填料量填料反复
生产年仅需批填料
生产周期亲层析填料量:1610×2000301073334ml生产年亲层析填料量:1610×2000301073334ml
生产周期阴离子层析填料量:1610×2000105306667ml生产年阴离子层析填料量:1610×2000105306667ml
生产周期阳离子层析填料量:1610×200010032200ml生产年阳离子层析填料量:1610×200010032200ml
326 热量计算
配制完成培养基温度室温25℃需加热37℃QmCP(t2
t1)m进出设备物料质量CP物料均热容加热培养基温度t2基础温度t1培养基料液中含固形物W9%固形物热C0155KJkg℃CP C0W100+C水×(100W)100CP155×009+4183×(1009)1003946 KJkg℃Q1607×3946×(3725)760947KJ
327蒸汽量计算
实消灭菌分间接蒸汽加热直接蒸汽加热两阶段第阶段先间接蒸汽料液加热90℃第二阶段直接蒸汽料液加热121℃
2000L反应器间接蒸汽消耗量计算:
发酵罐容量2000L定容量80%培养基液重度1080kgm3培养基热3946 KJkg℃进罐料液温度25℃料液终温度90℃加热蒸汽焓660KJKg加热蒸汽液体热焓量160KJKg间接蒸汽消耗量:2000×80%×1080×3946×(9025)6601608864295kg罐
2000L反应器直接蒸汽消耗量计算:
直接蒸汽消耗量:2000×80%×1080×3946×(12190)[660+1080×3946×(12190)]2668554kg罐
生产周期蒸汽总消耗量:88642944+266855411532849kg
年生产蒸汽总消耗量:11532849×22253722678kg25373t
4车间设备
41 车间设备
5L反应器:
径高:12装液系数:65%80%罐体规格:总容积5升工作容积5升搅拌参数:201500rpmPH测量范围114精度001通气量045 LPMDO控制测量范围0200%精度01%电机功率05千瓦
30L反应器:
该反应器径高例13总容积30升装液系数70%全锈钢316L罐体作该反应器体材质反应器死角罐体设计压力等03Mpa电机功率三点五千瓦转速201100rpmPH控制范围212DO控制0100%
200L反应器:
罐体总容积200L工作容积200L该反应径高例13装液系数达百分70转速控制20570rpm温度控制范围775摄氏度PH控制范围二十二溶氧控制范围0100%电机功率66KW空气流量控制范围0300Lmin
2000L生物反应器:
设计选Sartorius 2000L搅拌式锈钢细胞反应器该反应器利316L锈
钢制成反应器罐体耐压等25bar高搅拌速率:70rpm温度测量范围:0150℃PH范围:410溶氧范围:0110%
述反应器均选赛里斯公司
分光光度计Nano Drop 2000:
波长范围:190840nm吸光值范围:004300光谱分辨率:<18nm吸光值精确度:0002A功率消耗量18W尺寸长×宽(cm):14×20工作电压:12VDC购九方沃德公司
蛋白纯化系统:
产品型号AKTA AVANT 150产品尺寸长×宽×高(mm):1200×1100×1000工作温度35℃功率1400W温度监测器范围099度PH检测器范围014PH单位购GE公司
灭菌柜:
DMH系列双扉净化干热灭菌柜该产品型号:DMH9该产品腔室尺寸宽×深×高(mm):2000×2000×1500外形尺寸宽×深×高(mm):3100×2350×2600加热功率75KW
DMH系列双扉净化湿热灭菌柜该产品型号:DMH5A该产品腔室尺寸宽×深×高(mm):1800×1800×1500外形尺寸宽×深×高(mm):2900×2100×2300加热功率62KW两款灭菌柜均购南京鑫长江制药设备限公司
41 车间面布置图
图示
5 总结
重组抗EGFR单克隆抗体生产车间设计总说包括动物细胞培养蛋白收获液纯化动物细胞培养阶段保证细胞稳定增殖培养蛋白纯化保证收获纯率次设计关键点外济效益考虑重点步物料量设备选择考虑济效益化
