食品中罗丹明B测定
BJS 201905
1 范围
方法规定食品中罗丹明B液相色谱测定方法液相色谱质谱质谱确证方法
方法适半固态调味料花椒花椒粉花椒油牛肉干蜜饯水果干制品中罗丹明B测定确证
2 原理
试样中罗丹明B含酸甲醇水溶液提取混合型阳离子固相萃取柱净化采液相色谱荧光检测器检测外标法定量试样中检出罗丹明B采液相色谱质谱质谱法进行确证
3 试剂材料
规定外方法试剂均分析纯水 GBT 6682 规定级水
31 甲醇（CH3OH）：色谱纯
32 乙腈（C2H3N）：色谱纯
33 甲酸（CH2O2）：色谱纯
34 氨水（NH₃·H₂O）：色谱纯
35 含01甲酸水溶液 取甲酸（33）1 mL水稀释1000 mL 滤膜（022 μm水相）滤备
36 50甲醇水溶液准确量取500 mL甲醇（31）1 L容量瓶中水定容刻度
37 含01甲酸甲醇水溶液：取1 mL甲酸（33）甲醇水溶液（36）稀释1000 mL
38 含01甲酸乙腈溶液：取1 mL甲酸（33）乙腈（32）稀释1000 mL滤膜（022 μm机相）滤备
39 含01甲酸乙腈水溶液：取01 mL甲酸（33）35 mL乙腈（32）水稀释100 mL混匀
310 含5氨水甲醇溶液：取5 mL氨水（34）甲醇稀释100mL混匀（现配）
311 罗丹明B标准品：
罗丹明B标准品分子式相分子量英文名称CAS登录号见表1纯度≥99
表1 罗丹明B标准品中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相分子量
罗丹明B
Rhodamine B
81889
C28H31ClN2O3
47901
312 罗丹明B标准储备液：准确称取罗丹明B标准品10 mg（精确00001 g）置100 mL容量瓶中甲醇溶解定容刻度摇匀制成浓度100 μgmL标准储备液溶液转移试剂瓶中置18℃避光保存效期6月
313 中间标准溶液：准确移取05 mL罗丹明B标准储备液（312）100 mL容量瓶中甲醇定容刻度混匀溶液浓度500 ngmL置4℃避光保存效期1月
314 标准工作溶液：含01甲酸乙腈水溶液（39）中间标准溶液（313）稀释成00 ngmL05 ngmL10 ngmL20 ngmL50 ngmL100 ngmL200 ngmL500 ngmL标准工作溶液现配
315 混合型阳离子固相萃取柱（60 mg3mL）：基质苯磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯高聚物相者前次3 mL甲醇3 mL水活化
316 陶瓷均质子
4 仪器设备
41 液相色谱仪：配荧光检测器
42 液相色谱质谱质谱仪：配电喷雾离子源（ESI源）
43 旋涡混合器
44 离心机：转速≥8000 rmin
45 电子天：感量分00001 g001 g
46 具塞离心：50 mL
47 组织捣碎机
48 固相萃取装置
5 试样制备保存
51 半固态调味料
取适量样品捣碎混匀常温保存备
52 花椒花椒粉
取适量样品粉碎40目筛常温保存备
53 花椒油
充分混匀常温保存备
54 牛肉干
取适量样品捣碎混合均匀冷藏保存备
55 蜜饯水果干制品
取适量样品捣碎混合均匀冷藏保存备
6 测定步骤
61 试样前处理
611 提取：准确称取2 g（香辛料样品称取1 g精确001 g）试样置50 mL塑料离心中准确加入100 mL含01甲酸甲醇水溶液（37）混匀加入陶瓷均质子两颗（调味油试样外）旋涡混匀器涡旋15 min8000 rmin离心10 min取3 mL提取液层溶液045 μm机相滤膜净化
612 净化：准确移取10 mL提取液（611）固相萃取柱（315）中次3 mL 01甲酸水溶液（35）3 mL水3 mL甲醇淋洗固相萃取柱6 mL氨水甲醇溶液（310）洗脱目标物收集洗脱液洗脱溶液45℃氮气吹干残渣10 mL 01含酸乙腈水溶液（39）溶解（香辛料样液残渣05 mL溶解）022 μm机相滤膜机测定
