论文:绣球花‘蓝尼康’快繁技术研究


     学位论文 论文题目:绣球花‘蓝尼康’快繁技术研究 学位级别: 硕士 学科专业:森林培育 研究方向: 论文编号: 论文提交日期:2017年4月 摘 要 绣球属(Hydrangea L.)是虎耳草科中的一个具有重要观赏价值的木本属,约有85个种,分布于亚洲东部至东南部、北美洲东南部至中美洲和南美洲西部。我国有46种 10个变种,除南部的海南,东北部的黑龙江、吉林,西北部的新疆等省区外,全国各地均有分布,主产于秦岭以南,尤以西南部至东南部分布的种类为最多。为了完善绣球花繁育技术体系,以国外引进优良品种绣球花‘蓝尼康’为试材,从扦插、组织培养和胚抢救三个方面对绣球花品种进行试验,并且对试验结果进行了分析讨论。 研究结果如下: 1.扦插试验结果表明,萘乙酸对绣球花‘蓝尼康’的生根长度,生根数目,甚至绣球花的成活率都有着很大的影响。适合‘蓝尼康’扦插的基质为珍珠岩:沙子=1:1,成活率为85%,平均生根数目为7.6条,生根长度为2.6 cm。在500 mg/L的3种植物生长调节剂下,最适宜绣球花扦插的植物生长调节剂为NAA,成活率为93%,平均生根数目为7.9根,平均生根长度为2.1 cm;最适宜绣球花扦插的NAA浓度为600 mg/L,成活率为93%,平均生根数目为8.3根,平均生根长度为2.3 cm。 2.绣球花‘蓝尼康’叶片最佳的消毒方法是:用自来水冲洗30-60 min后,然后在超净工作台上用75%乙醇消毒,无菌水冲洗外植体4到5次,用0.1%升汞灭菌14 min。再接着最后用无菌水冲洗5到7次,用滤纸吸干,接种到的初代培养基中进行培养。 3.在绣球花‘蓝尼康’的组织培养试验中,最佳的愈伤组织诱导的培养基配方为: MS+IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L,培养12 d有愈伤组织长出,诱导愈伤率达到89.16%;最佳的生根培养基为:MS+IBA1.0 mg/L,生根率为100%,平均生根时间为6.7 d,生根长度为2.0 cm;最适宜绣球花‘蓝尼康’腋芽诱导的培养基为:MS+6-BA 1.0 mg/L,不定芽的诱导率为为92.5%,每个外植体不定芽的平均数量为3.3个。 4.在胚抢救繁育技术中种子萌发培养基配方为:MS+NAA1.5 mg/L,11d后种子开始萌发,种子萌发率达到82.5%。 关键词:绣球花;扦插;组织培养;胚抢救ABSTRACT Hydrangea L. is a woody plant with an important ornamental value in the Saxifragaceae, with totall 85 kinds of varieties distributing in the east to southeast of Asia, southeast of North America to the central America and west of south America .While in our country ,there are 46kinds of varieties with 10 variations which is distributed all around China except the southern hainan, northeast of heilongjiang, jilin, northwestern of xinjiang and other provinces. It is mainly produced in the south of Qinling Mountains,especially from its southwest to the southeast with many kinds of varieties. The paper analyze on the results of experimental on three levels as cuttage and tissue culture and embryo rescue of ‘Hydrangea macrophyllaon’ using a good variety of ‘Hydrangea macrophyllaon’ which is imported abroad in order to perfect the propagation technique system of ‘Hydrangea macrophyllaon’. Results as below: 1. The experiment on cuttage shows :it is the NAA acid that has a big impact on the root length, root number, and even the survival rate of ‘Hydrangea macrophyllaon’. It is the pearlite that is fit for its cuttage matrix: with sand 1:1,survival rate as 85%, average root number is 7.6, and the root length is 2.6 cm. It is the NAA that is the best suitable to its cuttage among three kinds of plant growth regulator of 500mg/L, with survival rate 93%, the average root number 7.9, average root length 2.1 cm; while the NAA concentration is 600mg/L,survival rate is 93%, the average root number is 8.3, average root length is 2.3 cm. 2. The best method of disinfection for the leaves of ‘Hydrangea macrophyllaon’ is to use the water to swatch it for 30-60 min ,then put it into the 75% ethyl alcohol for sterilization, and flush the explant 4 to 5 times using sterile water . Then use mercury with the concentration of 0.1% to sterilize for 14min on the super clean bench.At last, flush its leaves 4 to 5 times using sterile water ,dry it by filter paper, and inoculate to the original medium for culture. 