硕士类： 全日制专业学位硕士
文题目：槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长影响
摘
目：
苦参碱类生物碱苦参碱代表化学结构相似类生物碱具清热燥湿杀虫利尿等功效作广泛效果明显抗肿瘤活性成份 研究表明体外诱导K562细胞红系粒系分化抑制鼠移植性肿瘤生长诱导SMMC7721细胞分化体苦参生物碱抗肿瘤报道治疗肝炎毒副作提高免疫力 发展成抗癌新药
槐果碱苦参中分离出种苦参碱类生物碱已认种强烈抗病毒杀虫活性药物文献报道槐果碱美法仑原料利拼合原理制备MATMEL肝癌SMMC7721细胞具明显增殖抑制作然槐果碱肝癌中作机制未完全发现外文献表明槐果碱正常鼠定毒性实验选取株肝癌细胞SMMC7721株肝细胞LO2时应槐果碱作分析细胞学性改变机制探索新抗癌药物提供科学
方法：
（1）先利浓度梯度槐果碱处理SMMC7721根IC50筛选出两适浓度
（2）设立组两浓度槐果碱时处理SMMC7721LO2细胞然进行镜观察
（3）采MTT实验检测分析两种浓度槐果碱SMMC7721LO2细胞增殖影响
（4）采流式细胞凋亡实验检测两种浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响
（5）采线粒体膜电位检测两种浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度
（6）采Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl2BaxCleavedCaspase3表达水差异分析解释实验结果
结果：
（1） 槐果碱作SMMC7721IC505363（95CI 41276970）
（2） 选取500mgL1000mgL槐果碱处理细胞500mgL槐果碱浓度LO2SMMC7721细胞分布密度明显减少部分细胞皱缩1000mgL槐果碱浓度两种细胞分布密度明显降低均出现定程度细胞皱缩
（3） MTT结果显示着药物浓度升高两种细胞OD值均明显降（P<005）浓度增殖力明显差异（P>005）
（4） 流式细胞术测定结果够显示槐果碱作两种细胞总凋亡率均着浓度升高增加高浓度肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞（P<005）
（5） 线粒体膜电位检测结果显示槐果碱作两种细胞线粒体膜电位水均着浓度升高降低（P<005）
（6） Western blot法结果够显示着槐果碱浓度升高两种细胞Bcl2水均减少BaxCleavedCaspase3蛋白水均升高
结：槐果碱够通调肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞BaxCleavedCaspase3蛋白表达水抑制Bcl2蛋白表达达抑制两种细胞增殖力降低两种细胞线粒体膜电位水促进细胞凋亡作提示槐果碱抑制肝癌生长时着避免肝细胞损伤等毒副作
关键词：槐果碱肝肝癌增殖凋亡体外试验
目 录
第章 绪1
11 引言1
12 研究目意义5
13 实验技术5
14 实验方案设计5
15 参考文献6
第二章 槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长力影响10
21 实验材料10
211 细胞株10
212 试剂10
213 仪器10
22 实验方法11
221 细胞培养11
2211 细胞复苏12
2212 细胞传代培养12
2213 细胞冻存13
222通显微镜观察浓度槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞形态学改变清况14
223 MTT实验检测分析浓度槐果碱SMMC7721LO2细胞增殖抑制影响15
224 采流式细胞凋亡实验检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响16
225 采线粒体膜电位检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度16
226采western blot法检测浓度槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响17
227 统计学处理17
23 实验结果17
231 槐果碱肝癌细胞增殖力影响17
232 槐果碱肝细胞肝癌细胞增殖抑制作较18
233 槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡影响较19
234槐果碱肝细胞肝癌细胞线粒体膜电位影响较20
235槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响21
24 实验讨 21
25 参考文献23
综述24
硕士读期间发表文45
致谢46
注释表
英文缩写
英文全称
中文名称
MATMEL
Matrinemelphalan
苦参碱美法仑复合物
BCL2
Bcell leukemia2
B淋巴细胞瘤2基
OD
optical density
光密度
HBV
Hepatitis B virus
乙型肝炎病毒
HCV
Hepatitis C virus
丙型肝炎病毒
HP
Helicobacterpylori
幽门螺杆菌
MT
Matrine
苦参碱
MTT
3(45Dimethylthiazol2yl)25diphenyltetrazolium bromide
噻唑蓝
DMEM
Dulbecco＇s modified eagle medium
改良杜氏伊格尔培养基
FBS
Fatal bovine serun
胎牛血清
PBS
Phosphate buffer saline
磷酸缓盐溶液
DMSO
Dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
RIPA
RadioImmunoprecipitation Assay
ripa裂解液
GAPDH
Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase
甘油醛3磷酸脱氢酶
OMT
Oxymatrine
氧化苦参碱
PVDF
Polyvinylidene fluoride
聚偏二氟乙烯膜
TBST
TBS Tween
TrisHCl缓盐溶液
ECL
ElectroChemiLuminescence
电化学
DNA
Deoxyribonucleic acid
脱氧核糖核酸
MOMP
Major outer membrance protein
膜外蛋白
ASX
astaxanthin
虾青素
ROS
Reactive oxygen species
活性氧
FAS
fattyacidsynthase
脂肪酸合成酶
第章 绪
11 引言
原发性肝癌简称肝癌指肝细胞肝胆皮细胞者两者混合发生恶性肿瘤肝癌床常见恶性肿瘤恶性程度高发展迅速初期症状明显发现时已处癌症晚期晚期患者癌细胞扩散转移导致预良已成世界恶性肿瘤致死第2位病[1]目前肝癌世界男性第5常见肿瘤女性第7常见肿瘤[2]中国年死肝癌约383万约占世界51[3]肝癌致死率已跃居国恶性肿瘤致死原第2位[3]目前肝癌全球发病率呈升趋势2014年2月3日世界卫生组织发表全球癌症报告2014显示中国新增癌症病例高居世界第位中肝癌新增病例死亡数均居世界首位肝癌已成严重威胁类健康社会济发展社会问题积极寻找肝癌危险素研究肝癌发病机制终达根治肝癌前中西医学届迫切需解决问题
肝癌发病原机制较复杂中HBVHCVHP感染生活饮食素遗传素环境素等造成肝癌发病率断增长原年许学者研究认慢性HBVHCV感染肝癌发生独立危险素约四分三肝癌患者感染HBVHCV致[4]中国等发展中国家中慢性HBV感染肝癌发病首危险素乙肝患者访研究报道显示HBV患者发生肝癌概率非HBV携带者984倍[4]HCV感染发达国家肝癌发生危险素病例访研究证实HCV抗体阳性患者较非HCV携带者发生肝癌风险增加20倍[5]着乙型肝炎病毒疫苗断推广HBV相关性肝癌发生率较HCV相关性肝癌发病率明显降[6 7]
肝癌治疗包括手术治疗非手术治疗肝癌佳治疗方法手术切肝切术肝脏移植射频消融术认目前肝癌具治愈性效果3种方法[8]肝癌起病隐匿病程短恶性程度高易复发转移患者肝癌认知较少般发现时已中晚期难手术治疗肝癌五年生存率低9[9]年着影学分子生物学中医中药学等断发展进步肝癌治疗传统外科手术转变方法综合序贯治疗甚体化治疗肝癌非手术治疗包括：放化疗介入治疗消融治疗肝移植分子靶治疗生物治疗中医药治疗等治疗手段药物化疗肝癌治疗手段中中药中起着关重作中药天然药物中寻找特异性强低毒性治疗药物种新治疗思路
亚洲区肝癌种常见癌症肝癌患者表现出相似床病理特征然治疗预结果细胞毒性化疗肝癌治疗方式化疗患者预差生存率低生活质量差务急积极寻找更新型抗癌药物代化疗药物者降低化疗药物副作中[10 11]天然植物化学提取物神系统心血分泌系统等系统疾病中良治疗效果成研究热点尤肿瘤预防治疗天然植物化学提取物表现出极优势天然植物化学提取物成新代抗癌药物目前天然植物化学提取物：苦参碱类生物碱姜黄素33＇二吲哚基甲烷芹菜素白藜芦醇花青素槲皮素等研究热点植物化学提取物具抗氧化抗炎抗血栓形成抗动脉粥样硬化等重功效[12 13]时参凋亡噬等种信号通路影响肿瘤血形成侵袭迁移等[1417]Maan等研究显示植物化学提取物肝癌具较防治作[18]
苦参碱类生物碱苦参碱代表化学结构相似类生物碱苦参碱氧化苦参碱槐定碱槐果碱槐胺碱等药效接具清热燥湿杀虫利尿等功效作广泛效果明显[19]苦参碱名田菊健分子式 C12H24N20苦参碱作传统中药成分源豆科植物苦参根药理成分苦参碱(MT)氧化苦参碱(OMT)苦参碱药理作广泛抗肿瘤活性成份 研究表明体外诱导K562细胞红系粒系分化抑制鼠移植性肿瘤生长诱导SMMC7721细胞分化[20]体苦参生物碱抗肿瘤报道治疗肝炎毒副作提高免疫力 发展成抗癌新药苦参碱抗炎抗肿瘤生长分子机制尚未完全阐明
早年苦参中分离出生物碱证明苦参碱(matrine)氧化苦参碱(oxymatrine)成分含量少生物碱没进步研究[21]年着分析分离技术进步量研究发现含少量槐果碱(sophocarpine)氧化槐果碱(oxysophocarpine)槐啶碱(sophoridine)槐胺碱(sophoramine)槐醇碱(sophoranol)莱曼宁(lehmannine)等20种生物碱[22]国外量研究表明苦参碱类化合物方面药理作抗心率失常抗动脉粥样硬化保肝利胆升高白细胞治疗湿疹乙型肝炎等年报道较强抗肿瘤活性作黑色素瘤胃癌膀胱癌皮性卵巢癌乳腺癌等程度抑制作[2326] 苦参碱抗肿瘤机制较复杂靶点途径作亮点通查阅量国外文献发现涉苦参碱类化合物研究国居国外较少
目前关苦参碱研究3方面苦参作天然药物利现代先进分离分析技术成分苦参碱等进行分离分析二苦参作传统中药治疗效果药理床功方面研究研究苦参种类型制剂抗菌抗炎抗敏抗肿瘤抗心率失常消肿利尿免疫生物调节等作研究药理程中苦参碱药动学分子结构生物活性三苦参碱全合成结构修饰药物联合应研究方面尤槐果碱研究苦参碱研究相较少[27]期文献报道槐果碱美法仑原料利拼合原理制备MATMEL肝癌SMMC7721细胞具明显增殖抑制作[28]然槐果碱肝癌中作机制未完全发现外文献表明槐果碱正常鼠定毒性[29]
细胞死亡指细胞受严重损伤时出现结构破坏代谢停止功丧失等逆性变化[30]细胞死亡分：细胞坏死细胞凋亡细胞坏死（Necrosis）指种物理化学素病理刺激引起细胞损伤死亡种细胞病理性非正常死亡[31]坏死时细胞形态表现体积变细胞膜破裂细胞容物外溢细胞核变化明显引起局部炎症反应细胞凋亡（Apoptosis）指机体维持环境稳定动采取结束细胞生命活动1972年Kerr首次提出细胞凋亡概念发生凋亡时细胞表现体积变核质浓缩核膜核仁碎裂DNA降解凋亡发生时细胞容物外溢局部引起炎症反应[32]细胞凋亡残留细胞容物分割形成凋亡体（Apoptosome）值注意[33]细胞程序性死亡指特定基程序性表达介导细胞死亡细胞凋亡细胞程序性死亡中种类型Ⅰ型程序性细胞死亡特指伴细胞形态学变化种生理性死亡方式两者概念混淆早1994年美国著名生物学家Martin细胞凋亡细胞程序性死亡行区分
细胞凋亡信号通路死亡受体途径质网途径线粒体途径三部分构成[34]具体表现：（1）线粒体途径称源性途径该途径分赖Caspase途径赖Caspase途径凋亡促凋亡素刺激线粒体中Cytc释放进入胞质Apaf1 (凋亡蛋白酶)结合成聚体该聚体Caspase9（凋亡起始分子）结合成凋亡体Caspase9激活继激活Caspase367等系列激活凋亡级联反应分子赖Caspase途径凋亡直接通线粒体释放凋亡诱导子AIF促进诱导凋亡发生值注意研究证实[35]Bcl2家族通调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilizationMOMP）实现CytC释放Wang等[36]已证实Bcl2蛋白家族通线粒体途径激活细胞死亡观点线粒体途径中Bcl2家族蛋白调控关重Bcl2家族蛋白分两类促凋亡蛋白（ BaxBakBimBadBid等）抗凋亡蛋白（Bcl2BclXL等）细胞受损时促凋亡蛋白激活抗凋亡蛋白功受抑诱导细胞凋亡发生[37]（2）质网途径：质网应激时细胞钙离子稳态失衡出现钙超载时Caspase 12会激活活化Caspase 12进步激活游Caspase 9促进凋亡发生（3）死亡受体途径TNF Fas等死亡受体FADD（具死亡功区Fas相关蛋白）结合激活Caspase 8 Caspase 10进激活游凋亡执行分子Caspase367促进凋亡发生
细胞生长失程序性调控时会导致肿瘤细胞凋亡效抑制细胞异常增殖抑制肿瘤发生白藜芦醇作宫颈癌细胞时激活细胞ERK12发生核转移继P53发生磷酸化抑制核转录子（NFＫB）活性诱导细胞凋亡[38 39]体外实验证明[40]熊氧胆酸通激活肝癌BEL7402细胞凋亡发挥抗肝癌效应天然抗肿瘤活性物质三萜皂苷（giganteaside D GD)激活肝癌细胞线粒体赖性细胞凋亡途径激活活性氧(reactive oxygen species ROS)产生阻断ROS产生会减弱线粒体途径介导细胞凋亡效应[41]显著抑制肿瘤细胞生长虾青素（Astaxanthin ASX）具强抗氧化抗炎抗肿瘤活性ASX通抑制PI3KAkt ERK活性调Wntβcatenin表达阻断NFＫB p65核转录发挥肝癌细胞增殖抑制凋亡效应[42]前列腺癌乳腺癌卵巢癌等肿瘤中会脂肪酸合酶（FAS）高水表达Fan等研究者证实[43]姜黄素作FAS效抑制剂蛋白基层面抑制FAS表达活性诱导乳腺癌MDAMB231细胞凋亡姜黄素促进乳腺癌细胞促凋亡蛋白Bax表达抗凋亡蛋白Bcl2水明显调说明姜黄素通激活乳腺癌细胞凋亡途径实现抗肿瘤效应
综述细胞失基调控生长会导致肿瘤发生细胞凋亡作基调控细胞正常死亡方式成肿瘤治疗新靶点
12研究目意义
苦参碱床常抗肝纤维化保肝抗乙肝病毒等文献证实效抑制肝癌细胞株HepG2增殖具直接杀伤作司维柯等苦参碱抑制肝癌细胞HepG2增殖时效量效进行全面研究通苦参碱诱导肝癌细胞凋亡细胞阻滞GOG1期细胞进S期进行DNA合成终瘤细胞体外增殖受抑制发挥抗肝癌作然苦参碱类生物碱肝癌中作机制未完全发现实验旨研究较槐果碱肝癌细胞肝细胞生长影响探索新抗癌药物提供科学
13实验技术
文拟采MTT法流式细胞术western bolt法线粒体膜电位检测等方法研究槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长影响
14实验方案设计
15参考文献
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第二章 槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长力影响
21 实验材料
211 细胞株
肝癌细胞SMMC7721购复旦IBS细胞资源中心肝细胞LO2购海拜力生物科技限公司