62 仪器参考条件
a) 色谱柱：C18柱46 mm×100mm粒径35 µm性相者
b) 流动相：A01甲酸水溶液（35）B乙腈（32）梯度洗脱程序见表2
c) 流速：10 mLmin
d) 柱温：35℃
e) 进样量：10 μL
f）激发波长：550 nm发射波长：580 nm
表2 梯度洗脱程序
时间(min)
流动相A（）
流动相B（）
Initial
65
35
01
65
35
60
30
70
65
30
70
80
65
35
100
65
35
63 空白试验
加试样外均试样法操作
7 结果计算
试样中罗丹明B含量式（1）计算获：
XC×Vm×1000×f…………（1）
式中：
X — 试样中罗丹明B含量单位毫克千克（mgkg）
c — 试样中罗丹明B峰面积应浓度单位纳克毫升（ngmL）
V — 试样定容体积单位毫升（mL）
m — 称样量单位克（g）
ƒ — 稀释子
计算结果重复性条件获两次独立测定结果算术均值表示结果保留三位效数字
8 精密度
重复性条件获两次独立测定结果绝差值超算术均值10
9
称样量2 g （香辛料样品称取1 g） 时方法中罗丹明B检出限00025 mgkg定量限0005 mgkg液相色谱质谱确证法检出限00025 mgkg定量限0005 mgkg
10 确证实验
试样中检出罗丹明B时附录B方法进行确证
附录A
罗丹明B液相色谱图
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
min
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
mV
Ex550nmEm580nm
图A1罗丹明B标准溶液色谱图（浓度：5 ngmL）
附录B
罗丹明B确证实验
B1 液相色谱质谱质谱参考条件
a) 色谱柱：C18柱100×30 mm粒径17 µm性相者
b) 流动相：A含01甲酸水溶液（38）B含01甲酸乙腈溶液（39）梯度洗脱程序见表B1
c) 流速：04 mLmin
d) 柱温：40℃
e) 进样量：1 μL
h) 质谱参考条件参见B2
表B1 梯度洗脱条件
时间（min）
流动相A（）
流动相B（）
000
80
20
15
80
20
25
5
95
35
5
95
45
80
20
55
80
20
B2 质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI源）
b) 检测方式：反应监测（MRM）
c) 扫描方式：采正离子模式扫描
d) 电喷雾电压：5500 V
e) 离子源温度：550℃
f) 雾化气压力：600 psi
g) 辅助气压力：500 psi
h) 气帘气压力：250 psi
i) 定性离子定量离子簇电压碰撞量见表B2
表B2罗丹明B质谱参数
分析物
离子 mz
簇电压 V
碰撞量 eV
罗丹明B
44323993*
20
59
44323551
20
81
*代表定量离子
注：附录B列参考质谱条件仅供参考采质谱仪器时仪器参数存差异测定前应质谱参数优化佳
B3定性判定
B1B2条件测定试样标准溶液果试样中质量色谱峰保留时间标准溶液致（变化范围±25）试样中目标化合物两子离子相丰度浓度标准溶液相丰度浓度致相丰度偏差超表B3规定范围判定试样中含罗丹明B
表B3 定性确证时相离子丰度允许偏差
相离子丰度（）
>50
>20~50
>10~20
≤10
允许相偏差（）
±20
±25
±30
±50
罗丹明B反应监测（MRM）离子色谱图见图B1
图B1 罗丹明B标准溶液反应监测离子色谱图
方法负责起草单位：成市食品药品检验研究院
验证单位： 北京市疾病预防控制中心山东省食品药品检验研究院辽宁省食品检验检测院山西省食品药品检验四川省食品药品检验检测院
起草：郭靓李绍波叶梅肖全伟乔秀明林红
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BJS 201905