次设计相关参考资料非常少通专利文献参考方法设计思路难点2000L规模车间生产发酵设备纯化设备较规模需仔细筛选相关设备规格技术参数等没什验说件非常吃力事情选设备标准求没熟悉明确方面亏指导老师直耐心指导帮助完成次毕业设计中遇许难题通坚持老师悉心教导终圆满完成次设计
通完成次设计收获许知识验切身体会想收获必先付出更道理单克隆抗体生产车间具体布置实施生产更加清晰透彻解时动物细胞培养知识点巩固蛋白纯化步前解更加深更加牢固概表层解第次完成种高端产品——单克隆抗体车间设计觉非常挑战收获
参考文献
[1] 张元兴动物细胞培养工程[M]化学工业出版社2007
[2] 戚政生物反应工程[M]化学工业出版社2004
[3] 翟中细胞生物学[M]高等教育出版社2001
[4] 张前程张凤宝姚康德动物细胞培养生物反应器研究进展[J]化工进展200221(8):560563
[5] 昭阳生物反应器搅拌桨桨叶优化设计[D]哈尔滨工业学2014
[6] 刘斌陈晓宇重组质粒构建毕赤酵母中表达[J]甘肃农业学学报201449(3):3236
[7] 夏春凤生物药品开发动态市场前景[J]中国医药情报19995(2):8689
[8] 刘国诠生物工程游技术[M]化学工业出版社1993
[9] 陶静倪华单克隆抗体药物生产车间工程设计探讨[J]机电信息201032111421
[10]郑云飘单克隆抗体生产车间工程设计点案例分析[J]化工医药工程201637(4):2932
谢 辞
着毕业设计完成意味着学生活实阶段结束回想校学生活感谢学校提供良生活环境学资源感谢教授知识老师感谢予帮助学正够四年里学理知识实验技培养逻辑思考力天毕业文奠定扎实基础
设计文校导师王莹悉心指导完成际心衷感激送导师——王莹老师感谢王莹老师循循善诱教导兢兢业业态度深深感染激励着
通次毕业设计学知识学会更实现理知识实践活动相结合通次文明白做学问丝苟出现问题偏差轻视通正确途径解决做事情耐心毅力坚持够找解决问题方法
次感谢学四年帮助老师学朋友
附 录
表
成分
含量
CD EfficientFeed C AGT(Thermo Fisher公司)
56 gL
Cell Boost5 (购GE Healthcare)
21 gL
谷氨酸
058 gL
酪氨酸
102 gL
半胱氨酸
085 gL
色氨酸
04 gL
苏氨酸
012 gL
苯丙氨酸
017 gL
PF86(购德国BASF公司)
15gL
表二
步骤
缓液
流速(cmh)
CV
备注
洗
50mM TrisHAc150mM NaClPH 74
250
2
前消毒
50mM NaOH1M NaCl
250
2
接触时间15min
样
250
淋洗1
50mM TrisHAc150mM NaClPH 74
250
3
淋洗2
50mM NaAcetate1M NaCl PH 60
250
3
淋洗3
50mM NaAcetate PH 60
250
2
洗脱
50mM NaAcetate PH 35
250
收集UV280:150mAUmm
洗
50mM TrisHAc150mM NaClPH 74
250
2
表三
步骤
缓液
流速(cmh)
CV
备注
前消毒
1M NaOH
250
2
保持60min
预衡
500mM TrisHAcPH 72
250
2
衡
100mM TrisHAcPH 69
250
3
收集UV28050mAUmm
样
250
收集UV28050mAUmm
淋洗
100mM TrisHAcPH 69
250
2
表四
步骤
缓液
流速(cmh)
CV
备注
前消毒
1M NaOH
250
2
保持60min
样
250
淋洗1
50mM NaAcetatePH50
250
2
淋洗2
50mM NaAcetate65mM NaCl PH50
250
5
淋洗3
50mM NaAcetatePH50
250
2
洗脱
50mM NaAcetate140mM NaClPH50
250
收集UV28050mAUmm
图 车间面图
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