3. In the experiment on the tissue culture of ‘Hydrangea macrophyllaon’,the best culture medium component by callus induction is MS+IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L, there is a growing callus after 12d, with the callus induction rate up to 89.16%; The best rooting medium is MS+IBA1.0 mg/L, with rooting rate 100%, average root time 6.7d, root length 2.0cm;while the best optimum culture medium of axillary bud induction for it is MS+6-BA 1.0 mg/L, with the inductivity of adventitious bud 92.5%,and each of the average number of explant adventitious bud 3.3 pieces. 4. The seed germination medium on the embryo rescue breeding technology is MS+NAA1.5 mg/L, seeds begin to sprout after 11d ,with the germination rate up to 82.5%. Key words: Hydrangea; cuttage; tissue culture; embryo rescue 目 录 摘 要 I ABSTRACT II 1 绪论 1 1.1 绣球花的形态特征及生态习性 1 1.1.1 形态特征 1 1.1.2 生态习性 1 1.1.3绣球花的观赏特性和用途 1 1.2 国内外绣球花快繁技术研究现状 2 1.2.1国外研究 2 1.2.2国内研究 2 1.3 国内外组织培养技术研究 4 1.3.1国外研究 4 1.3.2 国内研究 6 1.4 研究目的及意义 8 1.4.1研究目的 8 1.4.2研究意义 8 2 绣球花品种‘蓝尼康’扦插繁育技术研究 10 2.1试验地概况 10 2.2 材料与方法 11 2.2.1 材料与处理 11 2.2.2试验方法 11 2.3 结果与分析 12 2.3.1扦插基质对‘蓝尼康’扦插的影响 12 2.3.2不同植物生长调节剂‘蓝尼康’扦插的影响 13 2.2.3 不同NAA浓度对‘蓝尼康’扦插的影响 14 2.4 讨论 15 2.4.1 基质的选择 15 2.4.2 植物生长调节剂的选择 15 2.4.3 不同NAA植物生长调节剂浓度对绣球花扦插的影响 16 3 绣球花品种‘蓝尼康’组培繁育技术研究 17 3.1 材料与方法 17 3.1.1 材料 17 3.1.2 试验方法 17 3.2 结果与分析 20 3.2.1 消毒方式对外植体的影响 20 3.2.2愈伤培养基的优化 21 3.2.3不同植物生长调节剂对绣球花生根的影响 25 3.2.4不同植物生长调节剂对绣球花腋芽诱导的影响 27 3.3.1外植体的消毒 28 3.3.2褐化现象 28 3.3.3玻璃化现象 29 3.3.4培养基的选择 29 3.3.5植物生长调节剂的选择 30 3.3.6培养基pH值 31 3.4 炼苗与移栽 32 4 绣球花品种‘蓝尼康’胚抢救繁育技术研究 34 4.1材料与方法 34 4.1.1材料处理 34 4.1.2试验方法 34 4.2结果与分析 34 4.2.1种子萌发试验 34 4.3问题与讨论 36 5 全文结论、创新点及研究展望 37 5.1全文结论 37 5.2创新点 37 5.3研究展望 37 参考文献 39 附录1: 44 附录2: 45 附录3:试验相关图片 46 1 绪论 绣球(Hydrangea macrophylla(Thunb.) Ser.)是绣球科所有的属中最大的一个属,全世界大约85个种,主要分布于东亚和南北美洲,我国有46种10个变种,除南部的海南,东北部的黑龙江、吉林,西北部的新疆等省区外,全国各地均有分布,主产于秦岭以南,尤以西南部至东南部分布的种类为最多[1-3]。明清时代中国江南园林就有栽培,1789年Joseph Banks把绣球花引入了英国,并别名八仙花,花朵艳丽,姿态华美,立即成为世界各地备受欢迎的园艺观赏植物。 1.1 绣球花的形态特征及生态习性 1.1.1 形态特征 落叶灌木或者小乔木,高3 m,枝条开展,冬芽裸露。叶对生,卵形至卵状椭圆形,表面暗绿色,背面有星状短柔毛,叶缘有锯齿。夏季开花,花于枝顶集成大球状聚伞花序,边缘具白色中性花。花期6-7月,花径18-20 cm,全部位不孕花。花初开带绿色,后转为白色,具清香。因其形态像绣球,故命名为绣球花。叶具短柄,对生,叶片肥厚,光滑,椭圆形或宽卵形,先端锐尖,长10-25 cm,宽5-10 cm,边缘有粗锯齿[4-6]。 1.1.2 生态习性 绣球花喜荫,喜温暖气候。最适合绣球的生长温度为18-28 ℃,冬天温度不低于5 ℃。花芽分化则是需要5-7 ℃条件下6-8周,20 ℃温度可促进开花,花开之后维持16 ℃,便能延长观花期。但是高温也能花朵褪色加快。所以华北地区只能盆栽,于温室过冬。绣球花还喜欢生活在湿润,富含腐殖质而排水良好的酸性土壤[7-8]。 1.1.3绣球花的观赏特性和用途 园林用途:绣球花花型丰满,绣球花大色美,是长江流域著名观赏植物。园林中可配置于稀疏的树荫底下或者林荫道旁边,片植于阴坡。因对阳光要求不高,故最适宜栽植于阳光较差的小面积庭院中[9]。建筑物入口处对植两株、沿建筑物列植一排、丛植于庭院一角,都是非常理想。绣球花更适于植为花篱、花境。如将整个花球剪下,瓶插室内,也是上等的点缀品。将花球悬挂于床帐之内,更加觉得雅趣。绣球花性强,耐寒,抗性强,很少感染病虫害所以不仅可以作为优良的观赏地被植物,也可以作为中高档盆花供应市场。绣球花还可以种植于游路边缘,建筑物入口,或丛植几株于草坪一角,或散植于常绿树之前都是美观的。小型庭院中,不仅对植,也可孤植。盆栽绣球花则常作为室内布置用,是窗台绿化和家庭养花的好材料 [10]。 医疗用途:美国研究人员发现, 源于绣球属植物根系的一种药物, 可以用于自体免疫疾病的治疗, 例如风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠疾病、1型糖尿病、湿疹、牛皮癣等。而在中药处方中使用绣球根已经有了数百年的历史。该项研究由细胞与分子医学计划、波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛牙科学院研究人员完成,研究结果发表于2009年6月5日出版的Science杂志[11]。绣球花4种制剂对鼠疟都有明显的抑制作用。总碱及叶水煎膏临床验证共治疗疟疾病人41例,有效率85.3%[12]。绣球花的根、叶、花均可以用于治疗疟疾,有抗疟和解热的作用,但是如果剂量过大能则引起呕吐,功效和副作用颇似常山而作用稍弱。通常单用,或与草果搭配也可以用于肺热喉痛,有清热解毒之效。又外用煎汤洗,或研末涂挫,治疗疥癣、肾囊风等,有清热和止痒的功效。 1.2 国内外绣球花快繁技术研究现状 1.2.1国外研究 绣球原产日本及中国四川一带。