1 范围
方法规定食品中罗丹明B液相色谱测定方法液相色谱质谱质谱确证方法
方法适半固态调味料花椒花椒粉花椒油牛肉干蜜饯水果干制品中罗丹明B测定确证
2 原理
试样中罗丹明B含酸甲醇水溶液提取混合型阳离子固相萃取柱净化采液相色谱荧光检测器检测外标法定量试样中检出罗丹明B采液相色谱质谱质谱法进行确证
3 试剂材料
规定外方法试剂均分析纯水 GBT 6682 规定级水
31 甲醇（CH3OH）：色谱纯
32 乙腈（C2H3N）：色谱纯
33 甲酸（CH2O2）：色谱纯
34 氨水（NH₃·H₂O）：色谱纯
35 含01甲酸水溶液 取甲酸（33）1 mL水稀释1000 mL 滤膜（022 μm水相）滤备
36 50甲醇水溶液准确量取500 mL甲醇（31）1 L容量瓶中水定容刻度
37 含01甲酸甲醇水溶液：取1 mL甲酸（33）甲醇水溶液（36）稀释1000 mL
38 含01甲酸乙腈溶液：取1 mL甲酸（33）乙腈（32）稀释1000 mL滤膜（022 μm机相）滤备
39 含01甲酸乙腈水溶液：取01 mL甲酸（33）35 mL乙腈（32）水稀释100 mL混匀
310 含5氨水甲醇溶液：取5 mL氨水（34）甲醇稀释100mL混匀（现配）
311 罗丹明B标准品：
罗丹明B标准品分子式相分子量英文名称CAS登录号见表1纯度≥99
表1 罗丹明B标准品中文名称英文名称CAS登录号分子式相分子量
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相分子量
罗丹明B
Rhodamine B
81889
C28H31ClN2O3
47901
312 罗丹明B标准储备液：准确称取罗丹明B标准品10 mg（精确00001 g）置100 mL容量瓶中甲醇溶解定容刻度摇匀制成浓度100 μgmL标准储备液溶液转移试剂瓶中置18℃避光保存效期6月
313 中间标准溶液：准确移取05 mL罗丹明B标准储备液（312）100 mL容量瓶中甲醇定容刻度混匀溶液浓度500 ngmL置4℃避光保存效期1月
314 标准工作溶液：含01甲酸乙腈水溶液（39）中间标准溶液（313）稀释成00 ngmL05 ngmL10 ngmL20 ngmL50 ngmL100 ngmL200 ngmL500 ngmL标准工作溶液现配
315 混合型阳离子固相萃取柱（60 mg3mL）：基质苯磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯高聚物相者前次3 mL甲醇3 mL水活化
316 陶瓷均质子
4 仪器设备
41 液相色谱仪：配荧光检测器
42 液相色谱质谱质谱仪：配电喷雾离子源（ESI源）
43 旋涡混合器
44 离心机：转速≥8000 rmin
45 电子天：感量分00001 g001 g
46 具塞离心：50 mL
47 组织捣碎机
48 固相萃取装置
5 试样制备保存
51 半固态调味料
取适量样品捣碎混匀常温保存备
52 花椒花椒粉
取适量样品粉碎40目筛常温保存备
53 花椒油
充分混匀常温保存备
54 牛肉干
取适量样品捣碎混合均匀冷藏保存备
55 蜜饯水果干制品
取适量样品捣碎混合均匀冷藏保存备
6 测定步骤
61 试样前处理
611 提取：准确称取2 g（香辛料样品称取1 g精确001 g）试样置50 mL塑料离心中准确加入100 mL含01甲酸甲醇水溶液（37）混匀加入陶瓷均质子两颗（调味油试样外）旋涡混匀器涡旋15 min8000 rmin离心10 min取3 mL提取液层溶液045 μm机相滤膜净化
612 净化：准确移取10 mL提取液（611）固相萃取柱（315）中次3 mL 01甲酸水溶液（35）3 mL水3 mL甲醇淋洗固相萃取柱6 mL氨水甲醇溶液（310）洗脱目标物收集洗脱液洗脱溶液45℃氮气吹干残渣10 mL 01含酸乙腈水溶液（39）溶解（香辛料样液残渣05 mL溶解）022 μm机相滤膜机测定