212 实验试剂
（1）槐果碱（纯度：98） 南京普怡生物科技限公司
（2）细胞培养基DMEM（高糖） Gibco公司（美国）
（3）细胞培养基1640 Gibco公司（美国）
（4）胎牛血清（FBS） 杭州四季青青生物工程材料限公司（杭州）
（5）磷酸缓生理盐水（PBS） Gibco公司（美国）
（6）胰蛋白酶 Gibco公司（美国）
（7）二甲基亚砜（DMSO） Sigma公司（海）
（8）RIPA裂解液(中) 碧云天生物技术研究
（9）样缓液 碧云天生物技术研究
（10）四甲基噻唑蓝（MTT） Sigma公司（海）
（11）BCA蛋白测定试剂盒 碧云天生物技术研究
（12）JC1试剂盒 碧云天生物技术研究
（13）细胞凋亡检测试剂盒 北京康世纪生物技术限公司
（14）鼠抗Bcl2克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
（15）鼠抗Bax克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
（16）鼠抗GAPDH单克隆抗 北京博奥森生物技术限公司
（17）鼠抗CleavedCaspase3克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
213 实验仪器
（1）培养箱 Thermo 公司美国
（2）倒置显微镜 Olympus 公司日
（3）超净工作台 苏州净化设备公司中国
（4）80℃超低温冰箱 Thermo Fisher 公司美国
（5）冰箱（4摄氏度） Sanyo 公司日
（6） 恒温水浴锅 长沙基隆仪器仪表限公司
（7）制冰机 Gelin 电器限公司中国
（8）37摄氏度恒温箱 福意电器北京限公司
（9）加样器 GILSON 公司法国
（10） 电泳仪 (DYY6C) 北京六仪器限公司
（11）电泳凝胶成系统 Biotech 公司中国
（12） Sartorius ME215S 型号电子天 赛利斯公司德国
（13） 电转印仪 BioRAD 公司美国
（14） 功酶标仪(BioTek Synergy HT) BioRAD 公司美国
（15） 超速离心机(55P72) Hitacht 公司日
（16） 细胞培养板 Corning 公司美国
（17） 流式细胞仪 BD 公司美国
（18）显微摄系统(SP0tVersion35) Diagnostieinsturmenislne美国
（19） 紫外分光光度计 精密科学仪器海限公司
（20） STSl 型脱色摇床 海门市麒麟医仪器限公司
22 实验方法
221 细胞培养
2211 细胞复苏
（1）进入菌室前肥皂洗手碘伏消毒75酒精擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）液氮中取出含SMMC7721肝癌细胞冻存直接浸入37℃水浴箱中手摇动融化位
（3）37℃水浴箱中取出含SMMC7721肝癌细胞冻存置紫外线射超净台接着开盖子吸缓慢吸出SMMC7721肝癌细胞悬液加滴加10倍体积培养液离心混匀
（4）开离心机设置转速1000转分钟离心时间设置5min
（5）置紫外线射超净台弃离心清液加入含10浓度胎牛血清培养液重悬细胞计数含10浓度胎牛血清培养液调整细胞密度接种新培养瓶37摄氏度5C二氧化碳培养箱静置培养
（6）第二日更换次培养液（含10浓度胎牛血清培养液）继续培养
（7）样方法处理L02肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
2212 细胞传代培养
（1）进入菌操作室前肥皂清洁洗手碘伏消毒75酒精均匀擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）利倒置显微镜仔细观察SMMC7721肝癌细胞形态确定SMMC7721肝癌细胞否需进步传代SMMC7721肝癌细胞胞需具体稀释倍数培养液放置37摄氏度水浴箱进行预热
（3）保证超净台台面应整洁01浓度新洁尔灭溶液含75浓度酒精棉球擦洗干净
（4）开超净台紫外灯射台面时间约20 30 min左右进行细胞传代前关闭超净台紫外射灯开抽风机抽风清洁超净台空气臭氧
（5）火机点燃超净台酒精灯调节酒精灯火焰宜猛手出菌试巴斯德吸带刻度吸75浓度酒精消毒置超净台缓慢酒精灯火焰稍微烧插入菌试
（6）含10浓度胎牛血清培养液瓶口75浓度酒精进行消毒酒精棉球擦干缓慢酒精灯火焰倾斜放置超净台酒精灯旁边试架子
（7）旧细胞培养瓶缓慢酒精灯火焰开瓶盖次稳定酒精灯火焰倒掉含培养细胞培养瓶旧培养基适情况采2 3 毫升Hanks洗涤液残留两滴旧培养基利少量胰酶刷洗旧培养瓶瓶口
（8）次加入约1 2 mLPBS液体旧培养瓶瓶口酒精灯火焰倒掉培养瓶加入PBS液体重复操作三次该步骤
（9）旧培养瓶加入1mL胰酶瓶量酌减瓶量酌加旧培养瓶瓶口酒精灯火焰盖瓶盖倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态变化放入37 摄氏度5 二氧化碳培养箱培养概约分钟时间左右轻轻出旧培养瓶倒置显微镜观察时SMMC7721肝癌细胞形态变化SMMC7721肝癌细胞已收回突起变圆形状时马培养瓶入超净台立加入约2 毫升新鲜含10浓度胎牛血清培养液中胰酶时注意细胞早脱落进入培养瓶消化液中切勿胰酶直接倒入废弃缸
（10）加入少量含10浓度胎牛血清新鲜培养基反复吹已消化SMMC7721肝癌细胞够脱壁进步分散旧培养瓶底细胞基脱落培养液时含SMMC7721肝癌细胞培养液加入新离心开离心机设置转速1000转分钟离心时间5分钟
（11）离心完重新置紫外线灯射超净台离心口稳定酒精灯火焰开盖口次酒精灯火焰倒掉清液加入含10浓度胎牛血清新鲜培养基根分传培养瓶数量补加定量含10浓度胎牛血清新鲜培养液(4~6mL瓶8~12mL瓶)已制成细胞悬液分开装新细胞培养瓶利二氧化碳气体进入盖细胞培养瓶盖适程度拧紧点稍微回转培养瓶放回5二氧化碳37摄氏度培养箱中
（12）样方法处理LO2肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
（13）切记已悬浮培养细胞实验步骤79步做该实验操作
2213 细胞冻存
（1）进入菌操作室前肥皂清洁洗手碘伏消毒75浓度酒精擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）利倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态确定SMMC7721肝癌细胞否够冻存培养液置37℃水浴箱预热
（3）提前进行配方制成细胞冻存液配方10 浓度DMSO + 90浓度胎牛血清放置温度4摄氏度冰箱中保存进行预冷
（4）含EDTA胰酶消化液SMMC7721肝癌细胞进行消化处理次加入概约2 mLPBS清洗液体旧培养瓶瓶口酒精灯火焰倒掉加入PBS液体重复该步骤操作三次旧培养瓶加入概约1mL胰酶消化液瓶考虑量酌减瓶量酌加旧培养瓶瓶口酒精灯火焰盖瓶盖倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态变化放入37 摄氏度5 二氧化碳培养箱进行培养约分钟左右出旧培养瓶倒置显微镜观察时SMMC7721肝癌细胞形态变化细胞收回突起变圆时立培养瓶入紫外线灯射超净台立加入约2 mL新鲜含10浓度胎牛血清细胞培养液中胰酶注意里勿SMMC7721肝癌细胞提早脱落入胰酶消化液中切勿胰酶直接倒入废弃缸加入少量含10浓度胎牛血清新鲜细胞培养基反复进行吹已消化SMMC7721肝癌细胞够脱壁表现分散状态旧培养瓶底细胞基脱落培养液时含SMMC7721肝癌细胞培养液加入新离心开离心机设置转速1000转分钟离心时间设置5分钟离心完重新置紫外线灯射超净台离心口缓慢酒精灯火焰开盖口次缓慢酒精灯火焰倒掉清液
（5）次新鲜含10浓度胎牛血清完全培养液重新悬浮SMMC7721肝癌细胞已预冷完毕细胞冻存液加入已消化充分彻底SMMC7721肝癌细胞中塑料滴进行轻轻慢慢吹达混匀状态
（6）分支冻存中缓慢加入体积约1ml细胞悬液彻底密封完毕清晰标记冻存SMMC7721肝癌细胞名称冻存天日期时间
（7）样方法处理L02肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
（8）冻存相关步骤否够细致化操作十分关系SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞次复苏复活时活力程度复苏SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞存活率果够拥程序细胞降温器(放入温度80摄氏度冰箱中直第二天进步放置入液氮罐中进行长期保存)合适者通含冻存SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞冻存中放置4摄氏度冰箱中维持时间2h然进步转20摄氏度冰箱中维持时间2h然进步转80摄氏度冰箱中维持时间2h放置入液氮罐中进行SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞长期保存
222 通显微镜观察浓度槐果碱SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞细胞形态学改变
（1） 数生长期SMMC7721肝癌细胞置六孔板37摄氏度5CO2细胞培养箱进步进行培养培养时间24h细胞密度50时分0mgL500mgL1000mgL浓度槐果碱作SMMC7721肝癌细胞
（2） 加药时间48h换液含10浓度胎牛血清新鲜DMEM细胞培养液通显微镜仔细观察视野SMMC7721肝癌细胞形态变化电脑拍记录
（3）样方法处理LO2肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
223MTT法检验浓度槐果碱SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞增殖力影响
（1）先SMMC7721肝癌细胞提前种六孔板163264125250500100020004000mgL槐果碱处理SMMC7721肝癌细胞48h025浓度胰酶消化液处理数生长期SMMC7721肝癌细胞细胞分进行收集计数时细胞密度调整1×104mL96孔板孔100μL定量细胞悬液缓慢精准加入时设置组加入等体积细胞培养液组设置5复孔保证孔含4μLmLDMSO37摄氏度5二氧化碳细胞培养箱中继续培养SMMC7721肝癌细胞培养时间48h
（2）吸吸取96孔板孔液体时保持心做精准时预先已配置混合均匀50μL含MTTDMEM细胞培养基加入孔中MTTDMEM细胞培养基配方10μL：90μL96孔板未加入细胞悬液处设5复孔时孔中需心精准加入100μL含MTTDMEM细胞培养基时37摄氏度5二氧化碳培养箱中继续培养SMMC7721肝癌细胞培养时间4h
（3）心吸出96孔板孔孔液体加入剂量150μL DMSO溶液孔室温温度较低速度进行震荡震荡时间约12min18min直紫色结晶已彻底溶解酶标仪OD568准确测定96孔板孔吸光值
（4）样方法处理LO2肝细胞注意选细胞培养基1640
（5）抑制率（IC）1（槐果碱组OD值空白OD值）（未槐果碱组OD值空白OD值）×100
（6）根组抑制率IC50选取较低抑制率浓度B较高者C组A浓度进行续试验
224 采流式细胞凋亡实验检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响
（1） 含EDTA025浓度胰酶消化液进行消化SMMC7721肝癌细胞
（2） 终止消化收集细胞悬液开离心机设置转速1000转分钟离心时间约5min吸心离心清液
（3） 吸离心滴入PBS洗液进行细胞重悬吸吸取PBS洗液SMMC7721肝癌细胞进行润洗2次时开离心机设置转速1500转分钟离心时间约46min
（4） 根Annexin VPE7AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行实验操作：首先离子水13稀释Binding Buffer250 μl Binding Buffer重新悬浮SMMC7721细胞调节浓度1×106ml 取 100 μl SMMC7721细胞悬液 5 ml 流式中加入 5 μl Annexin VPE 10 μl 7AAD 溶液混匀室温避光孵育 15 分钟 反应中加400 μl PBS流式细胞仪（FACS）分析
225采线粒体膜电位检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度
(1) 选取三组SMMC7721细胞应药物浓度ABC
(2) 处理48hSMMC7721细胞消化离心重悬05mlDMEM细胞培养液中加入05ml JC1染色工作液混匀37℃孵育20分钟
(3) 600g 4℃离心机离心34分钟沉淀细胞弃清JC1染色缓液洗涤2次适量JC1染色缓液重悬荧光分光光度计检测
(4) 检测JC1单体（绿色荧光）时激发光设置490nm发射光设置530nm检测JC1聚合物（红色荧光）时激发光设置525nm发射光设置590nm红绿荧光相值作衡量线粒体极化程度
(5) 样方法处理LO2肝细胞注意选细胞培养液1640
226Western blot试验检测槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响
（1） 取组处理48h细胞加入适量细胞裂解液置冰裂解离心提取清分光光度计定量加样缓液煮沸取定量1820μL细胞蛋白样进行SDSPAGE胶电泳进转移PVDF膜含5浓度脱脂奶粉TBST（封闭液）进行PVDF膜浸泡操作室温进行摇床封闭操作时间2h
（2）封闭液相应抗进行稀释操作稀释倍数（11000）进步PVDF膜含相应抗孵育液中进行浸泡4摄氏度温度孵育第二天TBSTPVDF膜进行充分彻底洗涤洗涤次数3次次洗涤时间维持约5min紧接着 TBST封闭液相应二抗进行稀释操作稀释倍数（11000）进步PVDF膜含相应二抗孵育液中进行浸泡室温温度进行摇床孵育时间二时
（3）TBST充分洗涤PVDF膜3次5min次
（4）进暗房开始曝光张膜缓慢滴加合适量ECL底物液孵育时间约数分钟等膜出现明显荧光条带进步滤纸轻轻吸膜余底物液
（5）然轻轻覆盖层保鲜膜新避光保存X光胶片进行压片操作压片时间约1015min紧接着次放入适量显影液显影等胶片显影放入定影液进行定影GAPDH作参注意暗房操作注意彻底避光
227 统计学处理
实验数均数±标准差表示组间均数较采单素方差分析组间两两较采LSDt检验方差齐时采Tamhanes T2法结果数均采SPSS 200软件Graphpad 60软件进行统计学分析P < 005差异统计学意义
23 实验结果
231 槐果碱肝癌细胞增殖力影响
槐果碱作SMMC7721细胞48h着槐果碱浓度升高肝癌细胞增殖抑制作增高中IC505363（95CI 41276970）选A浓度未加槐果碱0mgLB浓度500mgLC浓度1000mgL
图1 浓度槐果碱SMMC7721增殖抑制作
232槐果碱肝细胞肝癌细胞增殖抑制作较
通显微镜镜观察槐果碱作肝细胞肝癌细胞48h形态学改变见图结果显示A浓度条件LO2SMMC7721细胞分布密度较形态较清楚B浓度LO2SMMC7721细胞分布密度明显减少部分细胞皱缩C浓度两种细胞分布密度明显降低均出现定程度细胞皱缩次通MTT检测检测槐果碱作肝细胞肝癌细胞48h吸光度值OD值该指标代表细胞存活情况[6]结果显示着槐果碱浓度升高两种细胞吸光度值明显降低（P<0001）浓度两种细胞吸光度值水明显差异（P>005）见槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2均明显增殖抑制作浓度两种细胞增殖抑制力没明显差异