1736年引种到英国。在欧洲,荷兰、德国和法国栽培比较普遍,在花店可以看到红、蓝、紫等色绣球品种。在小庭园、建筑物前地栽绣球也不少。德国兰普·琼格弗拉曾(Rampp Jungpflanzen)公司是世界著名的生产绣球的企业,也是绣球新品种最主要的培育和生产单位。其次,荷兰的门·范文公司和以色列的亚格苗圃,也是绣球主要生产企业。但是这些国家都没有将绣球花的培养技术全面推广,主要也是没有得到最适宜的的一套绣球花快繁技术[13-15]。 1.2.2国内研究 目前国内对绣球花的快繁技术研究还在初步的试验阶段,并没有形成一种最适宜的绣球花快繁技术。近年来我国的广州、上海等地从欧洲及日本引进了一些绣球花品种,利用快繁技术进行了快速繁育,但没有得到很好的推广应用。 2007年3月将国外优良绣球属的3个品种,引入德州学院农学系花卉基地,试种成功[16]。由于绣球花的不孕性,对其进行了2种方法的快繁研究。一是不同基质扦插进行繁殖研究,在不同基质对其生根长度、生根数量都有影响。研究采用不同的配比的珍珠岩、灰炭、蛭石等扦插基质,以筛选出最佳的扦插基质[17-18] ;二是绣球花的组织培养的研究,通过6-BA、NAA的浓度不一样而调配出的培养基来对绣球花的初代培养、继代培养和生根培养,以筛选出最佳浓度的培养基[19-20]。 邢合龙、原会营、马开等对绣球花组织培养研究中认为,不同部位的外植体在初代培养的效果不同,其中比较合适的外植体为绣球花的茎尖。因为茎尖本身污染程度低,而其他部位除了嫩叶片都与外界接触时间比较长。虽然叶片污染少,但是叶片是外植体中最不容易分化形成愈伤组织的部位,更不能快速形成不定芽,所以选用茎尖位外植体[21-22]。外植体消毒是一个重要的环节,消毒时间过短不能完全杀死病毒,消毒时间过长会杀死外植体,所以消毒时间要针对外植体选用较为适宜的时间。继代培养中不同的植物生长调节剂配比对侧芽的形成效果不同,植物生长调节剂过少不能促进侧芽的形成和生长,过多则会抑制侧芽的形成和生长[23]。 我国山东德州学院农学系的薛玉剑、金桂芳、苏荣存等[24]在绣球花的扦插繁殖中指出:不同比例的基质对绣球花的扦插有很大的影响,他们主要用珍珠岩、蛭石、泥炭三种材料配置绣球花的扦插基质进行扦插研究,但并没有得到最佳的扦插基质。 欧美、日本等国家的植物学家、园艺学家早就广泛的展开了研究,并对绣球花的快繁技术有深入的研究,并利用快繁技术大量繁育绣球花用于栽培[25]。至今为止,全球绣球花品种大约85种,中国占46种,有63%之多,虽然中国品种繁多,但是由于没有大量的作为观赏花卉进行培养,中国对绣球花的培养已经远远的落后于别的国家。因此,中国需要加快绣球花新品种的引进和应用推广,不仅可以丰富中国园林植物种类,同时也能够增加中国物种的多样性,稳固生态系统等方面有着巨大作用。 目前中国对于绣球花的研究基本上停留在传统栽培品种的快繁技术研究,而对于外来新品种的快速繁殖所做的研究并不多。这次所研究的绣球花品种‘蓝尼康’是由曹基武老师从美国乔治利亚大学所引进的。但是由于中国和美国的地理气候条件存在很大的差异,所以绣球品种‘蓝尼康’在引入中国后怎么样更好的存活,怎么样能快速的繁殖,在中国的应用价值如何等问题都还在研究当中。针对上述的绣球花的快速繁殖问题将进行研究,对提高引入品种的观赏价值,筛选出适合南方城市应用推广的优良品种具有重要的意义。 1.3 国内外组织培养技术研究 1.3.1国外研究 植物组织培养快繁技术是指在无菌的条件下,将离体的植物的根、茎、叶、花等外植体及原生质体培养在人工配置的培养基上面,给予适当的培养条件,使其生长成完整的植株手段[26]。由于培养物脱离植物母体,在玻璃瓶中进行培养,所以也叫做植物的离体培养。过程是:外植体脱分化为愈伤组织。愈伤组织再脱分化为生长点。生长点生长发生为根、茎、叶或者胚状体。然后由胚状体生长成为一个完整的植株。有些情况下,再分化也不用经过愈伤组织阶段,而直接发生于脱分化的细胞[27]。在组织培养技术中,植物由于所获取的营养以及生长环境条件十分良好,所以可以加速育种,缩短繁殖过程,周期也能够缩短。在进行植物组织培养技术的时候可以获得各种水平的无性系,例如细胞、组织、器官或小植株。这些材料统一来自于单一的个体,遗传性非常一致,如果将它们用于试验,则能够避免许多误差,并且试验材料的纯度非常高,可以减少试验的重复而不影响试验的精度[28]。植物组织培养(Plant tissue culture)是20世纪初,以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术。广义的组织培养,指在无菌条件下利用人工培养基在适宜条件下对植物器官、组织、细胞和原生质体的培养。Gambogr曾根据所培养的植物材料的不同,把组织培养分为5种类型,即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养[29]。 以美国及日本研究与推广的无糖培养微繁殖技术又称为光自养微繁殖技术为代表 [30]。它是植物组织培养的一种全新的概念;也是植物非试管快繁技术体系中快繁的一种。是环境控制技术和生物技术的有机结合,是植物组织培养方法的一次创新。现把国外研究的快繁技术简介如下:采用环境控制的手段,用CO2代替传统组织培养方法中的糖作为植物体的碳源。通过人工控制,提供最适宜植株生长的光、温、水、气、营养等条件,促进植株的光合作用,从而促进植物的生长发育[31]。它适用于所有植物的微繁殖。在利用植物组织繁育小植株的过程中,目前共有3种生长方式可以利用。一是植物体靠光合作用进行自然生长(自养);二是植物体靠培养基中的糖进行异养生长(异养);三是植物体既靠培养基中的糖又靠人工光照同时进行异养生长和自养生长(混养)。现在的植物组织培养微繁殖大多数是以第三种方式进行,即在培养基中加入糖又给予一定的人工光照。在这样的培养条件下,小植株长期靠培养基中的糖进行异养和混养生长而导致叶片发育差,气孔开闭功能差、叶片叶绿素含量降低,最终使小植株丧失了光合作用的能力,或者由于环境条件的抑制使光合能力降低。无糖培养微繁殖技术的一个重要特征就是培养基中的糖被除去,而由 CO2代替糖成为植物体的碳源,以减少微生物的污染,促进植株自养进行光合作用,从而促进植株快速生长和发育,以便在短时间内获得大量的遗传均匀一致的植株[32]。但单靠容器内的CO2浓度远远不能满足植株生长的需求,需要人为的输入CO2,一般而言,输入的方式有两种:自然换气和强制性换气,自然换气是培养室的空气通过培养容器的微小缝隙或透气孔进行培养容器内外气体的交换;强制性换气是指利用机械力的作用进行培养容器内外气体的交换。在强制性换气条件下生长的植株一般都比自然换气条件下生长的好[33]。  通过科研人员研究表明,由于无糖培养微繁殖技术改革了传统的用糖和瓶子作为碳源营养和生存空间的技术方法,增加了植物生长和生化反应所需的物质流的交换和循环,促进植株的生长和发育,实现了优质苗低成本的生产,因而该技术较传统组织培养具有明显优势:培养周期大大缩短;种苗驯化期间的成活率大幅度上升,并且复杂的驯化过程得以简化;组培生产工艺的简单化,流程缩短,技术和设备的集成度提高,降低了操作技术难度和劳动作业强度,更易于在规模化生产上推广应用;节省投资,降低生产成本,与传统的微繁殖技术相比,种苗生产成本平均降低30%[34-35]。上述介绍的快繁日本应用较多,我国为适应大田生产的需要和降低快繁成本,大多采用常规快繁,但我们开发的技术及设备也同样适用于严格快繁[36]。