62 仪器参考条件
a) 色谱柱：C18柱46 mm×100mm粒径35 µm性相者
b) 流动相：A01甲酸水溶液（35）B乙腈（32）梯度洗脱程序见表2
c) 流速：10 mLmin
d) 柱温：35℃
e) 进样量：10 μL
f）激发波长：550 nm发射波长：580 nm
表2 梯度洗脱程序
时间(min)
流动相A（）
流动相B（）
Initial
65
35
01
65
35
60
30
70
65
30
70
80
65
35
100
65
35
63 空白试验
加试样外均试样法操作
7 结果计算
试样中罗丹明B含量式（1）计算获：
XC×Vm×1000×f…………（1）
式中：
X — 试样中罗丹明B含量单位毫克千克（mgkg）
c — 试样中罗丹明B峰面积应浓度单位纳克毫升（ngmL）
V — 试样定容体积单位毫升（mL）
m — 称样量单位克（g）
ƒ — 稀释子
计算结果重复性条件获两次独立测定结果算术均值表示结果保留三位效数字
8 精密度
重复性条件获两次独立测定结果绝差值超算术均值10
9
称样量2 g （香辛料样品称取1 g） 时方法中罗丹明B检出限00025 mgkg定量限0005 mgkg液相色谱质谱确证法检出限00025 mgkg定量限0005 mgkg
10 确证实验
试样中检出罗丹明B时附录B方法进行确证
附录A
罗丹明B液相色谱图
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
min
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
mV
Ex550nmEm580nm
图A1罗丹明B标准溶液色谱图（浓度：5 ngmL）
附录B
罗丹明B确证实验
B1 液相色谱质谱质谱参考条件
a) 色谱柱：C18柱100×30 mm粒径17 µm性相者
b) 流动相：A含01甲酸水溶液（38）B含01甲酸乙腈溶液（39）梯度洗脱程序见表B1
c) 流速：04 mLmin
d) 柱温：40℃
e) 进样量：1 μL
h) 质谱参考条件参见B2
表B1 梯度洗脱条件
时间（min）
流动相A（）
流动相B（）
000
80
20
15
80
20
25
5
95
35
5
95
45
80
20
55
80
20
B2 质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI源）
b) 检测方式：反应监测（MRM）
c) 扫描方式：采正离子模式扫描
d) 电喷雾电压：5500 V
e) 离子源温度：550℃
f) 雾化气压力：600 psi
g) 辅助气压力：500 psi
h) 气帘气压力：250 psi
i) 定性离子定量离子簇电压碰撞量见表B2
表B2罗丹明B质谱参数
分析物
离子 mz
簇电压 V
碰撞量 eV
罗丹明B
44323993*
20
59
44323551
20
81
*代表定量离子
注：附录B列参考质谱条件仅供参考采质谱仪器时仪器参数存差异测定前应质谱参数优化佳
B3定性判定
B1B2条件测定试样标准溶液果试样中质量色谱峰保留时间标准溶液致（变化范围±25）试样中目标化合物两子离子相丰度浓度标准溶液相丰度浓度致相丰度偏差超表B3规定范围判定试样中含罗丹明B
表B3 定性确证时相离子丰度允许偏差
相离子丰度（）
>50
>20~50
>10~20
≤10
允许相偏差（）
±20
±25
±30
±50
罗丹明B反应监测（MRM）离子色谱图见图B1
图B1 罗丹明B标准溶液反应监测离子色谱图
方法负责起草单位：成市食品药品检验研究院
验证单位： 北京市疾病预防控制中心山东省食品药品检验研究院辽宁省食品检验检测院山西省食品药品检验四川省食品药品检验检测院
起草：郭靓李绍波叶梅肖全伟乔秀明林红
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