图2 SMMC7721细胞LO2细胞浓度槐果碱处理48h形态学改变（×200） A未槐果碱处理SMMC7721细胞B500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞C1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞D未槐果碱处理LO2细胞E500mgL槐果碱处理LO2细胞F1000mgL槐果碱处理LO2细胞
细胞株
槐果碱浓度（mgL）
F值
P值
0
500
1000
SMMC7721
123±031
070±011
051±006
1868
<0001
LO2
131±019
078±024
057±017
1779
<0001
t值
0492
0678
0744
P值
0636
0517
0478
233槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡影响较
槐果碱作SMMC7721肝癌细胞48h总凋亡率着槐果碱浓度升高增加槐果碱作LO2肝细胞48h总凋亡率着槐果碱浓度升高增加说明槐果碱抑制肝癌细胞时然造成肝细胞损害外500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞凋亡促进率（201±014）500mgL槐果碱处理LO2细胞凋亡促进率（185±009）两者间明显差异（P>005）1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞凋亡促进率（496±019）明显低1000mgL槐果碱处理LO2细胞凋亡促进率（708±022）P<001低浓度槐果碱肝癌细胞肝细胞促凋亡作明显差异高浓度槐果碱肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞
图3 流式细胞凋亡结果 A未槐果碱处理SMMC7721细胞B500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞C1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞D未槐果碱处理LO2细胞E500mgL槐果碱处理LO2细胞F1000mgL槐果碱处理LO2细胞
234槐果碱肝细胞肝癌细胞线粒体膜电位影响较
浓度槐果碱作SMMC7721细胞LO2细胞48h线粒体膜电位水均明显降高浓度组红绿例明显低低浓度组说明着浓度升高线粒体膜电位水明显降造成线粒体膜稳定
图4 线粒体膜电位水检测（n3）
a 药组红绿例明显低组
b 高浓度组红绿例水明显低低浓度组
235槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响
利western blot技术检测SMMC7721LO2细胞Bcl2BaxCleavedCaspase3蛋白水中两种细胞Bcl2水均槐果碱浓度升高递减BaxCleavedCaspase3蛋白水均槐果碱浓度升高增加（图5）
图5 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水 A western blot显示SMMC7721蛋白表达条带B SMMC7721细胞蛋白相蛋白表达量（n3）C western blot显示LO2蛋白表达条带D LO2细胞蛋白相蛋白表达量（n3）
a药组蛋白表达水明显低组
b高浓度组蛋白表达水明显低低浓度组
c药组蛋白表达水明显高组
d高浓度组蛋白表达水明显高低浓度组
24实验讨
原发性肝癌起源肝脏皮组织国高发危害极恶性肿瘤流行病学表明乙型肝炎病毒（HBV）丙型肝炎病毒（HCV）感染黄曲霉素肝癌发病相关关键素[7]苦参认种具强烈抗病毒杀虫活性药物够效抗乙肝病毒[89]槐果碱作种苦参碱类生物碱样具抗乙肝病毒作[10]够效抑制肝癌细胞增殖力[4]然槐果碱具定毒性肝脏常受累器官[5]槐果碱认双刃剑抑制肝癌细胞生长抗乙肝病毒时会造成定程度肝细胞损伤研究选取肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2作研究象首先通MMT法检测浓度槐果碱SMMC7721增殖抑制作筛选出两适宜浓度500mgL1000mgL两浓度处理SMMC7721LO2细胞结果发现：1槐果碱作两种细胞细胞分布密度降低出现定程度细胞皱缩2然着槐果碱浓度升高两种细胞均受明显抑制浓度两种细胞增殖力明显差异3槐果碱作两种细胞总凋亡率均着槐果碱浓度升高增加高浓度槐果碱肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞4槐果碱作两种细胞线粒体膜电位水均着槐果碱浓度升高降低5着槐果碱浓度升高两种细胞Bcl2水均减少BaxCleavedCaspase3蛋白水均升高见槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2均着明显抑制生长促进凋亡作提示槐果碱抗肝癌时会避免肝细胞造成定损害研究仅体外试验槐果碱抗癌毒性进行分析发现细胞增殖抑制明显差异肝细胞促进凋亡作尤明显损害程度需进步动物实验进步确认
文献槐果碱抗肿瘤方面研究较少文献表明槐果碱衍生物氧化槐果碱够通体外培养SW480肠癌细胞MCF7乳腺癌细胞阻滞G0G1期时调Caspase3抑制Bcl2表达达抑制细胞增殖促进细胞凋亡作该作呈定时间剂量赖性[1112]外研究证实氧化槐果碱够效降低鼠急性中毒反应[5]改变槐果碱分子结构减少肝细胞损伤减少抗肝癌程中毒副作仅进步动物实验中通肝动脉注射槐果碱溶液方式更加准确攻击原发灶致避免槐果碱损害正常肝组织脏器[13]
综述槐果碱够通调肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞BaxCleavedCaspase3水抑制Bcl2表达达抑制两种细胞增殖力降低线粒体膜电位促进凋亡作外高浓度槐果碱促进LO2细胞凋亡率明显高SMMC7721细胞提示槐果碱抑制肝癌生长时着避免肝细胞损伤等毒副作研究细胞试验初步证实槐果碱抗肿瘤作选择性较差肝癌正常肝细胞杀伤作基没差异
25参考文献
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综 述
王庆华 王炳芳 校审
干细胞生物材料生长子治疗肝细胞癌研究进展
[摘]肝细胞癌（HCC）全球第五常见恶性肿瘤缺乏效治疗方法 迫切需种怕疾病确定新治疗方法转化生长子β（TGFb）微环境肿瘤细胞生长起着重作通两机制：作活性分泌生长子作通诱导微环境变化外活性干细胞疗法成治疗肝癌潜治疗方法信号传导通路GF GFR系统SDF1α CXC4配体受体相互作PI3K Akt信号传导积极影响细胞治疗结果干细胞基础治疗结合信号通路成代坏死肝细胞效选择目前已探索通生物材料靶药物递送系统（TDDS）癌症治疗剂特肝脏提高肝脏中药物浓度减少剂量副作效果综述旨全面总结肝癌治疗方法：干细胞生长子生物材料
[关键词] 肝细胞癌 干细胞 生长子
Stem Cells Biomaterials and Growth Factors in the Treatment of Hepatocellular Carcinoma
[Abstract]Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignancy in the world but lacks effective treatments Therefore there is an urgent need to establish new treatments for this terrible disease Transforming growth factorbeta (TGFb) plays an important role in the growth of tumor cells in the microenvironment He mainly passes two main mechanisms as an intrinsically active autocrine growth factor and as a change through the induction of the microenvironment External activity Recently stem cell therapy has also become a potential treatment for liver cancer and signaling pathways such as the GFGFR system SDF1αCXC4 ligand receptor interactions and PI3KAkt signaling can all be used to positively influence cell therapy result Therefore stem cellbased therapy combined with signaling pathways can be an effective alternative in the replacement of necrotic hepatocytes The use of biological material targeted drug delivery systems (TDDS) for cancer therapeutics has been explored Especially the liver because it can increase the drug concentration in the liver and reduce the dose and side effects The purpose of this review is to provide a comprehensive summary of available treatments for liver cancer stem cells growth factors and biological materials
1背景
肝癌世界第五常见癌症癌症死亡率第三常见原[1]肝干细胞研究改善肝病患者预[2]肝干细胞研究进展产生新细胞疗法通提供肝病模型促进新药物开发[3]许组织中干细胞尚未特异性识分离目前促进组织特异性干细胞增殖分化机制理解限妨碍产生效治疗代细胞干细胞[45]慢性肝损伤程中出现肿瘤起始干细胞（TISC）享信号通路表达包括围绕转化生长子ββ连环蛋白组织表面标记具正常LPC表面标记[6]TISCs肝细胞癌中作研究提供肝癌发生转录转录调控新法[7]针TISC靶化学疗法正开发中作克服细胞耐药种手段
2肿瘤基质相互作：种新肝病治疗靶点
开发效治疗肝细胞癌挑战潜肝硬化关肝硬化仅肝功降低关肿瘤细胞生长提供支持种独特微环境新药仅应该治疗肿瘤细胞应该预防新肿瘤病变理想药物应具低毒性抗肿瘤活性化学预防活性种药物治疗方案中具活性辅助治疗中消融治疗起例激酶抑制剂具限制期治疗毒性特征严重良事件舒尼尼已停药抗血生成激酶抑制剂凝血功受损患者中出血风险高动脉化疗栓塞联合索拉非尼外理想药物候选物抗肿瘤活性必须显示出立抗肿瘤作索拉非尼阻断种信号通路仅具抗血生成作诱导肿瘤细胞凋亡通抑制受体游信号通路靶肿瘤 基质相互作药物已证明效治愈控制肝脏疾病[89]索拉非尼种口服激酶抑制剂种旨抑制血皮生长子受体（VEGFR2 3）血板衍生生长子受体（PDGFR）Raf激酶中断肿瘤基质相互作导致细胞增殖血生成减少索拉非尼疗效安全性已床试验中证实目前视晚期HCC患者治疗标准[10]理想候选药物需阻断肝硬化相关程通靶种微环境信号抑制肿瘤细胞生长刺激防止新肿瘤损伤先前研究药剂抑制TGFβ信号传导影响肝细胞癌发育进展阶段提供更广泛治疗应整肝细胞癌发展程中存TGFβ信号然微环境调节剂具化学治疗观察立抗肿瘤作相反分子细胞肿瘤生物学影响需更长治疗时间宿组织恢复成更具生理学表型
21转化生长子b（TGFβ）作肝病治疗靶点
TGFb信号通路变化认肿瘤生长促成素[11] TGFb信号通典非典途径发生[12]三种配体TGFb受体II（TGFbRII）结合时TGFb受体I（TGFbRIALK5）异源二聚化该激酶转磷酸化时负责激活典型TGFb信号传导途径两种受体结构域（TGFb1TGFb2TGFb3）[13]该磷酸化阶段导致SMAD2SMAD3活化磷酸化激活SMAD信号传导级联终导致核易位广泛肿瘤促进介质基转录[14]然非典激活途径尚未探究清楚许细胞蛋白质磷酸化关jun N端激酶（JNK）p38 MAPKERKMEKK表明TGFb信号传导具种激活肿瘤细胞机制研究表明鼠模型中体组织中存两种TGFβ信号传导反应种称早期种称晚期TGFβ信号响应早期反应模式较长反应模式相关较短反应模式较短生存时间相关早期反应模式反映生理性炎症反应晚期反应模式长期TGFβ激活相关 TGFβ作肝细胞癌分子分类中认识中Wnt信号传导途径受TGFβ调节肝细胞癌肿瘤亚组中TGFβ信号传导似控制肿瘤细胞生长第二亚组中更肿瘤低甲胎蛋白（AFP）表达良预相关样亚组鉴定代表第次尝试鉴TGFβ信号传导抑制作出反应肝细胞癌患者基转录组研究间差异正数进行回顾获分类更理解驱动肝细胞癌病理生理学途径回顾基转录组报道TGFβ信号传导AFPEpCAM表达相关伴表达基础早期肝细胞癌25％中存TGFβ信号传导TGFβ信号传导外效应嵌入ECM富集环境中肿瘤细胞生长结果种情况特征TGFβ分泌相关子影响癌症相关成纤维细胞CTGF激活成纤维细胞外TGFβ信号通路T调节细胞相关例通激活趋化子（CCL22）通AFP免疫呈递TGFβ信号传导肿瘤起始细胞关TGFβ诱导CD90CD133表达改变显示TGFβ持续刺激肝祖细胞导致转化肿瘤起始细胞TGFβ信号传导作高度侵袭性肿瘤条件观察 TGFβ信号细胞极性丧失细胞运动获肿瘤侵袭增加关通Ecadherin表达（EMT标志物）测量肿瘤细胞变化EMT关存TGFβ情况E钙粘蛋白肿瘤细胞脱落肿瘤细胞更具侵袭性迁移性组织微环境组分层粘连蛋白5（Ln5）CD44相关联TGFβ诱导转录子SnailEMT组分种诱导预良关总似TGFβ信号传导引起EMT肿瘤更具侵入性
22TGFb激活肝脏疾病
肝细胞癌发病进展仅取决肿瘤细胞受损肝细胞取决素更全面观点肿瘤细胞宿基质间相互作肿瘤生长中起关键作越越明显样背景TGFβ通衡炎性细胞成纤维细胞活性肿瘤细胞生长进展协调微环境组分肿瘤细胞稳态[16]TGFb通炎性细胞活性中达衡负责协调微环境组分肿瘤细胞稳态[16]病毒性肝炎中着T调节细胞增加伴TGFβIL10分泌增加导致局部免疫抑制效应导致持续病毒感染[17]证实述事实Thiery事报道肝脏持续炎症常观察逆性逆转重塑包括纤维化早期肝硬化[1819] 种重塑特点细胞外基质（ECM）蛋白积累[20] 富含ECM沉积TGFb活化引起果ECM沉积没停止导致肝硬化终导致肝衰竭肝脏肝硬化状态导致发育良结节突变加重肝细胞癌早期阶段[21] Gressner等报道肝组织中癌细胞生长补充ECM微环境中TGFb结缔组织生长子激活[2223]阶段旨阻断肝病进展治疗性干预尤重防止肝细胞癌发生幸种疗法尚着肝肝硬化程进展常常观察具初始染色体变化发育良结节发育良结节进展肝细胞癌早期阶段肝脏组织中癌细胞生长富含ECMTGFβ结缔组织生长子介导环境中种肿瘤周围肝硬化间紧密相互作肝细胞癌显着特征
23特异性TGFb抑制剂肝癌治疗