目前国内外各种快繁技术的综合与发展,是集育苗之大成,是广义的快繁技术 。 植物组织培养的历史,就是植物细胞全能性理论提出、证明和得到广泛应用的历史。多年的试验结果证明与探究,基本上植物体的所有各个部位进行离体培养,都能再生得到完整的植株[37]。这为植物组培养试验奠定了一定的基础同时也为植物组织培养技术发展成为现代生物技术的至关重要的组成部分,比如:植物组织培养技术的诞生和发展,主要是建立在植物细胞全能性理论的提出。在1839年,细胞学家Shceliden和Shcwnan在其提出的细胞学说中就曾论述到“如果所具备的条件同其所在的有机体内的一样,每个细胞有应能独立生存和发展”。后来1902年,德国著名植物生理学家Haberlandt发表了关于植物细胞培养的第一篇论文,在这个文章中提出了植物细胞具有全能性(totiPoetnt)的设想,即单细胞经过人工培养,可以通过细胞分裂而形成一个完整植株 ,并且具有原植物的全部遗传性[38]。1904年Hanning首先成功地培养除了萝卜和辣根菜的胚。紧接着1922年Kotte和Robbins又分别培育出了离体根尖和茎尖培养[39-40]。Haberlandt在1934年white培养基中培养除了番茄离体根尖,在期间的32年时间里,植物组织培养技术几乎没有什么进展,只是进行了一些初步的探索。1934年荷兰植物学家Went通过试验探究发现了生长素,即吲哚乙酸IAA。随后不少学者又相继发现萘乙酸、2,4-D和吲哚丁酸IBA等人工合成的生长素。这是人类首先认识到的一类生长调节物质。生长素用于植物组织培养,大大推动了研究的进展[41]。同年,White由番茄的根建立了第一个活跃生长的无性系,使根的离体培养试验首次获得了真正的成功。1958年美国植物学家斯蒂瓦特等人,使用将胡萝卜的体细胞利用液体悬浮培养法获得了完整的植株[42-43],为组织培养的技术提供了一个发展平台。植物组织培养是无性繁殖的一部分,它的出现越来越受到世界各国林业工作的高度重视。对于无性系林业的特点,Carson[44]曾做过详细的报道,并受到了世界各国学者的认同[45]。1958-1959年Reiner和Setward分别报道由胡萝卜愈伤组织的单细胞,可以推论出这段时间的各项发明成就已经验证了1902年Haberlandt所提出细胞具有全能性的设想,并且提供了大量的试验依据,为以后组织培养的深入发展奠定了基础[46]。二十世纪60年代以来植物组织培养技术发展极其迅猛,一方面是由于有了前人不停的探究试验所建立的理论和技术基础;另一方面是由于植物组织培养开始走向大规模的应用阶段,通过与良种繁育、常规育种和遗传工程技术相结合,在植物遗传改良的发展中发挥了十分巨大的作用,并且在很多方面已经取得了非常客观的经济效益,为人类的生产生活提供了有效的帮助。1960年,Cocking等用真菌纤维素酶分离原生质体获得成功,大大激发了人们对原生质体培养的热情[47]。1962年,Kanta完善了试管内传粉受精技术,这可克服发生在花粉与柱头间的两性不亲合现象。 1.3.2 国内研究 1945年,我国科学家崔澄和美国科学家斯柯格共同进行了试验,利用不同植物生长调节剂处理愈伤组织,成功的诱导出器官的分化[48-49]。我国植物组织培养创始人之一罗士韦教授在中国科学院上海植物生理研究所开展了组织培养的研究,在很大程度上推进了我国的植物组培技术研究。随后组培技术在全国发展都极其迅速,全国许多农林业科学院所和各个高校都开展了植物组培研究工作,研究探讨植物组培有环境同时也对各种农作物、园艺植物、经济林等上千种植物进行了研究,并且取得了巨大的成就 [50]。在同一时间,组培在试验方面也取得了巨大进步,如郑文静等总结植物组织培养中的遇到的常见问题和解决方法;吴毅明则通过化学纤维、纸卷、沙子、蛭石等代替一般所用的琼脂作为培养基,能够提高根的生活环境,并且促进了植物生根[51];刘思九则利用暴露培养法,就是在敞口培养器中添加特制的粉沫状灭菌材料使其能够覆盖培养基和外植体,减少污染率。并且利用特制装置补水,能够促使组培苗能够长势良好,在炼苗中提高成活率,加大植株的抗性[52]。肖玉兰等研究的无糖箱式培养法,能够降低植组培的生产成本同时也能够促进植物的增长。 随着快繁殖技术以及茎尖培养脱毒技术成熟,自20世纪90年代以来,国家建立了一批苗木繁殖基地,马铃薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、白杨和一些鲜花在现有的商业苗上生产系统,具有良好的经济效益和社会效益,形成了兰花业,香蕉业[53]。例如1986年到1992年春季,中国香蕉生产香蕉组织培养苗总面积达18万hm2。中国香蕉组织培养苗总量高达约1亿,占2/3。马铃薯作为重要的经济作物,无病毒苗产量达到60%,无病毒苗生产已经越来越多的知名企业,如百事可乐公司在中国农业科学院建立无病毒的马铃薯组织文化研讨会。据不完全统计,我国约有二千多个组织培养植物,组织培养技术已建成成千上万株植物[54]。同时随着文化不断扩大,一些较大型国内企业如组织培养和组织培养的规模,海南新会工厂热带植物组织培养研究中心,新海南万亨种子公司,杨凌农业高新技术开发区文化中心等设施和技术不断完善[55]。目前,新会组织文化中心的生产线已经达到自动化的一半,公司还引进了国外新技术和设备。这些植物年生产能力达数千万株,大大满足了市场的需求。 快速传播技术以其低投入、高效率、高质量和生产科研已广泛应用,尤其是退耕还林、城市绿化、园林花卉、蔬菜、茶叶、桑树和其他经济植物需要产生大量的幼苗,如果使用传统的技术,很难满足生产需求[56]。非试管快速传播技术的使用在短期内产生大量的高品质和遗传特性稳定的商品苗,导致国家的绿化和经济发展起着至关重要的作用。特别是加入WTO后,农业的挑战是非常严峻的,如果不提高生产力水平,不使用先进的农业设备和技术,提高产品质量,降低生产成本,并最终将消除市场竞争,所以一些先进实用农业新技术的使用是唯一的武器,赢得市场竞争。植物非试管快速繁殖技术是国内外的生产成本最低,自动化程度最高的工厂自动化的新苗圃技术及其推广和育苗技术的发展将是一场新的革命,也会带来巨大的经济效益和社会效益。 1.4 研究目的及意义 1.4.1研究目的 绣球花花型丰满,绣球花大色美,是长江流域著名观赏植物。园林中可配置于稀疏的树荫下及林荫道旁,片植于阴坡。因对阳光要求不高,故最适宜栽植于阳光较差的小面积庭院中。建筑物入口处对植两株、沿建筑物列植一排、丛植于庭院一角,都很理想。更适于植为花篱、花境。如将整个花球剪下,瓶插室内,也是上等点缀品。将花球悬挂于床帐之内,更觉雅趣。绣球花性强,耐寒,抗性强,很少感染病虫害。既可以作为优良的观赏地被植物,也可以作为中高档盆花供应市场。本次研究不仅能够完善绣球繁育技术体系还能为丰富园林景观植物做出贡献。 1.4.2研究意义 一是可以为城市绿化景观提供更多的选择植物,丰富景观效果。二是这次所研究的绣球花品种‘蓝尼康’是由曹基武老师从美国乔治利亚大学所引进的。但是由于中国和美国的地理气候条件存在很大的差异,所以‘蓝尼康’在引入中国后如何快速繁殖,在中国的应用价值如何等问题都还在研究当中。针对上述绣球花的繁殖问题将进行研究,对提高引入品种的观赏价值,筛选出适合南方城市应用推广的优良品质具有及其重要的意义。 