Dituri事报道LY2157299水合物种靶TGFbRI丝氨酸苏氨酸激酶分子抑制剂发展[24]目前LY2157299表现出抗肿瘤力已床患胶质母细胞瘤肝细胞癌患者中进行评估[25]然体外体抗肿瘤活性表现然清楚研究LY2157299体外体抗肿瘤活性然挑战LY2157299代化合物LY2109761已选择体外体模型更理解肝细胞癌中活性Fransvea等够说明TGFb信号迁移入侵中作结LY2157299患者药理学水没表现出凋亡作效阻止肝癌细胞侵袭迁移[26]报道E钙粘蛋白水增加导致增加E钙粘蛋白组织中表达清液中E钙粘蛋白分泌减少Mazzocca事报道LY2157299负责CTGF生产阻断[27]种阻断减少实验模型中肿瘤生长会肝硬化程产生积极影响[28]LY2157299抑制新生血生成减少肝细胞癌生长进展部分原根Mazzocca等篇报道LY2157299间接阻断血皮生长子（VEGF）产生生物活性贝伐单抗药物更强样LY2157299阻断癌细胞中b1整合素活化阻止肝细胞癌细胞渗入血[29]肝细胞癌患者中甲胎蛋白（AFP）水报道着TGFβ1水升高增加[30]中皮间质转化（EMT）关键驱动素简言患者中LY2157299降低患者血浆中TGFβ1E钙粘蛋白水 Fransvea事证实LY2157299抑制TGFb信号时降低E钙粘蛋白分泌结[31]
目前止没发现特定药物治疗血浆TGFβ1E钙粘蛋白水改变关肝细胞癌治疗中没观察生物标志物应答[32] LY2157299阻断TGFb信号应时恰巧调节EMT床已患者产生效果E钙粘蛋白TGFβ1剂量水开发治疗肝病新药潜手段
24生物材料治疗肝癌
阿霉素（DOX）负载甘草次酸（GA）修饰海藻酸盐（ALG）纳米粒子（DOX GAALG）纳米粒子已证明治疗肝癌中广泛化疗药物[32] 田等先前已证明部分GA修饰壳聚糖（CTS）纳米颗粒注射180分钟开始肝脏中累积载DOX纳米颗粒显著阻断肿瘤生长[33]Zhang等实验研究MTT法测定空白GAALG NPsDOXHClDOX GAALG纳米粒体外细胞毒性作[34] 报道空白GAALG纳米颗粒具细胞毒性GAALG纳米颗粒作潜药物载体采含H22肝肿瘤昆明鼠评价DOX GAALG NPsDOXHCl抗肿瘤活性
报道组肿瘤重量相DOX GAALG NPs处理鼠肿瘤重量显著降低表明DOX GAALG NPs释放DOX具药理学活性够导致肿瘤细胞中细胞死亡项实验研究中Keming等通HAK1B异种移植裸鼠模型证实干扰素（IFN）a 2a透明质酸 酪胺（HATyr）水凝胶体结合抗癌作[35]实验证实含IFNα2aHATyr水凝胶治疗表现肿瘤消退没显著影响表明单独水凝胶具抗肿瘤效力[36]IFNα2a溶液治疗阻止肿瘤生长20天IFNα2a溶液组中记录均肿瘤PBS组没[37] 然掺入IFNα2aHATyr水凝胶治疗组显示出肿瘤明显减少[38]
外PBS组相HATyrsoftIFN处理组中鼠显示均肿瘤明显降低表明HATyr效递送负载IFNα2a者效抑制 肿瘤生长[39] Keming等报道说IFNα2a负载HATyr水凝胶研究中效调抗肿瘤趋势外观察HATyr水凝胶引起副作 报道HATyrsoftIFN处理鼠中肿瘤细胞细胞核密度组低证实HATyrsoftIFN具高抗肿瘤功效[40]
Ki67发现种细胞增殖相关核蛋白[41]相证明水凝胶处理鼠肿瘤切片中阳性细胞减少Keming研究中通细胞表面糖蛋白（CD34）染色检测IFNa 2a掺入水凝胶处理鼠肿瘤切片血生成该细胞表面糖蛋白（CD34）癌症血生成标志物[42]记录CD34阳性染色线性半圆形圆形图案表明形成新血然IFNα2a掺入水凝胶组中记录少CD34染色表明掺入IFN水凝胶处理鼠中血生成速率降低[39]
25干细胞通路治疗肝癌
LCSCs源目前尚清楚目前存两种假说：⑴起源正常干细胞肝脏干细胞基突变形成LCSCs⑵部分成熟肝细胞产生突变分化重新获更新力分化潜演变成LCSCsLCSCs具更新力推断样具更新力正常肝脏干细胞越越研究证支持观点卵原细胞目前较公认肝脏干细胞OV6卵原细胞标志物Yang等[43]肝癌细胞系肝癌组织中均发现群低分化OV6 + 细胞OV6 细胞更强成瘤力耐药性高表达肝脏干细胞种标志物ABCG2EpCAMckitAFP等表明具癌干细胞特性OV6 + 细胞源肝脏干细胞Yamashita等[44]研究表明EpCAM + AFP + 肝癌细胞具LCSCs特性肿瘤起始细胞EpCAMAFP分肝脏干细胞胚胎肝母细胞分子标志外已分离Huh7肝癌细胞系侧群细胞中发现736认肝脏干细胞分子标志CD29表达调[45] 目前数研究者认LCSCs正常肝脏干细胞基突变然学者认LCSCs产生已分化子代细胞次激活干细胞程序分化结果Bralet等[46]逆转录病毒介导方法鼠成熟肝细胞β半乳糖苷酶基进行标记发现肝切术生肝细胞致癌剂二乙基亚硝氨(DEN)刺激产生肝癌细胞中成熟肝细胞细胞例接分占183177表明成熟肝细胞损伤修复时产生肝细胞致癌素作产生肝癌提示已分化成熟肝细胞特定环境刺激分化演变成LCSCs肝癌干细胞（CSC）需量信号维持更新力性标记表型 诸EpCAMWnt β连环蛋白途径Sonic Hedgehog途径Notch途径信号干细胞调节保存肿瘤形成中发挥重作[47]然肝脏CSC初始形成信号通路出现受控制激活项正受广泛关注策略针控制未分化潜细胞中更新细胞命运决策CSC信号通路中部分具重发展作错综复杂交互作[48] 中WntNotchHedgehog通路治疗发展焦点 信号通路维持增强CSCs正常干细胞更新力方面起着重作 然正常干细胞CSCs间信号赖性CSCs治疗靶提供机会正常干细胞影响较
26分子信号治疗目标
数肝细胞癌（HCC）病例中证显示存慢性肝病种易感素包括慢性病毒性乙型肝炎丙型肝炎酒精性肝病代谢性肝病非酒精性脂肪性肝炎原发性胆汁性肝硬化原发性硬化性胆炎包括纤维化肝硬化病理性肝病发生[49]肝细胞损伤释放炎性细胞子氧化应激反应星状细胞门静脉成纤维细胞发生活化肌成纤维细胞转化导致纤维化发展终导致肝硬化处持续炎症氧化应激状态存够直接间接遗传毒性损伤煽动剂肝细胞增殖生损伤肝脏HCC成功靶治疗发展取决肿瘤细胞肿瘤生长程中增殖侵袭转移信号通路确定 HCC中发现重表观遗传学改变包括p16E钙粘蛋白超甲基化染色体臂处发现影响肿瘤抑制基染色体丢失缺失增加外染色体17p（TP53）13q（RB1）16p（AXIN1）9p（CDKN2A）16q（IGF2R）已鉴定出杂合性丢失HCC发生遗传机制包括p53CTNNB1PTEN等基突变[50]已发现种信号传导途径包括肝细胞生长子 MET表皮生长子受体 Ras 丝裂原活化蛋白激酶Wnt β连环蛋白PIK3CA Akt胰岛素样生长子信号级联NotchHedgehog（Hh）[51]数信号通路具独立作排相互作串扰重叠成功彻底根恶性肿瘤需开发抑制快速生长分化肿瘤细胞抗癌疗法然忽略CSC治疗耐药[52]治疗组合信号通路提供潜治疗方法终抑制协调癌性肿瘤生存生长信号[53]
27Notch作肝癌治疗靶点
Notch信号通路干细胞更新分化中发挥重作该信号传导途径中表达膜结合配体细胞表达跨膜受体细胞间接触表达受体细胞发出细胞命运调节信号通信系统该信号呈现级联转录调控事件形式影响数百种具文赖性表型结果基表达哺乳动物膜结合Notch配体两结构家族组成：Delta样配体（DLL）134四种跨膜Notch受体（Notch 14）相互作Jagged配体12 Notch受体细胞间接触程中配体结合激活导致构象变化先前受保护位点分金属蛋白酶γ分泌酶蛋白水解切割分释放细胞外细胞片段释放活跃Notch细胞结构域（NICD）细胞质中NICD易位细胞核里作Notch相关靶基转录激活子包括HESMycp21 Notch信号证明维持CSCs更新防止种实体癌神胶质瘤乳腺癌结肠癌中分化中发挥重作[52]活化细胞形式Notch3Notch配体JaggedHCC中高度表达[53]类HCC中报道Notch受体表达失调[54]迄止没报道直接显示Notch信号肝癌CSCs中作然鉴正常干细胞实体癌中作Notch途径HCC中发挥重作
Notch信号通路高度保守信号通路细胞间通讯中起着关键作胚胎发育整成年期调节细胞分化程肝脏中Notch协调胆命运形态发生已显示Notch信号许类型类癌症中发挥重作包括T细胞白血病淋巴瘤结直肠癌胰腺癌卵巢癌肺癌宫颈癌乳腺癌类型癌症[55] Notch癌症发展中参复杂Notch作癌基抑癌基取决组织信号通路存 Notch信号通四种受体（Notch1234）激活Delta Jagged家族五配体冗余方式相互作两项研究表明Notch1表达通促进细胞周期停滞细胞凋亡抑制HCC细胞生长相反证表明Notch激活肝癌发生中致癌作Giovannini等工作中通免疫组织化学60HCC中检测Notch1Notch3显着表达初类T细胞白血病中鉴定Notch信号直接抑制NotchT细胞急性淋巴细胞白血病具抗增殖作Wang等显示常观察Notch1 Jagged1低表达水Notch1 Jagged1信号调维持HCC中肿瘤进展 Notch1调显示通阻止细胞周期诱导凋亡延缓肝癌发生外高Notch3低Notch4表达水HCC关已报道Notch1通调节PTEN肿瘤抑制子参Ras Raf MEK ERK等信号通路交叉话Notch1信号传导激活增加死亡受体5表达水体外体增强肿瘤坏死子相关凋亡诱导配体诱导细胞凋亡证明Notch发育程中许细胞类型中Wnt β连环蛋白信号发生串扰NotchWnt信号相互作首先果蝇翅膀成盘中发现中NotchWnt1表达NotchWnt βcatenin信号传导间相互作协拮抗方式发生取决文Notchβ连环蛋白发生物理相互作通负调控果蝇中β连环蛋白活性调控Wnt信号传导种作表现出未切割NotchWnt信号拮抗作涉Notch配体CSL外Notch通降低β连环蛋白转录活性形式水作膜转录子作膜结合调节剂起作种形式βcateninSer37Thr41磷酸化通常构成总β连环蛋白部分哺乳动物干细胞祖细胞中Notch水活性β连环蛋白呈负相关 RAM结构域NotchCSL结合结构域活性β连环蛋白物理相互作调节必需活性β连环蛋白膜Notch调节独立GSK3β发生遗传分析显示膜Notch够调GSK3β功丧失导致β连环蛋白活性增加方面项研究表明axinAPC通调节膜Notch吞运输参种调节
28EpCAM作肝癌治疗靶点
潜EpCAM通路已证实靶标包括肝癌细胞数癌细胞中量表达解剖健康组织EpCAM位基底外侧膜CD9CD44紧密连接蛋白7形成复合物EpCAM结合抗体癌细胞中获性健康细胞低肝癌细胞中EpCAM强烈度表达EpCAMRNA干扰靶显著降低CSC库终降低肿瘤生长CSC侵袭力肝脏病理改变伴着EpCAM强表达例肝癌细胞中EpCAM作癌症干细胞标记物EpCAM + α胎蛋白肿瘤细胞表现出肝癌干细胞特征包括更新分化力够NOD SCID鼠中启动高度侵袭性肝细胞癌力量肝脏坏死时生反应涉类EpCAM阳性HSPC扩增细胞类型中没观察额外EpCAM阳性相反胆汁性肝硬化生涉具EpCAM膜性表达成肝细胞伴着HSPC扩增肝脏损伤期间（慢性丙型肝炎乙型肝炎）EpCAM标记肝细胞新鲜干细胞源肝细胞缺乏源肝细胞肝细胞提示EpCAM祖细胞关联事实EpCAM阳性肝细胞位反应附具EpCAM阴性肝细胞更长端粒长度表明起源慢循环HSPC综述鼠组织获数表明肝细胞分化伴着EpCAM阳性转变EpCAM阴性状态细胞部分重述胚胎肝发生基阶段EpCAM表达Wnt b catenin游靶点结果新靶点治疗发展产生影响[54]
29Wnt b catenin作肝癌治疗靶点
Yamashita等报道Wnt bcatenin信号通路干细胞更新保存必需[55]项实验研究表明抑制Wnt bcatenin信号通路增殖减少调细胞凋亡[56] 根Li事说法Wnt β连环蛋白信号通路通Dickkopf1（Dkk1）低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）结合抑制卷曲蛋白WntLRP6复合物形成抑制黄事开发报道新方法抑制称XAV939分子形式Wnt信号传导抑制导致轴蛋白（种支架蛋白）湮灭酶端链霉素酶Wnt β连环蛋白破坏复合物重组成成分[58]Wnt信号通路调节干细胞祖细胞扩增方面起着关重作 Wnt蛋白19高度保守糖蛋白组成作卷曲蛋白（Fz）跨膜受体配体激活Wnt受体受体低密度脂蛋白受体相关（GSK3β）β连环蛋白腺瘤性结肠息肉蛋白（APC）轴蛋白复合物解离β连环蛋白磷酸化减少β连环蛋白磷酸化连环蛋白稳定化进入细胞核里T细胞子（TCF）家族转录子活化 Wnt信号通路胚胎发育成体组织更新中发挥重作类HCC中报道异常Wnt信号1867％HCC肿瘤中已观察该信号传导途径激活核细胞β连环蛋白积聚然仅2030％HCC中检测β连环蛋白突变负性调节子axin1axin2功丧失突变HCC中非常罕见观察结果表明游元件肝癌发生程中激活Wnt β连环蛋白中起着重作次Wnt信号维护中作CSCs致瘤性已皮肤癌中证实突变β连环蛋白转导鼠肝干祖细胞获度更新力致瘤性Wnt β连环蛋白信号传导啮齿动物卵圆细胞OV6 +致瘤HCC细胞Oct4通调控Wnt β连环蛋白途径促进HCC癌细胞干细胞功HCC中EpCAM + CSCs调β连环蛋白EpCAM细胞β连环蛋白阴性表明CSC更新分化力受Wnt β连环蛋白信号调节发现表明Wnt β连环蛋白信号传导涉肝癌中CSCs维持
210Sonic hedgehog通路作肝癌治疗靶点
hedgehog通路肝癌细胞抑制效潜目标Hedgehog（Hh）信号通路控制胚胎发育程中干细胞维持种途径异常激活突变放松制已种样癌症中认 Hh通专门跨膜转运蛋白细胞中释放出位质网Hh N末端分配 Hh跨膜受体Patched 1（Ptch1）结合激活Smoothened（Smo）神胶质瘤相关癌基12（Gli1 2）Smo蛋白复合物释放转位细胞核导致Hh相关基转录激活果蝇类系物发现突变Ptch1基种罕见遗传性基底细胞癌中提供该通路参癌症第线索已证明Hh信号维持血液系统恶性肿瘤实体癌胃癌结肠癌乳腺癌胰腺癌关重Hh通路成分（ShhPtch1Gli1Gli2）表达已类HCC样中证实表达组织学分化门静脉侵袭密切相关项研究显示低分化HCC细胞系中皮间质转化Hh活性高分化良HCC细胞系增强Hh信号活动化学抗性侵袭原Stanton等已成功证实许音猬子分子调节剂控制髓母细胞瘤基底细胞癌活性[59]然Wang事报道通干扰RNA抑制肝细胞中Hedgehog通路导致肝癌细胞增殖减少增敏细胞5氟尿嘧啶（5FU）（种促凋亡剂）[ 60]外肝母细胞瘤中拮抗剂环巴胺阻断Hh信号HB细胞系细胞增殖具强烈抑制作[61]现数表明Hh信号通路HCC中重治疗靶点总体言CSC更新相关细胞途径靶久建立起
3肝癌干细胞诊断预潜力
肝癌干细胞（CSC）标记助HCC早期诊断Yamashita等报道胎肝细胞中表达甲胎蛋白（AFP）EpCAM起描述具干细胞特征癌细胞[62]Yang事证实HCC患者血液样中CD45 CD90 +提出检测血液中CD45 CD90 +细胞发现新HCC诊断技术非常重Yang等项研究中HCC患者收集34份血液样中31份鉴定出CD45CD90 +细胞正常19名受试者19名肝硬化患者中均未鉴定出CD45CD90 +细胞[63]结中指出HCC血液样中CD45 CD90 +群体存提示CSC全身血液循环中存证Maheswaran等份报告中FDA批准基磁性铁磁流体原理循环肿瘤细胞富集中EpCAM开发细胞检索系统设想肺部癌症预[64]结种方法连血清AFP检测亚组HCC患者预测结果根CSC理CSCs促进转移复发率影响患者预报道CSC群规模越预越差已篇关CSC作肝癌预工具报道Sasaki等CD133表达增加HCC患者存活肿瘤复发独立预子[65]
然HCC中度表达CD90预良关[66]外CD44CD24HCC中表达肝外转移频率较高生存期缩短[66]侵袭性肿瘤行增加床结局良相关[6667]Yamashita等报告中指出肝CSC标志物组合预测HCC预非常重够鉴定具干细胞特征EpCAM + AFP + HCCEpCAMAFPHCC相具良预结已独立队列中证实[68]杨等CD133CD44巢蛋白微血密度构建简化预测模型出结标记物高表达HCC患者分类术肿瘤复发高风险[69]
4讨
LY2157299抑制TGFb信号传导床应控制皮间质转化患者提供床疗效然更床研究应该量化E钙粘蛋白TGFβ1水进行研究会改变正进行床新药开发生物材料提供种潜效代方法通集成蛋白质治疗剂注射水凝胶系统提高装载蛋白质药物肝癌治疗中抗癌功效外DOX GAALG NPs增加DOX原位肝肿瘤抗肿瘤活性抑制EpCAMSonic Hedgehog等特定通路治疗帮助抑制肝脏中肿瘤生长然更床研究然需解阐明途径便开发精确药物阻断活动
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硕士类： 全日制专业学位硕士
文题目：槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长影响
摘
目：
苦参碱类生物碱苦参碱代表化学结构相似类生物碱具清热燥湿杀虫利尿等功效作广泛效果明显抗肿瘤活性成份 研究表明体外诱导K562细胞红系粒系分化抑制鼠移植性肿瘤生长诱导SMMC7721细胞分化体苦参生物碱抗肿瘤报道治疗肝炎毒副作提高免疫力 发展成抗癌新药
槐果碱苦参中分离出种苦参碱类生物碱已认种强烈抗病毒杀虫活性药物文献报道槐果碱美法仑原料利拼合原理制备MATMEL肝癌SMMC7721细胞具明显增殖抑制作然槐果碱肝癌中作机制未完全发现外文献表明槐果碱正常鼠定毒性实验选取株肝癌细胞SMMC7721株肝细胞LO2时应槐果碱作分析细胞学性改变机制探索新抗癌药物提供科学
方法：
（1）先利浓度梯度槐果碱处理SMMC7721根IC50筛选出两适浓度
（2）设立组两浓度槐果碱时处理SMMC7721LO2细胞然进行镜观察
（3）采MTT实验检测分析两种浓度槐果碱SMMC7721LO2细胞增殖影响
（4）采流式细胞凋亡实验检测两种浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响
（5）采线粒体膜电位检测两种浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度
（6）采Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl2BaxCleavedCaspase3表达水差异分析解释实验结果
结果：
（1） 槐果碱作SMMC7721IC505363（95CI 41276970）
（2） 选取500mgL1000mgL槐果碱处理细胞500mgL槐果碱浓度LO2SMMC7721细胞分布密度明显减少部分细胞皱缩1000mgL槐果碱浓度两种细胞分布密度明显降低均出现定程度细胞皱缩
（3） MTT结果显示着药物浓度升高两种细胞OD值均明显降（P<005）浓度增殖力明显差异（P>005）
（4） 流式细胞术测定结果够显示槐果碱作两种细胞总凋亡率均着浓度升高增加高浓度肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞（P<005）
（5） 线粒体膜电位检测结果显示槐果碱作两种细胞线粒体膜电位水均着浓度升高降低（P<005）
（6） Western blot法结果够显示着槐果碱浓度升高两种细胞Bcl2水均减少BaxCleavedCaspase3蛋白水均升高
结：槐果碱够通调肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞BaxCleavedCaspase3蛋白表达水抑制Bcl2蛋白表达达抑制两种细胞增殖力降低两种细胞线粒体膜电位水促进细胞凋亡作提示槐果碱抑制肝癌生长时着避免肝细胞损伤等毒副作
关键词：槐果碱肝肝癌增殖凋亡体外试验
目 录
第章 绪1
11 引言1
12 研究目意义5
13 实验技术5
14 实验方案设计5
15 参考文献6
第二章 槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长力影响10
21 实验材料10
211 细胞株10
212 试剂10
213 仪器10
22 实验方法11
221 细胞培养11
2211 细胞复苏12
2212 细胞传代培养12
2213 细胞冻存13
222通显微镜观察浓度槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞形态学改变清况14
223 MTT实验检测分析浓度槐果碱SMMC7721LO2细胞增殖抑制影响15
224 采流式细胞凋亡实验检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响16
225 采线粒体膜电位检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度16
226采western blot法检测浓度槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响17
227 统计学处理17
23 实验结果17
231 槐果碱肝癌细胞增殖力影响17
232 槐果碱肝细胞肝癌细胞增殖抑制作较18
233 槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡影响较19
234槐果碱肝细胞肝癌细胞线粒体膜电位影响较20
235槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响21
24 实验讨 21
25 参考文献23
综述24
硕士读期间发表文45
致谢46
注释表
英文缩写
英文全称
中文名称
MATMEL
Matrinemelphalan
苦参碱美法仑复合物
BCL2
Bcell leukemia2
B淋巴细胞瘤2基
OD
optical density
光密度
HBV
Hepatitis B virus
乙型肝炎病毒
HCV
Hepatitis C virus
丙型肝炎病毒
HP
Helicobacterpylori
幽门螺杆菌
MT
Matrine
苦参碱
MTT
3(45Dimethylthiazol2yl)25diphenyltetrazolium bromide
噻唑蓝
DMEM
Dulbecco＇s modified eagle medium
改良杜氏伊格尔培养基
FBS
Fatal bovine serun
胎牛血清
PBS
Phosphate buffer saline
磷酸缓盐溶液
DMSO
Dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
RIPA
RadioImmunoprecipitation Assay
ripa裂解液
GAPDH
Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase
甘油醛3磷酸脱氢酶
OMT
Oxymatrine
氧化苦参碱
PVDF
Polyvinylidene fluoride
聚偏二氟乙烯膜
TBST
TBS Tween
TrisHCl缓盐溶液
ECL
ElectroChemiLuminescence
电化学
DNA
Deoxyribonucleic acid
脱氧核糖核酸
MOMP
Major outer membrance protein
膜外蛋白
ASX
astaxanthin
虾青素
ROS
Reactive oxygen species
活性氧
FAS
fattyacidsynthase
脂肪酸合成酶
第章 绪
11 引言
原发性肝癌简称肝癌指肝细胞肝胆皮细胞者两者混合发生恶性肿瘤肝癌床常见恶性肿瘤恶性程度高发展迅速初期症状明显发现时已处癌症晚期晚期患者癌细胞扩散转移导致预良已成世界恶性肿瘤致死第2位病[1]目前肝癌世界男性第5常见肿瘤女性第7常见肿瘤[2]中国年死肝癌约383万约占世界51[3]肝癌致死率已跃居国恶性肿瘤致死原第2位[3]目前肝癌全球发病率呈升趋势2014年2月3日世界卫生组织发表全球癌症报告2014显示中国新增癌症病例高居世界第位中肝癌新增病例死亡数均居世界首位肝癌已成严重威胁类健康社会济发展社会问题积极寻找肝癌危险素研究肝癌发病机制终达根治肝癌前中西医学届迫切需解决问题
肝癌发病原机制较复杂中HBVHCVHP感染生活饮食素遗传素环境素等造成肝癌发病率断增长原年许学者研究认慢性HBVHCV感染肝癌发生独立危险素约四分三肝癌患者感染HBVHCV致[4]中国等发展中国家中慢性HBV感染肝癌发病首危险素乙肝患者访研究报道显示HBV患者发生肝癌概率非HBV携带者984倍[4]HCV感染发达国家肝癌发生危险素病例访研究证实HCV抗体阳性患者较非HCV携带者发生肝癌风险增加20倍[5]着乙型肝炎病毒疫苗断推广HBV相关性肝癌发生率较HCV相关性肝癌发病率明显降[6 7]
肝癌治疗包括手术治疗非手术治疗肝癌佳治疗方法手术切肝切术肝脏移植射频消融术认目前肝癌具治愈性效果3种方法[8]肝癌起病隐匿病程短恶性程度高易复发转移患者肝癌认知较少般发现时已中晚期难手术治疗肝癌五年生存率低9[9]年着影学分子生物学中医中药学等断发展进步肝癌治疗传统外科手术转变方法综合序贯治疗甚体化治疗肝癌非手术治疗包括：放化疗介入治疗消融治疗肝移植分子靶治疗生物治疗中医药治疗等治疗手段药物化疗肝癌治疗手段中中药中起着关重作中药天然药物中寻找特异性强低毒性治疗药物种新治疗思路
亚洲区肝癌种常见癌症肝癌患者表现出相似床病理特征然治疗预结果细胞毒性化疗肝癌治疗方式化疗患者预差生存率低生活质量差务急积极寻找更新型抗癌药物代化疗药物者降低化疗药物副作中[10 11]天然植物化学提取物神系统心血分泌系统等系统疾病中良治疗效果成研究热点尤肿瘤预防治疗天然植物化学提取物表现出极优势天然植物化学提取物成新代抗癌药物目前天然植物化学提取物：苦参碱类生物碱姜黄素33＇二吲哚基甲烷芹菜素白藜芦醇花青素槲皮素等研究热点植物化学提取物具抗氧化抗炎抗血栓形成抗动脉粥样硬化等重功效[12 13]时参凋亡噬等种信号通路影响肿瘤血形成侵袭迁移等[1417]Maan等研究显示植物化学提取物肝癌具较防治作[18]
苦参碱类生物碱苦参碱代表化学结构相似类生物碱苦参碱氧化苦参碱槐定碱槐果碱槐胺碱等药效接具清热燥湿杀虫利尿等功效作广泛效果明显[19]苦参碱名田菊健分子式 C12H24N20苦参碱作传统中药成分源豆科植物苦参根药理成分苦参碱(MT)氧化苦参碱(OMT)苦参碱药理作广泛抗肿瘤活性成份 研究表明体外诱导K562细胞红系粒系分化抑制鼠移植性肿瘤生长诱导SMMC7721细胞分化[20]体苦参生物碱抗肿瘤报道治疗肝炎毒副作提高免疫力 发展成抗癌新药苦参碱抗炎抗肿瘤生长分子机制尚未完全阐明
早年苦参中分离出生物碱证明苦参碱(matrine)氧化苦参碱(oxymatrine)成分含量少生物碱没进步研究[21]年着分析分离技术进步量研究发现含少量槐果碱(sophocarpine)氧化槐果碱(oxysophocarpine)槐啶碱(sophoridine)槐胺碱(sophoramine)槐醇碱(sophoranol)莱曼宁(lehmannine)等20种生物碱[22]国外量研究表明苦参碱类化合物方面药理作抗心率失常抗动脉粥样硬化保肝利胆升高白细胞治疗湿疹乙型肝炎等年报道较强抗肿瘤活性作黑色素瘤胃癌膀胱癌皮性卵巢癌乳腺癌等程度抑制作[2326] 苦参碱抗肿瘤机制较复杂靶点途径作亮点通查阅量国外文献发现涉苦参碱类化合物研究国居国外较少
目前关苦参碱研究3方面苦参作天然药物利现代先进分离分析技术成分苦参碱等进行分离分析二苦参作传统中药治疗效果药理床功方面研究研究苦参种类型制剂抗菌抗炎抗敏抗肿瘤抗心率失常消肿利尿免疫生物调节等作研究药理程中苦参碱药动学分子结构生物活性三苦参碱全合成结构修饰药物联合应研究方面尤槐果碱研究苦参碱研究相较少[27]期文献报道槐果碱美法仑原料利拼合原理制备MATMEL肝癌SMMC7721细胞具明显增殖抑制作[28]然槐果碱肝癌中作机制未完全发现外文献表明槐果碱正常鼠定毒性[29]
细胞死亡指细胞受严重损伤时出现结构破坏代谢停止功丧失等逆性变化[30]细胞死亡分：细胞坏死细胞凋亡细胞坏死（Necrosis）指种物理化学素病理刺激引起细胞损伤死亡种细胞病理性非正常死亡[31]坏死时细胞形态表现体积变细胞膜破裂细胞容物外溢细胞核变化明显引起局部炎症反应细胞凋亡（Apoptosis）指机体维持环境稳定动采取结束细胞生命活动1972年Kerr首次提出细胞凋亡概念发生凋亡时细胞表现体积变核质浓缩核膜核仁碎裂DNA降解凋亡发生时细胞容物外溢局部引起炎症反应[32]细胞凋亡残留细胞容物分割形成凋亡体（Apoptosome）值注意[33]细胞程序性死亡指特定基程序性表达介导细胞死亡细胞凋亡细胞程序性死亡中种类型Ⅰ型程序性细胞死亡特指伴细胞形态学变化种生理性死亡方式两者概念混淆早1994年美国著名生物学家Martin细胞凋亡细胞程序性死亡行区分
细胞凋亡信号通路死亡受体途径质网途径线粒体途径三部分构成[34]具体表现：（1）线粒体途径称源性途径该途径分赖Caspase途径赖Caspase途径凋亡促凋亡素刺激线粒体中Cytc释放进入胞质Apaf1 (凋亡蛋白酶)结合成聚体该聚体Caspase9（凋亡起始分子）结合成凋亡体Caspase9激活继激活Caspase367等系列激活凋亡级联反应分子赖Caspase途径凋亡直接通线粒体释放凋亡诱导子AIF促进诱导凋亡发生值注意研究证实[35]Bcl2家族通调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilizationMOMP）实现CytC释放Wang等[36]已证实Bcl2蛋白家族通线粒体途径激活细胞死亡观点线粒体途径中Bcl2家族蛋白调控关重Bcl2家族蛋白分两类促凋亡蛋白（ BaxBakBimBadBid等）抗凋亡蛋白（Bcl2BclXL等）细胞受损时促凋亡蛋白激活抗凋亡蛋白功受抑诱导细胞凋亡发生[37]（2）质网途径：质网应激时细胞钙离子稳态失衡出现钙超载时Caspase 12会激活活化Caspase 12进步激活游Caspase 9促进凋亡发生（3）死亡受体途径TNF Fas等死亡受体FADD（具死亡功区Fas相关蛋白）结合激活Caspase 8 Caspase 10进激活游凋亡执行分子Caspase367促进凋亡发生
细胞生长失程序性调控时会导致肿瘤细胞凋亡效抑制细胞异常增殖抑制肿瘤发生白藜芦醇作宫颈癌细胞时激活细胞ERK12发生核转移继P53发生磷酸化抑制核转录子（NFＫB）活性诱导细胞凋亡[38 39]体外实验证明[40]熊氧胆酸通激活肝癌BEL7402细胞凋亡发挥抗肝癌效应天然抗肿瘤活性物质三萜皂苷（giganteaside D GD)激活肝癌细胞线粒体赖性细胞凋亡途径激活活性氧(reactive oxygen species ROS)产生阻断ROS产生会减弱线粒体途径介导细胞凋亡效应[41]显著抑制肿瘤细胞生长虾青素（Astaxanthin ASX）具强抗氧化抗炎抗肿瘤活性ASX通抑制PI3KAkt ERK活性调Wntβcatenin表达阻断NFＫB p65核转录发挥肝癌细胞增殖抑制凋亡效应[42]前列腺癌乳腺癌卵巢癌等肿瘤中会脂肪酸合酶（FAS）高水表达Fan等研究者证实[43]姜黄素作FAS效抑制剂蛋白基层面抑制FAS表达活性诱导乳腺癌MDAMB231细胞凋亡姜黄素促进乳腺癌细胞促凋亡蛋白Bax表达抗凋亡蛋白Bcl2水明显调说明姜黄素通激活乳腺癌细胞凋亡途径实现抗肿瘤效应
综述细胞失基调控生长会导致肿瘤发生细胞凋亡作基调控细胞正常死亡方式成肿瘤治疗新靶点
12研究目意义
苦参碱床常抗肝纤维化保肝抗乙肝病毒等文献证实效抑制肝癌细胞株HepG2增殖具直接杀伤作司维柯等苦参碱抑制肝癌细胞HepG2增殖时效量效进行全面研究通苦参碱诱导肝癌细胞凋亡细胞阻滞GOG1期细胞进S期进行DNA合成终瘤细胞体外增殖受抑制发挥抗肝癌作然苦参碱类生物碱肝癌中作机制未完全发现实验旨研究较槐果碱肝癌细胞肝细胞生长影响探索新抗癌药物提供科学
13实验技术
文拟采MTT法流式细胞术western bolt法线粒体膜电位检测等方法研究槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长影响
14实验方案设计
15参考文献
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第二章 槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2生长力影响