1.5 技术路线 本研究技术路线如下: 绣球品种‘蓝尼康’快繁技术 不同浓度不同植物生长调节剂的对比实验 愈伤培养基的优化 消毒时间的研究 生根培养基的优化 腋芽诱导培养基的优化 组织培养 不同浓度萘乙酸处理的对比 不同植物生长调节剂种类的对比 不同基质配比的对比 扦插繁殖 胚抢救 最佳组培培养基配方 最佳扦插基质和激素配方 最佳种子萌发配方 完善绣球品种‘蓝尼康’繁育技术体系 图1.1 本文技术路线图 Fig 1.1 The technology roadmap 2 绣球花品种‘蓝尼康’扦插繁育技术研究 扦插育苗是选用植物的枝或叶、根等营养器官的一部分作为繁殖材料,插入土壤、泥炭、蛭石等基质中,促其生根、发芽,生长为完整植株的育苗方法。绣球花通过嫩枝扦插可实现规模化繁殖,生长素类植物生长调节剂处理可以促进插条生根,缩短生根时间,提高成活率[57-58] 。生长素在插条内并没有参与有机物的重新建成,只是促使插条下段变成吸收养分中心,起着促进物质交换,调配插条内养分的作用。此外,生长素可能解除基因的抑制,它能提高mRNA的合成,从而促进多种酶的合成,诱导根原始体的发端。试验表明,用生长素处理插条,不仅有利于根原始体的诱导,而且能够促进不定根的生长[59]。但其作用效果具有两重性,对不同的作物筛选出最合适处理浓度和处理方法方能保证其应用效果[60]。薛玉剑等[61]研究了不同基质配比对绣球扦插生根的影响,并未对不同植物生长调节剂种类及浓度进行系统研究。周余华等[62]研究了不同类别的生长调节剂及基质对圆锥绣球扦插育苗的影响。虽然关于绣球花扦插的一些技术问题正在科研人员不断探索中得到解决,但由于不同品种之间基因型的差异使得不同品种的植物培养条件差异很大[63]。关于绣球花‘蓝尼康’的扦插繁殖育苗还未见报道。 2.1材料与方法 2.1.1实验地概况 扦插地点:扦插试验是在湖南长沙的中南林业科技大学温室完成。 试验地概况:长沙市位于湖南省东部偏北,湘江下游和长浏盆地西缘。其地域范围为东经111°53′~114°15′,北纬27°51′~28°41′。长沙属亚热带季风性湿润气候。气候特征是:气候温和,降水充沛,雨热同期,四季分明。长沙市区年平均气温17.2℃,白天最高温度32℃,夜间最低温度15℃,平均温度24.5℃。平均年降水一般是在1300 mm以上,空气相对湿度80%。 温室概况:温室温度范围23-28℃,光照为室外光照的20%-40%。目前,应用于温室气候环境调控的设备有机械式遮阳保温拉幕、机械式开窗通风设备、风机通风设备、湿帘降温装置、喷雾降温设备及照明灯、补光灯等等。以上设备的不同组合和施用构成了不同作用强度的气候环境调节系统。例如,机械式开窗通风设备与温室建筑物的窗口以及窗口的配置组成了自然通风系统,湿帘降温装置与风机在温室建筑物中不同布局组成了不同作用强度的湿帘降温系统。值得注意的是,有些设备的采用仅对某一参数的调控有部分贡献,而有些设备的采用不仅对一种参数的调控有贡献,还会影响到其他参数的调控。如湿帘降温装置需要风机的配合完成其功能的实现,机械式遮阳保温拉幕设备的使用同时影响到光照和温度的调控。所有设备的采用,目的在于温室气候环境可进行调节,保证气候环境可达到所期望的准确和精确程度。 2.1.2 材料与处理 植物材料‘蓝尼康’是由中南林业科技大学曹基武教授从美国引进并移栽于中南林业科技大学苗圃的绣球花,扦插所用枝条均选用植物外围生长健壮、发育良好、无病虫害的1年生枝条,采穗时应采用粗细尽量均匀一致的枝条。首先用新单面刀或枝剪在新品种绣球花支柱上选取当年萌发的新枝,插穗长8 cm左右,然后将绣球花的茎段下方的切口剪斜,上方的切口剪平,去掉基部部分叶片。每批新枝20枝。先用竹签在扦插基质表面插一个小洞,然后迅速插入插穗,再用手将插穗周边压实,扦插完毕后用喷壶喷水,压紧基质。苗床上方盖有透光率为50%的遮阳网,每天用喷壶喷水1次。 2.1.3 不同基质配比试验方法 试验一共设置了6种扦插基质,如表2.1所示。将6种基质分别和消毒后的河沙混合后覆盖在1.0 m×3.0 m的苗床上,浇水透彻后进行扦插。 2.2.2.2不同植物生长调节剂种类的对比试验方法 用浓度均为500 mg/L的植物生长调节剂IAA、IBA和NAA溶液浸泡插穗基部5 min,然后进行统一扦插。 2.1.4 萘乙酸(NAA)的不同浓度处理的对比试验 分别用60、160、180、200、300、400、600、900和1000 mg/L的NAA溶液浸泡插穗基部5 min,然后统一扦插。 以上每个处理均以20个穗条进行试验,3次重复。所有扦插试验均于2016年4月30日开始进行,同年5月30日统计绣球花的成活率和生根情况。 表2.1 扦插试验所用基质配方 Table 2.1 The matrix component for cuttage experiment 试验号 基质配方 1 珍珠岩 2 蛭石 3 沙子 4 珍珠岩:蛭石=1:1 5 蛭石:沙子=1:1 6 珍珠岩:沙子=1:1 2.2 结果与分析 2.2.1扦插基质对‘蓝尼康’扦插的影响 根据表2.2可以得知:在成活率方面,组合4最好,组合5和6其次,组合1和3再之,组合2最差,即组合4>组合5、6>组合1、3>组合2;在平均生根数目方面,组合4和组合6优于其他组合,组合5其次,组合1和3再之,组合2最差,即组合4、6>组合5>组合1、3大于组合2;在生根长度方面,组合6最好,组合4、5其次,组合1、3再之,组合2最差,即组合6>组合4、5大于组合1、3>组合2。表2.2 不同基质对绣球花扦插的影响 Table2.2 The influences of different kinds of matrix on cuttage of Hydrangea 试验号 成活率(%) 平均生根数(条) 生根长度(cm) 1 73. 3±2.9c 5.7 ± 0.30c 1.4 ±0.15cd 2 65.0±5.0d 5.0 ±0.25d 1.3 ±0.15d 3 78.3 ±2.9c 5.6 ±0.26c 1.7 ±0.14c 4 90.0 ±0.0a 7.7 ±0.30a 2.3 ±0.26b 5 83.3 ±2.9ab 7.0 ±0.20b 2.2 ±0.10b 6 85.0 ±8.7ab 7.6±0.20a 2.6 ±0.15a 表中数据为平均值,同一列中不同字母表示数据差异显著(P<0.05)下同。 根据试验得出的结果进行了方差分析,见表2.3:不同基质绣球花的成活率和生根长度都是有很大的影响。可以推论出选用合适的基质对于扦插影响重大。 表2.3 不同基质对绣球花扦插的影响的方差分析 Table2.3 The variance analysis on the influence of different kinds of matrix to the cuttage of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 不同基质 成活率 1212.500 5 242.500 11.640 极其显著 平均生根数目 19.868 5 3.980 59.200 极其显著 生根长度 3.818 5 0.764 26.435 极其显著 根据实验结果分析可以得知:混合基质比单种基质更加有利于‘蓝尼康’的扦插。在成活率方面,组合4和组合6之间没有明显差异,但是在平均生根数和生根长度方面,组合6都优于组合4,可以推论出本实验中最适宜‘蓝尼康’扦插基质是珍珠岩:沙子=1:1,成活率为85%,平均生根数目为7.6条,生根长度为2.6 cm。 