21 实验材料
211 细胞株
肝癌细胞SMMC7721购复旦IBS细胞资源中心肝细胞LO2购海拜力生物科技限公司
212 实验试剂
（1）槐果碱（纯度：98） 南京普怡生物科技限公司
（2）细胞培养基DMEM（高糖） Gibco公司（美国）
（3）细胞培养基1640 Gibco公司（美国）
（4）胎牛血清（FBS） 杭州四季青青生物工程材料限公司（杭州）
（5）磷酸缓生理盐水（PBS） Gibco公司（美国）
（6）胰蛋白酶 Gibco公司（美国）
（7）二甲基亚砜（DMSO） Sigma公司（海）
（8）RIPA裂解液(中) 碧云天生物技术研究
（9）样缓液 碧云天生物技术研究
（10）四甲基噻唑蓝（MTT） Sigma公司（海）
（11）BCA蛋白测定试剂盒 碧云天生物技术研究
（12）JC1试剂盒 碧云天生物技术研究
（13）细胞凋亡检测试剂盒 北京康世纪生物技术限公司
（14）鼠抗Bcl2克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
（15）鼠抗Bax克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
（16）鼠抗GAPDH单克隆抗 北京博奥森生物技术限公司
（17）鼠抗CleavedCaspase3克隆抗体 北京博奥森生物技术限公司
213 实验仪器
（1）培养箱 Thermo 公司美国
（2）倒置显微镜 Olympus 公司日
（3）超净工作台 苏州净化设备公司中国
（4）80℃超低温冰箱 Thermo Fisher 公司美国
（5）冰箱（4摄氏度） Sanyo 公司日
（6） 恒温水浴锅 长沙基隆仪器仪表限公司
（7）制冰机 Gelin 电器限公司中国
（8）37摄氏度恒温箱 福意电器北京限公司
（9）加样器 GILSON 公司法国
（10） 电泳仪 (DYY6C) 北京六仪器限公司
（11）电泳凝胶成系统 Biotech 公司中国
（12） Sartorius ME215S 型号电子天 赛利斯公司德国
（13） 电转印仪 BioRAD 公司美国
（14） 功酶标仪(BioTek Synergy HT) BioRAD 公司美国
（15） 超速离心机(55P72) Hitacht 公司日
（16） 细胞培养板 Corning 公司美国
（17） 流式细胞仪 BD 公司美国
（18）显微摄系统(SP0tVersion35) Diagnostieinsturmenislne美国
（19） 紫外分光光度计 精密科学仪器海限公司
（20） STSl 型脱色摇床 海门市麒麟医仪器限公司
22 实验方法
221 细胞培养
2211 细胞复苏
（1）进入菌室前肥皂洗手碘伏消毒75酒精擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）液氮中取出含SMMC7721肝癌细胞冻存直接浸入37℃水浴箱中手摇动融化位
（3）37℃水浴箱中取出含SMMC7721肝癌细胞冻存置紫外线射超净台接着开盖子吸缓慢吸出SMMC7721肝癌细胞悬液加滴加10倍体积培养液离心混匀
（4）开离心机设置转速1000转分钟离心时间设置5min
（5）置紫外线射超净台弃离心清液加入含10浓度胎牛血清培养液重悬细胞计数含10浓度胎牛血清培养液调整细胞密度接种新培养瓶37摄氏度5C二氧化碳培养箱静置培养
（6）第二日更换次培养液（含10浓度胎牛血清培养液）继续培养
（7）样方法处理L02肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
2212 细胞传代培养
（1）进入菌操作室前肥皂清洁洗手碘伏消毒75酒精均匀擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）利倒置显微镜仔细观察SMMC7721肝癌细胞形态确定SMMC7721肝癌细胞否需进步传代SMMC7721肝癌细胞胞需具体稀释倍数培养液放置37摄氏度水浴箱进行预热
（3）保证超净台台面应整洁01浓度新洁尔灭溶液含75浓度酒精棉球擦洗干净
（4）开超净台紫外灯射台面时间约20 30 min左右进行细胞传代前关闭超净台紫外射灯开抽风机抽风清洁超净台空气臭氧
（5）火机点燃超净台酒精灯调节酒精灯火焰宜猛手出菌试巴斯德吸带刻度吸75浓度酒精消毒置超净台缓慢酒精灯火焰稍微烧插入菌试
（6）含10浓度胎牛血清培养液瓶口75浓度酒精进行消毒酒精棉球擦干缓慢酒精灯火焰倾斜放置超净台酒精灯旁边试架子
（7）旧细胞培养瓶缓慢酒精灯火焰开瓶盖次稳定酒精灯火焰倒掉含培养细胞培养瓶旧培养基适情况采2 3 毫升Hanks洗涤液残留两滴旧培养基利少量胰酶刷洗旧培养瓶瓶口
（8）次加入约1 2 mLPBS液体旧培养瓶瓶口酒精灯火焰倒掉培养瓶加入PBS液体重复操作三次该步骤
（9）旧培养瓶加入1mL胰酶瓶量酌减瓶量酌加旧培养瓶瓶口酒精灯火焰盖瓶盖倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态变化放入37 摄氏度5 二氧化碳培养箱培养概约分钟时间左右轻轻出旧培养瓶倒置显微镜观察时SMMC7721肝癌细胞形态变化SMMC7721肝癌细胞已收回突起变圆形状时马培养瓶入超净台立加入约2 毫升新鲜含10浓度胎牛血清培养液中胰酶时注意细胞早脱落进入培养瓶消化液中切勿胰酶直接倒入废弃缸
（10）加入少量含10浓度胎牛血清新鲜培养基反复吹已消化SMMC7721肝癌细胞够脱壁进步分散旧培养瓶底细胞基脱落培养液时含SMMC7721肝癌细胞培养液加入新离心开离心机设置转速1000转分钟离心时间5分钟
（11）离心完重新置紫外线灯射超净台离心口稳定酒精灯火焰开盖口次酒精灯火焰倒掉清液加入含10浓度胎牛血清新鲜培养基根分传培养瓶数量补加定量含10浓度胎牛血清新鲜培养液(4~6mL瓶8~12mL瓶)已制成细胞悬液分开装新细胞培养瓶利二氧化碳气体进入盖细胞培养瓶盖适程度拧紧点稍微回转培养瓶放回5二氧化碳37摄氏度培养箱中
（12）样方法处理LO2肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
（13）切记已悬浮培养细胞实验步骤79步做该实验操作
2213 细胞冻存
（1）进入菌操作室前肥皂清洁洗手碘伏消毒75浓度酒精擦拭消毒双手穿消毒处理白褂戴口罩戴帽子
（2）利倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态确定SMMC7721肝癌细胞否够冻存培养液置37℃水浴箱预热
（3）提前进行配方制成细胞冻存液配方10 浓度DMSO + 90浓度胎牛血清放置温度4摄氏度冰箱中保存进行预冷
（4）含EDTA胰酶消化液SMMC7721肝癌细胞进行消化处理次加入概约2 mLPBS清洗液体旧培养瓶瓶口酒精灯火焰倒掉加入PBS液体重复该步骤操作三次旧培养瓶加入概约1mL胰酶消化液瓶考虑量酌减瓶量酌加旧培养瓶瓶口酒精灯火焰盖瓶盖倒置显微镜观察SMMC7721肝癌细胞形态变化放入37 摄氏度5 二氧化碳培养箱进行培养约分钟左右出旧培养瓶倒置显微镜观察时SMMC7721肝癌细胞形态变化细胞收回突起变圆时立培养瓶入紫外线灯射超净台立加入约2 mL新鲜含10浓度胎牛血清细胞培养液中胰酶注意里勿SMMC7721肝癌细胞提早脱落入胰酶消化液中切勿胰酶直接倒入废弃缸加入少量含10浓度胎牛血清新鲜细胞培养基反复进行吹已消化SMMC7721肝癌细胞够脱壁表现分散状态旧培养瓶底细胞基脱落培养液时含SMMC7721肝癌细胞培养液加入新离心开离心机设置转速1000转分钟离心时间设置5分钟离心完重新置紫外线灯射超净台离心口缓慢酒精灯火焰开盖口次缓慢酒精灯火焰倒掉清液
（5）次新鲜含10浓度胎牛血清完全培养液重新悬浮SMMC7721肝癌细胞已预冷完毕细胞冻存液加入已消化充分彻底SMMC7721肝癌细胞中塑料滴进行轻轻慢慢吹达混匀状态
（6）分支冻存中缓慢加入体积约1ml细胞悬液彻底密封完毕清晰标记冻存SMMC7721肝癌细胞名称冻存天日期时间
（7）样方法处理L02肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
（8）冻存相关步骤否够细致化操作十分关系SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞次复苏复活时活力程度复苏SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞存活率果够拥程序细胞降温器(放入温度80摄氏度冰箱中直第二天进步放置入液氮罐中进行长期保存)合适者通含冻存SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞冻存中放置4摄氏度冰箱中维持时间2h然进步转20摄氏度冰箱中维持时间2h然进步转80摄氏度冰箱中维持时间2h放置入液氮罐中进行SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞长期保存
222 通显微镜观察浓度槐果碱SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞细胞形态学改变
（1） 数生长期SMMC7721肝癌细胞置六孔板37摄氏度5CO2细胞培养箱进步进行培养培养时间24h细胞密度50时分0mgL500mgL1000mgL浓度槐果碱作SMMC7721肝癌细胞
（2） 加药时间48h换液含10浓度胎牛血清新鲜DMEM细胞培养液通显微镜仔细观察视野SMMC7721肝癌细胞形态变化电脑拍记录
（3）样方法处理LO2肝细胞注意选含10浓度胎牛血清1640
细胞培养液
223MTT法检验浓度槐果碱SMMC7721肝癌细胞LO2肝细胞增殖力影响
（1）先SMMC7721肝癌细胞提前种六孔板163264125250500100020004000mgL槐果碱处理SMMC7721肝癌细胞48h025浓度胰酶消化液处理数生长期SMMC7721肝癌细胞细胞分进行收集计数时细胞密度调整1×104mL96孔板孔100μL定量细胞悬液缓慢精准加入时设置组加入等体积细胞培养液组设置5复孔保证孔含4μLmLDMSO37摄氏度5二氧化碳细胞培养箱中继续培养SMMC7721肝癌细胞培养时间48h
（2）吸吸取96孔板孔液体时保持心做精准时预先已配置混合均匀50μL含MTTDMEM细胞培养基加入孔中MTTDMEM细胞培养基配方10μL：90μL96孔板未加入细胞悬液处设5复孔时孔中需心精准加入100μL含MTTDMEM细胞培养基时37摄氏度5二氧化碳培养箱中继续培养SMMC7721肝癌细胞培养时间4h
（3）心吸出96孔板孔孔液体加入剂量150μL DMSO溶液孔室温温度较低速度进行震荡震荡时间约12min18min直紫色结晶已彻底溶解酶标仪OD568准确测定96孔板孔吸光值
（4）样方法处理LO2肝细胞注意选细胞培养基1640
（5）抑制率（IC）1（槐果碱组OD值空白OD值）（未槐果碱组OD值空白OD值）×100
（6）根组抑制率IC50选取较低抑制率浓度B较高者C组A浓度进行续试验
224 采流式细胞凋亡实验检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞凋亡影响
（1） 含EDTA025浓度胰酶消化液进行消化SMMC7721肝癌细胞
（2） 终止消化收集细胞悬液开离心机设置转速1000转分钟离心时间约5min吸心离心清液
（3） 吸离心滴入PBS洗液进行细胞重悬吸吸取PBS洗液SMMC7721肝癌细胞进行润洗2次时开离心机设置转速1500转分钟离心时间约46min
（4） 根Annexin VPE7AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行实验操作：首先离子水13稀释Binding Buffer250 μl Binding Buffer重新悬浮SMMC7721细胞调节浓度1×106ml 取 100 μl SMMC7721细胞悬液 5 ml 流式中加入 5 μl Annexin VPE 10 μl 7AAD 溶液混匀室温避光孵育 15 分钟 反应中加400 μl PBS流式细胞仪（FACS）分析
225采线粒体膜电位检测浓度槐果碱作SMMC7721LO2细胞线粒体极化程度
(1) 选取三组SMMC7721细胞应药物浓度ABC
(2) 处理48hSMMC7721细胞消化离心重悬05mlDMEM细胞培养液中加入05ml JC1染色工作液混匀37℃孵育20分钟
(3) 600g 4℃离心机离心34分钟沉淀细胞弃清JC1染色缓液洗涤2次适量JC1染色缓液重悬荧光分光光度计检测
(4) 检测JC1单体（绿色荧光）时激发光设置490nm发射光设置530nm检测JC1聚合物（红色荧光）时激发光设置525nm发射光设置590nm红绿荧光相值作衡量线粒体极化程度
(5) 样方法处理LO2肝细胞注意选细胞培养液1640
226Western blot试验检测槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响
（1） 取组处理48h细胞加入适量细胞裂解液置冰裂解离心提取清分光光度计定量加样缓液煮沸取定量1820μL细胞蛋白样进行SDSPAGE胶电泳进转移PVDF膜含5浓度脱脂奶粉TBST（封闭液）进行PVDF膜浸泡操作室温进行摇床封闭操作时间2h
（2）封闭液相应抗进行稀释操作稀释倍数（11000）进步PVDF膜含相应抗孵育液中进行浸泡4摄氏度温度孵育第二天TBSTPVDF膜进行充分彻底洗涤洗涤次数3次次洗涤时间维持约5min紧接着 TBST封闭液相应二抗进行稀释操作稀释倍数（11000）进步PVDF膜含相应二抗孵育液中进行浸泡室温温度进行摇床孵育时间二时
（3）TBST充分洗涤PVDF膜3次5min次
（4）进暗房开始曝光张膜缓慢滴加合适量ECL底物液孵育时间约数分钟等膜出现明显荧光条带进步滤纸轻轻吸膜余底物液
（5）然轻轻覆盖层保鲜膜新避光保存X光胶片进行压片操作压片时间约1015min紧接着次放入适量显影液显影等胶片显影放入定影液进行定影GAPDH作参注意暗房操作注意彻底避光
227 统计学处理
实验数均数±标准差表示组间均数较采单素方差分析组间两两较采LSDt检验方差齐时采Tamhanes T2法结果数均采SPSS 200软件Graphpad 60软件进行统计学分析P < 005差异统计学意义
23 实验结果
231 槐果碱肝癌细胞增殖力影响
槐果碱作SMMC7721细胞48h着槐果碱浓度升高肝癌细胞增殖抑制作增高中IC505363（95CI 41276970）选A浓度未加槐果碱0mgLB浓度500mgLC浓度1000mgL
图1 浓度槐果碱SMMC7721增殖抑制作
232槐果碱肝细胞肝癌细胞增殖抑制作较
通显微镜镜观察槐果碱作肝细胞肝癌细胞48h形态学改变见图结果显示A浓度条件LO2SMMC7721细胞分布密度较形态较清楚B浓度LO2SMMC7721细胞分布密度明显减少部分细胞皱缩C浓度两种细胞分布密度明显降低均出现定程度细胞皱缩次通MTT检测检测槐果碱作肝细胞肝癌细胞48h吸光度值OD值该指标代表细胞存活情况[6]结果显示着槐果碱浓度升高两种细胞吸光度值明显降低（P<0001）浓度两种细胞吸光度值水明显差异（P>005）见槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2均明显增殖抑制作浓度两种细胞增殖抑制力没明显差异
图2 SMMC7721细胞LO2细胞浓度槐果碱处理48h形态学改变（×200） A未槐果碱处理SMMC7721细胞B500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞C1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞D未槐果碱处理LO2细胞E500mgL槐果碱处理LO2细胞F1000mgL槐果碱处理LO2细胞
细胞株
槐果碱浓度（mgL）
F值
P值
0
500
1000
SMMC7721
123±031
070±011
051±006
1868
<0001
LO2
131±019
078±024
057±017
1779
<0001
t值
0492
0678
0744
P值
0636
0517
0478
233槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡影响较
槐果碱作SMMC7721肝癌细胞48h总凋亡率着槐果碱浓度升高增加槐果碱作LO2肝细胞48h总凋亡率着槐果碱浓度升高增加说明槐果碱抑制肝癌细胞时然造成肝细胞损害外500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞凋亡促进率（201±014）500mgL槐果碱处理LO2细胞凋亡促进率（185±009）两者间明显差异（P>005）1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞凋亡促进率（496±019）明显低1000mgL槐果碱处理LO2细胞凋亡促进率（708±022）P<001低浓度槐果碱肝癌细胞肝细胞促凋亡作明显差异高浓度槐果碱肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞
图3 流式细胞凋亡结果 A未槐果碱处理SMMC7721细胞B500mgL槐果碱处理SMMC7721细胞C1000mgL槐果碱处理SMMC7721细胞D未槐果碱处理LO2细胞E500mgL槐果碱处理LO2细胞F1000mgL槐果碱处理LO2细胞
234槐果碱肝细胞肝癌细胞线粒体膜电位影响较
浓度槐果碱作SMMC7721细胞LO2细胞48h线粒体膜电位水均明显降高浓度组红绿例明显低低浓度组说明着浓度升高线粒体膜电位水明显降造成线粒体膜稳定
图4 线粒体膜电位水检测（n3）
a 药组红绿例明显低组
b 高浓度组红绿例水明显低低浓度组
235槐果碱肝细胞肝癌细胞凋亡相关蛋白表达水影响
利western blot技术检测SMMC7721LO2细胞Bcl2BaxCleavedCaspase3蛋白水中两种细胞Bcl2水均槐果碱浓度升高递减BaxCleavedCaspase3蛋白水均槐果碱浓度升高增加（图5）
图5 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水 A western blot显示SMMC7721蛋白表达条带B SMMC7721细胞蛋白相蛋白表达量（n3）C western blot显示LO2蛋白表达条带D LO2细胞蛋白相蛋白表达量（n3）
a药组蛋白表达水明显低组
b高浓度组蛋白表达水明显低低浓度组
c药组蛋白表达水明显高组
d高浓度组蛋白表达水明显高低浓度组
24实验讨
原发性肝癌起源肝脏皮组织国高发危害极恶性肿瘤流行病学表明乙型肝炎病毒（HBV）丙型肝炎病毒（HCV）感染黄曲霉素肝癌发病相关关键素[7]苦参认种具强烈抗病毒杀虫活性药物够效抗乙肝病毒[89]槐果碱作种苦参碱类生物碱样具抗乙肝病毒作[10]够效抑制肝癌细胞增殖力[4]然槐果碱具定毒性肝脏常受累器官[5]槐果碱认双刃剑抑制肝癌细胞生长抗乙肝病毒时会造成定程度肝细胞损伤研究选取肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2作研究象首先通MMT法检测浓度槐果碱SMMC7721增殖抑制作筛选出两适宜浓度500mgL1000mgL两浓度处理SMMC7721LO2细胞结果发现：1槐果碱作两种细胞细胞分布密度降低出现定程度细胞皱缩2然着槐果碱浓度升高两种细胞均受明显抑制浓度两种细胞增殖力明显差异3槐果碱作两种细胞总凋亡率均着槐果碱浓度升高增加高浓度槐果碱肝细胞促凋亡作明显高肝癌细胞4槐果碱作两种细胞线粒体膜电位水均着槐果碱浓度升高降低5着槐果碱浓度升高两种细胞Bcl2水均减少BaxCleavedCaspase3蛋白水均升高见槐果碱肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2均着明显抑制生长促进凋亡作提示槐果碱抗肝癌时会避免肝细胞造成定损害研究仅体外试验槐果碱抗癌毒性进行分析发现细胞增殖抑制明显差异肝细胞促进凋亡作尤明显损害程度需进步动物实验进步确认
文献槐果碱抗肿瘤方面研究较少文献表明槐果碱衍生物氧化槐果碱够通体外培养SW480肠癌细胞MCF7乳腺癌细胞阻滞G0G1期时调Caspase3抑制Bcl2表达达抑制细胞增殖促进细胞凋亡作该作呈定时间剂量赖性[1112]外研究证实氧化槐果碱够效降低鼠急性中毒反应[5]改变槐果碱分子结构减少肝细胞损伤减少抗肝癌程中毒副作仅进步动物实验中通肝动脉注射槐果碱溶液方式更加准确攻击原发灶致避免槐果碱损害正常肝组织脏器[13]
综述槐果碱够通调肝癌细胞SMMC7721肝细胞LO2细胞BaxCleavedCaspase3水抑制Bcl2表达达抑制两种细胞增殖力降低线粒体膜电位促进凋亡作外高浓度槐果碱促进LO2细胞凋亡率明显高SMMC7721细胞提示槐果碱抑制肝癌生长时着避免肝细胞损伤等毒副作研究细胞试验初步证实槐果碱抗肿瘤作选择性较差肝癌正常肝细胞杀伤作基没差异
25参考文献
[1]Siegel RL Miller KD Jemal A Cancer statistics 2015[J] CA Cancer J Clin 201565(1)5–29
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[4]赵秀梅张娜张桂贤等 苦参碱美法仑复合物MATMEL合成体外抗肿瘤活性研究[J] 华西药学杂志201631(4)339341
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[13]郑彩霞金情政 中药川芎嗪联合皮肝穿瘤注射碘油吡柔星联合肝动脉化疗中晚期肝癌疗效安全性观察[J] 中国生化药物杂志201737(6)8486
综 述
王庆华 王炳芳 校审
干细胞生物材料生长子治疗肝细胞癌研究进展
[摘]肝细胞癌（HCC）全球第五常见恶性肿瘤缺乏效治疗方法 迫切需种怕疾病确定新治疗方法转化生长子β（TGFb）微环境肿瘤细胞生长起着重作通两机制：作活性分泌生长子作通诱导微环境变化外活性干细胞疗法成治疗肝癌潜治疗方法信号传导通路GF GFR系统SDF1α CXC4配体受体相互作PI3K Akt信号传导积极影响细胞治疗结果干细胞基础治疗结合信号通路成代坏死肝细胞效选择目前已探索通生物材料靶药物递送系统（TDDS）癌症治疗剂特肝脏提高肝脏中药物浓度减少剂量副作效果综述旨全面总结肝癌治疗方法：干细胞生长子生物材料
[关键词] 肝细胞癌 干细胞 生长子
Stem Cells Biomaterials and Growth Factors in the Treatment of Hepatocellular Carcinoma
[Abstract]Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignancy in the world but lacks effective treatments Therefore there is an urgent need to establish new treatments for this terrible disease Transforming growth factorbeta (TGFb) plays an important role in the growth of tumor cells in the microenvironment He mainly passes two main mechanisms as an intrinsically active autocrine growth factor and as a change through the induction of the microenvironment External activity Recently stem cell therapy has also become a potential treatment for liver cancer and signaling pathways such as the GFGFR system SDF1αCXC4 ligand receptor interactions and PI3KAkt signaling can all be used to positively influence cell therapy result Therefore stem cellbased therapy combined with signaling pathways can be an effective alternative in the replacement of necrotic hepatocytes The use of biological material targeted drug delivery systems (TDDS) for cancer therapeutics has been explored Especially the liver because it can increase the drug concentration in the liver and reduce the dose and side effects The purpose of this review is to provide a comprehensive summary of available treatments for liver cancer stem cells growth factors and biological materials
1背景
肝癌世界第五常见癌症癌症死亡率第三常见原[1]肝干细胞研究改善肝病患者预[2]肝干细胞研究进展产生新细胞疗法通提供肝病模型促进新药物开发[3]许组织中干细胞尚未特异性识分离目前促进组织特异性干细胞增殖分化机制理解限妨碍产生效治疗代细胞干细胞[45]慢性肝损伤程中出现肿瘤起始干细胞（TISC）享信号通路表达包括围绕转化生长子ββ连环蛋白组织表面标记具正常LPC表面标记[6]TISCs肝细胞癌中作研究提供肝癌发生转录转录调控新法[7]针TISC靶化学疗法正开发中作克服细胞耐药种手段
2肿瘤基质相互作：种新肝病治疗靶点
开发效治疗肝细胞癌挑战潜肝硬化关肝硬化仅肝功降低关肿瘤细胞生长提供支持种独特微环境新药仅应该治疗肿瘤细胞应该预防新肿瘤病变理想药物应具低毒性抗肿瘤活性化学预防活性种药物治疗方案中具活性辅助治疗中消融治疗起例激酶抑制剂具限制期治疗毒性特征严重良事件舒尼尼已停药抗血生成激酶抑制剂凝血功受损患者中出血风险高动脉化疗栓塞联合索拉非尼外理想药物候选物抗肿瘤活性必须显示出立抗肿瘤作索拉非尼阻断种信号通路仅具抗血生成作诱导肿瘤细胞凋亡通抑制受体游信号通路靶肿瘤 基质相互作药物已证明效治愈控制肝脏疾病[89]索拉非尼种口服激酶抑制剂种旨抑制血皮生长子受体（VEGFR2 3）血板衍生生长子受体（PDGFR）Raf激酶中断肿瘤基质相互作导致细胞增殖血生成减少索拉非尼疗效安全性已床试验中证实目前视晚期HCC患者治疗标准[10]理想候选药物需阻断肝硬化相关程通靶种微环境信号抑制肿瘤细胞生长刺激防止新肿瘤损伤先前研究药剂抑制TGFβ信号传导影响肝细胞癌发育进展阶段提供更广泛治疗应整肝细胞癌发展程中存TGFβ信号然微环境调节剂具化学治疗观察立抗肿瘤作相反分子细胞肿瘤生物学影响需更长治疗时间宿组织恢复成更具生理学表型
21转化生长子b（TGFβ）作肝病治疗靶点
TGFb信号通路变化认肿瘤生长促成素[11] TGFb信号通典非典途径发生[12]三种配体TGFb受体II（TGFbRII）结合时TGFb受体I（TGFbRIALK5）异源二聚化该激酶转磷酸化时负责激活典型TGFb信号传导途径两种受体结构域（TGFb1TGFb2TGFb3）[13]该磷酸化阶段导致SMAD2SMAD3活化磷酸化激活SMAD信号传导级联终导致核易位广泛肿瘤促进介质基转录[14]然非典激活途径尚未探究清楚许细胞蛋白质磷酸化关jun N端激酶（JNK）p38 MAPKERKMEKK表明TGFb信号传导具种激活肿瘤细胞机制研究表明鼠模型中体组织中存两种TGFβ信号传导反应种称早期种称晚期TGFβ信号响应早期反应模式较长反应模式相关较短反应模式较短生存时间相关早期反应模式反映生理性炎症反应晚期反应模式长期TGFβ激活相关 TGFβ作肝细胞癌分子分类中认识中Wnt信号传导途径受TGFβ调节肝细胞癌肿瘤亚组中TGFβ信号传导似控制肿瘤细胞生长第二亚组中更肿瘤低甲胎蛋白（AFP）表达良预相关样亚组鉴定代表第次尝试鉴TGFβ信号传导抑制作出反应肝细胞癌患者基转录组研究间差异正数进行回顾获分类更理解驱动肝细胞癌病理生理学途径回顾基转录组报道TGFβ信号传导AFPEpCAM表达相关伴表达基础早期肝细胞癌25％中存TGFβ信号传导TGFβ信号传导外效应嵌入ECM富集环境中肿瘤细胞生长结果种情况特征TGFβ分泌相关子影响癌症相关成纤维细胞CTGF激活成纤维细胞外TGFβ信号通路T调节细胞相关例通激活趋化子（CCL22）通AFP免疫呈递TGFβ信号传导肿瘤起始细胞关TGFβ诱导CD90CD133表达改变显示TGFβ持续刺激肝祖细胞导致转化肿瘤起始细胞TGFβ信号传导作高度侵袭性肿瘤条件观察 TGFβ信号细胞极性丧失细胞运动获肿瘤侵袭增加关通Ecadherin表达（EMT标志物）测量肿瘤细胞变化EMT关存TGFβ情况E钙粘蛋白肿瘤细胞脱落肿瘤细胞更具侵袭性迁移性组织微环境组分层粘连蛋白5（Ln5）CD44相关联TGFβ诱导转录子SnailEMT组分种诱导预良关总似TGFβ信号传导引起EMT肿瘤更具侵入性
22TGFb激活肝脏疾病
肝细胞癌发病进展仅取决肿瘤细胞受损肝细胞取决素更全面观点肿瘤细胞宿基质间相互作肿瘤生长中起关键作越越明显样背景TGFβ通衡炎性细胞成纤维细胞活性肿瘤细胞生长进展协调微环境组分肿瘤细胞稳态[16]TGFb通炎性细胞活性中达衡负责协调微环境组分肿瘤细胞稳态[16]病毒性肝炎中着T调节细胞增加伴TGFβIL10分泌增加导致局部免疫抑制效应导致持续病毒感染[17]证实述事实Thiery事报道肝脏持续炎症常观察逆性逆转重塑包括纤维化早期肝硬化[1819] 种重塑特点细胞外基质（ECM）蛋白积累[20] 富含ECM沉积TGFb活化引起果ECM沉积没停止导致肝硬化终导致肝衰竭肝脏肝硬化状态导致发育良结节突变加重肝细胞癌早期阶段[21] Gressner等报道肝组织中癌细胞生长补充ECM微环境中TGFb结缔组织生长子激活[2223]阶段旨阻断肝病进展治疗性干预尤重防止肝细胞癌发生幸种疗法尚着肝肝硬化程进展常常观察具初始染色体变化发育良结节发育良结节进展肝细胞癌早期阶段肝脏组织中癌细胞生长富含ECMTGFβ结缔组织生长子介导环境中种肿瘤周围肝硬化间紧密相互作肝细胞癌显着特征
23特异性TGFb抑制剂肝癌治疗
Dituri事报道LY2157299水合物种靶TGFbRI丝氨酸苏氨酸激酶分子抑制剂发展[24]目前LY2157299表现出抗肿瘤力已床患胶质母细胞瘤肝细胞癌患者中进行评估[25]然体外体抗肿瘤活性表现然清楚研究LY2157299体外体抗肿瘤活性然挑战LY2157299代化合物LY2109761已选择体外体模型更理解肝细胞癌中活性Fransvea等够说明TGFb信号迁移入侵中作结LY2157299患者药理学水没表现出凋亡作效阻止肝癌细胞侵袭迁移[26]报道E钙粘蛋白水增加导致增加E钙粘蛋白组织中表达清液中E钙粘蛋白分泌减少Mazzocca事报道LY2157299负责CTGF生产阻断[27]种阻断减少实验模型中肿瘤生长会肝硬化程产生积极影响[28]LY2157299抑制新生血生成减少肝细胞癌生长进展部分原根Mazzocca等篇报道LY2157299间接阻断血皮生长子（VEGF）产生生物活性贝伐单抗药物更强样LY2157299阻断癌细胞中b1整合素活化阻止肝细胞癌细胞渗入血[29]肝细胞癌患者中甲胎蛋白（AFP）水报道着TGFβ1水升高增加[30]中皮间质转化（EMT）关键驱动素简言患者中LY2157299降低患者血浆中TGFβ1E钙粘蛋白水 Fransvea事证实LY2157299抑制TGFb信号时降低E钙粘蛋白分泌结[31]