2.2.2不同植物生长调节剂‘蓝尼康’扦插的影响 根据表2.4可以得知:在成活率方面,NAA>IBA>IAA;在平均生根数目方面,NAA>IBA>IAA;在生根长度方面,NAA >IAA=IBA。根据实验结果分析可以得知:虽然其他植物生长调节剂对绣球花的扦插有所影响,但是最适宜绣球花扦插的生长调节剂为NAA。在500 mg/L的NAA植物生长调节剂下绣球花的成活率为93%,平均生根数目为7.9根,生根长度为2.1 cm。 表2.4 不同植物生长调节剂对绣球花扦插的影响 Table2.4 The influence of different kinds of plant growth regulator on the cuttage of Hydrangea 不同植物生长调节剂 成活率(%) 平均生根数(根) 生根长度(cm) IAA 76.3±2.9c 7.0±0.47a 1.6±0.11b IBA 86.0±2.9b 7.5±0.41a 1.5±0.11b NAA 93.3±2.9a 7.9±0.46a 2.1±0.25a 根据试验得出的结果进行了方差分析,见表2.5:不同植物生长调节剂对‘蓝尼康 ’的成活率极其显著,对于绣球花扦插生根长度的影响显著,但是对于‘蓝尼康’的生根长度并没有影响。 表2.5 不同植物生长调节剂对绣球花扦插的方差分析 Table2.5 The variance analysis on different kinds of plant growth regulator to the cuttage of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 不同植物生长调节剂 成活率 422.222 2 211.111 25.333 极其显著 生根数目 1.197 2 0.599 2.982 不显著 生根长度 0.596 2 0.298 9.926 显著 2.2.3 不同NAA浓度对‘蓝尼康’扦插的影响 不同浓度的NAA处理对‘蓝尼康’的影响情况如表2.6所示,可以得知:当NAA的浓度达到600 mg/L时,绣球花的生根数达到最高。成活率为93%;在平均生根方面,NAA浓度达到600 mg/L时平均生根数目最多,为8.3根;在生根长度方面,当NAA浓度达到900 mg/L时候,生根长度达到最高,为2.5 cm。 由试验结果分析得出:在成活率和平均生根数方面,600 mg/L的NAA明显优于其他浓度的NAA。在生根长度方面,虽然NAA浓度达900 mg/L时,生根长度达最大值,但是根据表2.6可以得知,900 mg/L和600 mg/L的NAA在生根长度上无明显差异。所以可以得出结论,最适宜‘蓝尼康’扦插的NAA浓度为600 mg/L,成活率为93%,平均生根数目为8.3根,生根长度为2.3 cm。 表2.6 不同NAA植物生长调节剂浓度对绣球花扦插的影响 Table2.6 The influence of different concentration of NAA plant growth regulator on the cuttage of Hydrangea NAA植物生长调节剂浓度mg/L 成活率(%) 平均生根数(根) 生根长度(cm) 60 73.3±2.9f 5.1±0.83d 1.4±0.20e 160 80.3±5.0de 5.5±0.26d 1.5±0.10e 180 83.0±2.9cd 5.7±0.45cd 1.7±0.11de 200 86.3±2.9bc 5.7±0.46cd 1.7±0.11cd 300 88.3±2.9abc 6.4±0.25c 1.8±0.11bc 400 91.0±2.9ab 7.5±0.50ab 2.0±0.15b 600 93.0±2.9a 8.3±0.50a 2.3±0.58a 900 88.0±2.9abc 7.63±0.45ab 2.5±0.20a 1000 75.3±5.0ef 7.3±0.40b 2.1±0.15b 根据试验得出的结果进行了方差分析,见表2.7:不同NAA植物生长调节剂浓度对绣球花‘蓝尼康’的生根数、成活率和生根长度有着极大的影响。 表2.7 不同浓度的萘乙酸处理对绣球花扦插生根影响的方差分析 Table2.7 The influence of using different concentration of NAA on the cuttage rooting of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 NAA植物生长调节剂浓度 成活率 1200 8 150.000 12.462 极其显著 平均生根数 31.833 8 3.979 16.946 极其显著 生根长度 3.073 8 0.384 18.522 极其显著 2.3 讨论 2.3.1 基质的选择 金桂芳等人利用采用珍珠岩、泥炭、蛭石三种基质配比的7种扦插基质,并得出结论利用珍珠岩、蛭石、泥炭做绣球的扦插基质时,以基质中添加泥炭为好,因为泥炭中含有胡敏酸和有机营养,对插穗生根有着非常显著的促进作用,而 1:1 :1 的复配比例,能显著地促进根的生长。试验得出的结论可以看出,无论何种情况下绣球花的成活率都无法达到100%。在不同基质对于绣球花扦插的影响,仅仅只用了三种基质的比较。增加基质的类别,利用三种混合基质对绣球花扦插的影响有待进一步研究。 2.3.2 植物生长调节剂的选择 在不同生长调节剂对‘蓝尼康’的影响实验中,只选用了500 mg/L的浓度,试验结果具有偶然性。试验中只选用了最常见的3种植物生长调节剂的比较,还需要大量的试验来验证NAA为‘蓝尼康’扦插的最佳植物生长调节剂。其他植物生长调节剂对‘蓝尼康’扦插的影响还需要进一步研究。 2.3.3 不同NAA植物生长调节剂浓度对绣球花扦插的影响 周新华,朱宜春,桂尚上[64]等在研究多花黄精组培生根时得出结论,NAA是相比其他植物生长调节剂而言,更能促进植物生根。魏猷刚,周达彪[65]等人研究出适宜NAA浓度处理能缩短绣球花的生根时间,并且提高插穗的成活率。周洲,李永丽[66]等人通过试验表明NAA浓度对欧美杨的生根生芽具有一定的影响。本研究也是得出同样的结果,NAA植物生长调节剂浓度对绣球花的影响是显著的。NAA对绣球花的生根长根长度,生根数目,甚至绣球花的成活率都有着很大的影响。NAA浓度当达到一定程度的时候,能提高绣球花的成活率和生长状态,但是植物生长调节剂浓度过高则会抑制绣球花的生长。 3 绣球花品种‘蓝尼康’组培繁育技术研究 植物组织培养技术是使用植物的细胞、组织、器官等在无菌条件下进行培养可以长出一株幼苗。对培育出的幼苗进行切割并且再次培养,则可以繁育处大量的幼苗。植物组织的快繁技术比常规的繁殖技术快速很多,并且不受周围不良环境的影响,能够随时提供大量的优质苗。植物组织培养技术作为一种基本的试验技术和基础的研究手段被广泛应用于农业、林业、工业等多种行业之中,是现代生物技术的重要组成部分,近年来显示出巨大的应用潜力。21世纪初,林业生物工程提倡无性系林业,其发展很大程度上取决于林木组织培养的水平。植物组织培养技术的快速发展使林业生物工程研究出现勃勃生机,近年来,利用林业生物工程选育优质、高产、多抗的新品种以及在林木细胞融合、原生质体培养、单倍体培养、体细胞和器官培养、微生物转化等方面研究均有突破。 3.1 材料与方法 3.1.1 材料 试验所用的材料来自中南林业科技大学苗圃所采集绣球品种‘蓝尼康’的叶片和带芽茎段。 3.1.2 试验方法 3.1.2.1 消毒方式 外植体消毒:将外植体在自来水下冲洗60 min中后取出放入超净工作台上,先放入75%乙醇消毒30 s,然后用无菌水冲洗3-5次,再用0.1%升汞进行灭菌,最后用无菌水冲洗5-7次,用滤纸吸干。将叶片切成1cm×1cm的正方形,接种于培养基上,放在培养室中培养。 3.1.2.2 愈伤培养基优化 愈伤组织培养的培养基选择了MS、1/2MS和B5三种基本培养基,而在MS培养基中添加了不同浓度的6-BA,NAA,2,4-D和IAA。在培养基类型、植物生长调节剂种类、植物生长调节剂浓度3个方面进行优化。愈伤组织培养的植物生长调节剂配比见表3.1。培养基中加入蔗糖 30 g/L、琼脂6 g/L、pH值为6.0,光照强度为1500-2000Lx,培养温度22℃。每种培养基接种20瓶,每瓶接2个外植体,重复3次,培养后15 d和30 d后记录生长状况。 表3.1 愈伤组织培养的植物生长调节剂配比 Table3.1 The matching of plant growth regulator on the callus culture 试验号 基本培养基 6-BA (mg/L) IBA (mg/L) NAA (mg/L) 2,4-D (mg/L) 试验号 基本培养基 IBA (mg/L) NAA (mg/L) 1 MS 0.5 0.0 0.0 0.0 37 1/2MS 0.0 0.0 2 MS 1.0 0.0 0.0 0.0 38 1/2MS 0.5 0.5 3 MS 1.5 0.0 0.0 0.0 39 1/2MS 0.5 1.0 4 MS 2.0 0.0 0.0 0.0 40 1/2MS 0.5 1.5 5 MS 3.0 0.0 0.0 0.0 41 1/2MS 0.5 2.0 6 MS 0.0 0.5 0.0 0.0 42 1/2MS 1.0 0.5 7 MS 0.0 1.0 0.0 0.0 43 1/2MS 1.0 1.0 8 MS 0.0 1.5 0.0 0.0 44 1/2MS 1.0 1.5 9 MS 0.0 2.0 0.0 0.0 45 1/2MS 1.0 2.0 10 MS 0.0 3.0 0.0 0.0 46 1/2MS 1.5 0.5 11 MS 0.0 0.0 0.5 0.0 47 1/2MS 1.5 1.0 12 MS 0.0 0.0 1.0 0.0 48 1/2MS 1.5 1.5 13 MS 0.0 0.0 1.5 0.0 49 1/2MS 1.5 2.0 14 MS 0.0 0.0 2.0 0.0 50 1/2MS 2.0 0.5 15 MS 0.0 0.0 3.0 0.0 51 1/2MS 2.0 1.0 16 MS 0.0 0.0 0.0 0.5 52 1/2MS 2.0 1.5 17 MS 0.0 0.0 0.0 1.0 53 1/2MS 2.0 2.0 18 MS 0.0 0.0 0.0 1.5 54 B5 0.0 0.0 19 MS 0.0 0.0 0.0 2.0 55 B5 0.5 0.5 20 MS 0.0 0.0 0.0 3.0 56 B5 0.5 1.0 21 MS 0.0 0.5 0.5 0.0 57 B5 0.5 1.5 22 MS 0.0 0.5 1.0 0.0 58 B5 0.5 2.0 23 MS 0.0 0.5 1.5 0.0 59 B5 1.0 0.5 24 MS 0.0 0.5 2.0 0.0 60 B5 1.0 1.0 25 MS 0.0 1.0 0.5 0.0 61 B5 1.0 1.5 26 MS 0.0 1.0 1.0 0.0 62 B5 1.0 2.0 27 MS 0.0 1.0 1.5 0.0 63 B5 1.5 0.5 28 MS 0.0 1.0 2.0 0.0 64 B5 1.5 1.0 29 MS 0.0 1.5 0.5 0.0 65 B5 1.5 1.5 30 MS 0.0 1.5 1.0 0.0 66 B5 1.5 2.0 31 MS 0.0 1.5 1.5 0.0 67 B5 2.0 0.5 32 MS 0.0 1.5 2.0 0.0 68 B5 2.0 1.0 33 MS 0.0 2.0 0.5 0.0 69 B5 2.0 1.5 34 MS 0.0 2.0 1.0 0.0 70 B5 2.0 2.0 35 MS 0.0 2.0 1.5 0.0 36 MS 0.0 2.0 2.0 0.0         3.1.2.3 生根培养基优化研究 外植体选用带芽茎段2 cm左右,培养基选用MS添加NAA,IBA和IAA三种植物生长调节剂。浓度梯度为0.5 、1.0 、1.5、2.0 和3.0 mg/L共五个梯度,总共12种培养基。在植物生长调节剂种类、植物生长调节剂浓度2个方面进行优化。生根诱导植物生长调节剂配比见表3.2。培养基中加入30 g/L、琼脂6 g/L、pH值为6.0,光照强度为1500-2000Lx,培养温度22 ℃。每种培养基接种20瓶,每瓶1个外植体,重复3次。15 d,30 d后观察并记录生根长度和生根数目。 表3.2 生根诱导的植物生长调节剂配比 Table 3.2 The matching of plant growth regulator on rooting induction 试验号 基本培养基 IAA(mg/L) IBA(mg/L) NAA(mg/L) 71 MS 0.5 0.0 0.0 72 MS 1.0 0.0 0.0 73 MS 1.5 0.0 0.0 74 MS 2.0 0.0 0.0 75 MS 0.0 0.5 0.0 76 MS 0.0 1.0 0.0 77 MS 0.0 1.5 0.0 78 MS 0.0 2.0 0.0 79 MS 0.0 0.0 0.5 80 MS 0.0 0.0 1.0 81 MS 0.0 0.0 1.5 82 MS 0.0 0.0 2.0 3.1.2.4腋芽诱导培养基优化研究 腋芽诱导培养的培养基选择了MS基本培养基,而在MS培养基中添加了不用浓度的6-BA,NAA和2,4-D。在植物生长调节剂种类、植物生长调节剂浓度2个方面进行优化。腋芽诱导植物生长调节剂配比见表3.3。培养基中加入蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L、pH值为6.0,光照强度1500-2000Lx,培养温度26℃。每种培养基接种20瓶,每瓶接2个外植体,重复3次,培养后15 d后记录生长状况。 表3.3 腋芽诱导的植物生长调节剂配比 Table3.3 The matching of plant growth regulator on axillary bud induction 试验号 基本培养基 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 2.4-D(mg/L) 83 MS 0.5 0.0 0.0 84 MS 1.0 0.0 0.0 85 MS 1.5 0.0 0.0 86 MS 2.0 0.0 0.0 87 MS 0.0 0.5 0.0 88 MS 0.0 1.0 0.0 89 MS 0.0 1.5 0.0 90 MS 0.0 2.0 0.0 91 MS 0.0 0.0 0.5 92 MS 0.0 0.0 1.0 93 MS 0.0 0.0 1.5 94 MS 0.0 0.0 2.0 3.2 结果与分析 3.2.1 消毒方式对外植体的影响 由表3.4可知,随着升汞消毒时间的加长,染菌个数越来越小,但是当升汞消毒时间达到12 min的时候开始出现褐化现象,并且随着消毒时间的加长,褐化现象更加明显,但是染菌个数减少。