目前止没发现特定药物治疗血浆TGFβ1E钙粘蛋白水改变关肝细胞癌治疗中没观察生物标志物应答[32] LY2157299阻断TGFb信号应时恰巧调节EMT床已患者产生效果E钙粘蛋白TGFβ1剂量水开发治疗肝病新药潜手段
24生物材料治疗肝癌
阿霉素（DOX）负载甘草次酸（GA）修饰海藻酸盐（ALG）纳米粒子（DOX GAALG）纳米粒子已证明治疗肝癌中广泛化疗药物[32] 田等先前已证明部分GA修饰壳聚糖（CTS）纳米颗粒注射180分钟开始肝脏中累积载DOX纳米颗粒显著阻断肿瘤生长[33]Zhang等实验研究MTT法测定空白GAALG NPsDOXHClDOX GAALG纳米粒体外细胞毒性作[34] 报道空白GAALG纳米颗粒具细胞毒性GAALG纳米颗粒作潜药物载体采含H22肝肿瘤昆明鼠评价DOX GAALG NPsDOXHCl抗肿瘤活性
报道组肿瘤重量相DOX GAALG NPs处理鼠肿瘤重量显著降低表明DOX GAALG NPs释放DOX具药理学活性够导致肿瘤细胞中细胞死亡项实验研究中Keming等通HAK1B异种移植裸鼠模型证实干扰素（IFN）a 2a透明质酸 酪胺（HATyr）水凝胶体结合抗癌作[35]实验证实含IFNα2aHATyr水凝胶治疗表现肿瘤消退没显著影响表明单独水凝胶具抗肿瘤效力[36]IFNα2a溶液治疗阻止肿瘤生长20天IFNα2a溶液组中记录均肿瘤PBS组没[37] 然掺入IFNα2aHATyr水凝胶治疗组显示出肿瘤明显减少[38]
外PBS组相HATyrsoftIFN处理组中鼠显示均肿瘤明显降低表明HATyr效递送负载IFNα2a者效抑制 肿瘤生长[39] Keming等报道说IFNα2a负载HATyr水凝胶研究中效调抗肿瘤趋势外观察HATyr水凝胶引起副作 报道HATyrsoftIFN处理鼠中肿瘤细胞细胞核密度组低证实HATyrsoftIFN具高抗肿瘤功效[40]
Ki67发现种细胞增殖相关核蛋白[41]相证明水凝胶处理鼠肿瘤切片中阳性细胞减少Keming研究中通细胞表面糖蛋白（CD34）染色检测IFNa 2a掺入水凝胶处理鼠肿瘤切片血生成该细胞表面糖蛋白（CD34）癌症血生成标志物[42]记录CD34阳性染色线性半圆形圆形图案表明形成新血然IFNα2a掺入水凝胶组中记录少CD34染色表明掺入IFN水凝胶处理鼠中血生成速率降低[39]
25干细胞通路治疗肝癌
LCSCs源目前尚清楚目前存两种假说：⑴起源正常干细胞肝脏干细胞基突变形成LCSCs⑵部分成熟肝细胞产生突变分化重新获更新力分化潜演变成LCSCsLCSCs具更新力推断样具更新力正常肝脏干细胞越越研究证支持观点卵原细胞目前较公认肝脏干细胞OV6卵原细胞标志物Yang等[43]肝癌细胞系肝癌组织中均发现群低分化OV6 + 细胞OV6 细胞更强成瘤力耐药性高表达肝脏干细胞种标志物ABCG2EpCAMckitAFP等表明具癌干细胞特性OV6 + 细胞源肝脏干细胞Yamashita等[44]研究表明EpCAM + AFP + 肝癌细胞具LCSCs特性肿瘤起始细胞EpCAMAFP分肝脏干细胞胚胎肝母细胞分子标志外已分离Huh7肝癌细胞系侧群细胞中发现736认肝脏干细胞分子标志CD29表达调[45] 目前数研究者认LCSCs正常肝脏干细胞基突变然学者认LCSCs产生已分化子代细胞次激活干细胞程序分化结果Bralet等[46]逆转录病毒介导方法鼠成熟肝细胞β半乳糖苷酶基进行标记发现肝切术生肝细胞致癌剂二乙基亚硝氨(DEN)刺激产生肝癌细胞中成熟肝细胞细胞例接分占183177表明成熟肝细胞损伤修复时产生肝细胞致癌素作产生肝癌提示已分化成熟肝细胞特定环境刺激分化演变成LCSCs肝癌干细胞（CSC）需量信号维持更新力性标记表型 诸EpCAMWnt β连环蛋白途径Sonic Hedgehog途径Notch途径信号干细胞调节保存肿瘤形成中发挥重作[47]然肝脏CSC初始形成信号通路出现受控制激活项正受广泛关注策略针控制未分化潜细胞中更新细胞命运决策CSC信号通路中部分具重发展作错综复杂交互作[48] 中WntNotchHedgehog通路治疗发展焦点 信号通路维持增强CSCs正常干细胞更新力方面起着重作 然正常干细胞CSCs间信号赖性CSCs治疗靶提供机会正常干细胞影响较
26分子信号治疗目标
数肝细胞癌（HCC）病例中证显示存慢性肝病种易感素包括慢性病毒性乙型肝炎丙型肝炎酒精性肝病代谢性肝病非酒精性脂肪性肝炎原发性胆汁性肝硬化原发性硬化性胆炎包括纤维化肝硬化病理性肝病发生[49]肝细胞损伤释放炎性细胞子氧化应激反应星状细胞门静脉成纤维细胞发生活化肌成纤维细胞转化导致纤维化发展终导致肝硬化处持续炎症氧化应激状态存够直接间接遗传毒性损伤煽动剂肝细胞增殖生损伤肝脏HCC成功靶治疗发展取决肿瘤细胞肿瘤生长程中增殖侵袭转移信号通路确定 HCC中发现重表观遗传学改变包括p16E钙粘蛋白超甲基化染色体臂处发现影响肿瘤抑制基染色体丢失缺失增加外染色体17p（TP53）13q（RB1）16p（AXIN1）9p（CDKN2A）16q（IGF2R）已鉴定出杂合性丢失HCC发生遗传机制包括p53CTNNB1PTEN等基突变[50]已发现种信号传导途径包括肝细胞生长子 MET表皮生长子受体 Ras 丝裂原活化蛋白激酶Wnt β连环蛋白PIK3CA Akt胰岛素样生长子信号级联NotchHedgehog（Hh）[51]数信号通路具独立作排相互作串扰重叠成功彻底根恶性肿瘤需开发抑制快速生长分化肿瘤细胞抗癌疗法然忽略CSC治疗耐药[52]治疗组合信号通路提供潜治疗方法终抑制协调癌性肿瘤生存生长信号[53]
27Notch作肝癌治疗靶点
Notch信号通路干细胞更新分化中发挥重作该信号传导途径中表达膜结合配体细胞表达跨膜受体细胞间接触表达受体细胞发出细胞命运调节信号通信系统该信号呈现级联转录调控事件形式影响数百种具文赖性表型结果基表达哺乳动物膜结合Notch配体两结构家族组成：Delta样配体（DLL）134四种跨膜Notch受体（Notch 14）相互作Jagged配体12 Notch受体细胞间接触程中配体结合激活导致构象变化先前受保护位点分金属蛋白酶γ分泌酶蛋白水解切割分释放细胞外细胞片段释放活跃Notch细胞结构域（NICD）细胞质中NICD易位细胞核里作Notch相关靶基转录激活子包括HESMycp21 Notch信号证明维持CSCs更新防止种实体癌神胶质瘤乳腺癌结肠癌中分化中发挥重作[52]活化细胞形式Notch3Notch配体JaggedHCC中高度表达[53]类HCC中报道Notch受体表达失调[54]迄止没报道直接显示Notch信号肝癌CSCs中作然鉴正常干细胞实体癌中作Notch途径HCC中发挥重作
Notch信号通路高度保守信号通路细胞间通讯中起着关键作胚胎发育整成年期调节细胞分化程肝脏中Notch协调胆命运形态发生已显示Notch信号许类型类癌症中发挥重作包括T细胞白血病淋巴瘤结直肠癌胰腺癌卵巢癌肺癌宫颈癌乳腺癌类型癌症[55] Notch癌症发展中参复杂Notch作癌基抑癌基取决组织信号通路存 Notch信号通四种受体（Notch1234）激活Delta Jagged家族五配体冗余方式相互作两项研究表明Notch1表达通促进细胞周期停滞细胞凋亡抑制HCC细胞生长相反证表明Notch激活肝癌发生中致癌作Giovannini等工作中通免疫组织化学60HCC中检测Notch1Notch3显着表达初类T细胞白血病中鉴定Notch信号直接抑制NotchT细胞急性淋巴细胞白血病具抗增殖作Wang等显示常观察Notch1 Jagged1低表达水Notch1 Jagged1信号调维持HCC中肿瘤进展 Notch1调显示通阻止细胞周期诱导凋亡延缓肝癌发生外高Notch3低Notch4表达水HCC关已报道Notch1通调节PTEN肿瘤抑制子参Ras Raf MEK ERK等信号通路交叉话Notch1信号传导激活增加死亡受体5表达水体外体增强肿瘤坏死子相关凋亡诱导配体诱导细胞凋亡证明Notch发育程中许细胞类型中Wnt β连环蛋白信号发生串扰NotchWnt信号相互作首先果蝇翅膀成盘中发现中NotchWnt1表达NotchWnt βcatenin信号传导间相互作协拮抗方式发生取决文Notchβ连环蛋白发生物理相互作通负调控果蝇中β连环蛋白活性调控Wnt信号传导种作表现出未切割NotchWnt信号拮抗作涉Notch配体CSL外Notch通降低β连环蛋白转录活性形式水作膜转录子作膜结合调节剂起作种形式βcateninSer37Thr41磷酸化通常构成总β连环蛋白部分哺乳动物干细胞祖细胞中Notch水活性β连环蛋白呈负相关 RAM结构域NotchCSL结合结构域活性β连环蛋白物理相互作调节必需活性β连环蛋白膜Notch调节独立GSK3β发生遗传分析显示膜Notch够调GSK3β功丧失导致β连环蛋白活性增加方面项研究表明axinAPC通调节膜Notch吞运输参种调节
28EpCAM作肝癌治疗靶点
潜EpCAM通路已证实靶标包括肝癌细胞数癌细胞中量表达解剖健康组织EpCAM位基底外侧膜CD9CD44紧密连接蛋白7形成复合物EpCAM结合抗体癌细胞中获性健康细胞低肝癌细胞中EpCAM强烈度表达EpCAMRNA干扰靶显著降低CSC库终降低肿瘤生长CSC侵袭力肝脏病理改变伴着EpCAM强表达例肝癌细胞中EpCAM作癌症干细胞标记物EpCAM + α胎蛋白肿瘤细胞表现出肝癌干细胞特征包括更新分化力够NOD SCID鼠中启动高度侵袭性肝细胞癌力量肝脏坏死时生反应涉类EpCAM阳性HSPC扩增细胞类型中没观察额外EpCAM阳性相反胆汁性肝硬化生涉具EpCAM膜性表达成肝细胞伴着HSPC扩增肝脏损伤期间（慢性丙型肝炎乙型肝炎）EpCAM标记肝细胞新鲜干细胞源肝细胞缺乏源肝细胞肝细胞提示EpCAM祖细胞关联事实EpCAM阳性肝细胞位反应附具EpCAM阴性肝细胞更长端粒长度表明起源慢循环HSPC综述鼠组织获数表明肝细胞分化伴着EpCAM阳性转变EpCAM阴性状态细胞部分重述胚胎肝发生基阶段EpCAM表达Wnt b catenin游靶点结果新靶点治疗发展产生影响[54]
29Wnt b catenin作肝癌治疗靶点
Yamashita等报道Wnt bcatenin信号通路干细胞更新保存必需[55]项实验研究表明抑制Wnt bcatenin信号通路增殖减少调细胞凋亡[56] 根Li事说法Wnt β连环蛋白信号通路通Dickkopf1（Dkk1）低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）结合抑制卷曲蛋白WntLRP6复合物形成抑制黄事开发报道新方法抑制称XAV939分子形式Wnt信号传导抑制导致轴蛋白（种支架蛋白）湮灭酶端链霉素酶Wnt β连环蛋白破坏复合物重组成成分[58]Wnt信号通路调节干细胞祖细胞扩增方面起着关重作 Wnt蛋白19高度保守糖蛋白组成作卷曲蛋白（Fz）跨膜受体配体激活Wnt受体受体低密度脂蛋白受体相关（GSK3β）β连环蛋白腺瘤性结肠息肉蛋白（APC）轴蛋白复合物解离β连环蛋白磷酸化减少β连环蛋白磷酸化连环蛋白稳定化进入细胞核里T细胞子（TCF）家族转录子活化 Wnt信号通路胚胎发育成体组织更新中发挥重作类HCC中报道异常Wnt信号1867％HCC肿瘤中已观察该信号传导途径激活核细胞β连环蛋白积聚然仅2030％HCC中检测β连环蛋白突变负性调节子axin1axin2功丧失突变HCC中非常罕见观察结果表明游元件肝癌发生程中激活Wnt β连环蛋白中起着重作次Wnt信号维护中作CSCs致瘤性已皮肤癌中证实突变β连环蛋白转导鼠肝干祖细胞获度更新力致瘤性Wnt β连环蛋白信号传导啮齿动物卵圆细胞OV6 +致瘤HCC细胞Oct4通调控Wnt β连环蛋白途径促进HCC癌细胞干细胞功HCC中EpCAM + CSCs调β连环蛋白EpCAM细胞β连环蛋白阴性表明CSC更新分化力受Wnt β连环蛋白信号调节发现表明Wnt β连环蛋白信号传导涉肝癌中CSCs维持
210Sonic hedgehog通路作肝癌治疗靶点
hedgehog通路肝癌细胞抑制效潜目标Hedgehog（Hh）信号通路控制胚胎发育程中干细胞维持种途径异常激活突变放松制已种样癌症中认 Hh通专门跨膜转运蛋白细胞中释放出位质网Hh N末端分配 Hh跨膜受体Patched 1（Ptch1）结合激活Smoothened（Smo）神胶质瘤相关癌基12（Gli1 2）Smo蛋白复合物释放转位细胞核导致Hh相关基转录激活果蝇类系物发现突变Ptch1基种罕见遗传性基底细胞癌中提供该通路参癌症第线索已证明Hh信号维持血液系统恶性肿瘤实体癌胃癌结肠癌乳腺癌胰腺癌关重Hh通路成分（ShhPtch1Gli1Gli2）表达已类HCC样中证实表达组织学分化门静脉侵袭密切相关项研究显示低分化HCC细胞系中皮间质转化Hh活性高分化良HCC细胞系增强Hh信号活动化学抗性侵袭原Stanton等已成功证实许音猬子分子调节剂控制髓母细胞瘤基底细胞癌活性[59]然Wang事报道通干扰RNA抑制肝细胞中Hedgehog通路导致肝癌细胞增殖减少增敏细胞5氟尿嘧啶（5FU）（种促凋亡剂）[ 60]外肝母细胞瘤中拮抗剂环巴胺阻断Hh信号HB细胞系细胞增殖具强烈抑制作[61]现数表明Hh信号通路HCC中重治疗靶点总体言CSC更新相关细胞途径靶久建立起
3肝癌干细胞诊断预潜力
肝癌干细胞（CSC）标记助HCC早期诊断Yamashita等报道胎肝细胞中表达甲胎蛋白（AFP）EpCAM起描述具干细胞特征癌细胞[62]Yang事证实HCC患者血液样中CD45 CD90 +提出检测血液中CD45 CD90 +细胞发现新HCC诊断技术非常重Yang等项研究中HCC患者收集34份血液样中31份鉴定出CD45CD90 +细胞正常19名受试者19名肝硬化患者中均未鉴定出CD45CD90 +细胞[63]结中指出HCC血液样中CD45 CD90 +群体存提示CSC全身血液循环中存证Maheswaran等份报告中FDA批准基磁性铁磁流体原理循环肿瘤细胞富集中EpCAM开发细胞检索系统设想肺部癌症预[64]结种方法连血清AFP检测亚组HCC患者预测结果根CSC理CSCs促进转移复发率影响患者预报道CSC群规模越预越差已篇关CSC作肝癌预工具报道Sasaki等CD133表达增加HCC患者存活肿瘤复发独立预子[65]
然HCC中度表达CD90预良关[66]外CD44CD24HCC中表达肝外转移频率较高生存期缩短[66]侵袭性肿瘤行增加床结局良相关[6667]Yamashita等报告中指出肝CSC标志物组合预测HCC预非常重够鉴定具干细胞特征EpCAM + AFP + HCCEpCAMAFPHCC相具良预结已独立队列中证实[68]杨等CD133CD44巢蛋白微血密度构建简化预测模型出结标记物高表达HCC患者分类术肿瘤复发高风险[69]
4讨
LY2157299抑制TGFb信号传导床应控制皮间质转化患者提供床疗效然更床研究应该量化E钙粘蛋白TGFβ1水进行研究会改变正进行床新药开发生物材料提供种潜效代方法通集成蛋白质治疗剂注射水凝胶系统提高装载蛋白质药物肝癌治疗中抗癌功效外DOX GAALG NPs增加DOX原位肝肿瘤抗肿瘤活性抑制EpCAMSonic Hedgehog等特定通路治疗帮助抑制肝脏中肿瘤生长然更床研究然需解阐明途径便开发精确药物阻断活动
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