当升汞灭菌时间达到20 min时,染菌个数为0,但是褐化个数为17,成活率只有15%。 根据试验结果所统统计出来的结论是:随着升汞消毒时间的加长,对外植体灭菌越加彻底,但是当升汞灭菌时间达到12 min的时候会出现褐化,对植物开始造成损伤。升汞灭菌时间的继续加长,染菌个数明显减少但是褐化个数明显增多。根据灭菌后的成活率显示,升汞灭菌14 min时‘蓝尼康’存活率最高为75%,在12 min的时候成活率只有55%。所以对于绣球品种‘蓝尼康’的最佳升汞灭菌时间为14 min。 表3.4 升汞不同时间的处理对外植体消毒程度的影响 Table3.4 The influence of mercury bichloride in different dealing time on the extent of explants disinfection 升汞消毒时间(min) 接种个数(个) 染菌个数(个) 褐化个数(个) 存活个数(个) 成活率(%) 6 20 20 0 0 0 8 20 20 0 0 0 10 20 15 0 5 25 12 20 8 1 11 55 14 20 3 2 15 75 16 20 2 6 12 60 18 20 1 12 7 35 20 20 0 17 3 15 根据表3.5分析可以得知,升汞的处理时间对于绣球花‘蓝尼康’的成活率、存活个数和褐化个数是极其显著。 表3.5 升汞不同时间的处理对外植体消毒程度的方差分析 Table3.5 The variance analysis on mercury bichloride in different dealing time to the extent of explants disinfection 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 升汞处理时间 成活率 16640.625 7 2377.232 3169.643 极其显著 存活个数 665.625 7 95.089 126.786 极其显著 褐化个数 880.500 7 125.786 335.429 极其显著 3.2.2 单种植物生长调节剂对绣球花的愈伤组织的诱导 从表3.6中可以看出,随着6-BA浓度的升高,愈伤组织生长速度快速,并且长势越好,当植物生长调节剂浓度到达1.5 mg/L的时候愈伤启动时间为19 d,愈伤率达到84.16%。当浓度超过1.5 mg/L的时候,叶片愈伤生长缓慢并且发黄甚至愈伤死亡。随着IBA植物生长调节剂浓度的升高,愈伤组织生长速度快速,并且长势越好,当浓度到达1.5 mg/L的时候愈伤启动时间为18 d,愈伤率达到75.83%。当浓度超过1.5 mg/L的时候,叶片愈伤生长缓慢但是愈伤率逐渐增加,但是愈伤也逐渐发黄。 随着NAA植物生长调节剂浓度的升高,愈伤组织生长速度快速,并且长势越好,当植物生长调节剂浓度到达1.5 mg/L的时候愈伤启动时间为11 d,愈伤率达到89.16%。当浓度超过1.5 mg/L的时候,叶片愈伤生长减缓,愈伤变黄甚至死亡。随着2,4-D植物生长调节剂浓度的升高,愈伤组织生长速度快速,并且长势越好,当植物生长调节剂浓度到达1.5 mg/L的时候愈伤启动时间为18 d,愈伤率达到86.66%。当浓度超过1.5 mg/L的时候,叶片愈伤生长缓慢并且发黄甚至愈伤死亡。 从表3.9中可以看出,除了6-BA对绣球花的影响只是显著,IBA、NAA和2,4-D植物生长调节剂对绣球花的影响都是极其显著,说明绣球花‘蓝尼康’对于植物生长调节剂格外敏感。同时在所有单个植物生长调节剂的刺激下,NAA植物生长调节剂相比其他几个植物生长调节剂对绣球花的愈伤培养更为有利。在NAA植物生长调节剂浓度到达1.5 mg/L的时候愈伤启动时间为11 d,愈伤率达到89.16%并且达到了顶峰。所以如果在只有单个植物生长调节剂的刺激下,选择NAA1.5 mg/L的植物生长调节剂将会加大绣球花‘蓝尼康’愈伤组织的培养。 表3.6 不同浓度的植物生长调节剂在MS培养基上对绣球花的愈伤组织培养的影响 Table 3.6 The different concentrations of hormones in the effect of MS medium on Hydrangea callus culture 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 1 22±1.1 66.66±3.8d 19 26±1.0 85.83±5.20cd 2 21±1.0 76.66±3.81d 20 27±2.6 78.33±1.44g 3 19±1.1 84.16±3.81de 21 18±3.0 82.50±2.50d 4 24±2.0 74.16±1.44d 22 16±2.1 86.66±6.29bc 5 28±2.0 65.83±6.29d 23 15±2.0 93.33±1.44ab 6 24±2.0 74.16±3.81de 24 16±3.0 90.83±1.44ab 7 20±1.5 75.00±4.33de 25 18±2.0 82.50±2.50de 8 18±3.0 75.83±6.29de 26 12±1.5 94.16±1.44a 9 21±2.1 86.66±3.81bcd 27 15±3.5 91.66±1.44ab 10 26±4.5 66.66±5.20e 28 18±0.5 84.16±1.44d 11 17±2.5 85.83±3.81cd 29 20±1.5 80.00±2.50de 12 13±0.5 85.83±5.20cd 30 16±0.5 91.66±1.44ab 13 11±1.5 89.16±3.81ab 31 18±2.5 93.33±1.44ab 14 11±1.5 78.33±5.20d 32 22±3.0 88.33±3.81ab 15 25±3.0 75.83±1.44de 33 24±2.5 80.83±1.44de 16 25±2.0 76.66±3.81de 34 26±2.0 74.16±5.20de 17 19±2.0 82.50±2.50de 35 26±2.5 68.33±3.81e 18 18±1.5 86.66±3.81bcd 36 28±3. 64.16±1.44e 3.2.3 不同基本培养基对绣球花的愈伤组织的诱导 从表3.6-3.8中可知,MS、1/2MS和B5培养基是无法使‘蓝尼康’绣球花叶片较快的长出愈伤组织。而在MS、B5和1/2MS不同培养基的对照下,培养基对于绣球花‘蓝尼康’的愈伤组织培养影响不显著。同时可得知3种培养基培育出的愈伤组织普遍愈伤率偏低,启动时间较长,愈伤组织长势缓慢。得出结论:更换MS培养基对于愈伤组织的培养并未有较大影响,同时在单个植物生长调节剂的刺激下,愈伤组织生长速度缓慢并且长势堪忧。所以研究多个植物生长调节剂对于愈伤组织的影响变得格外重要。 表3.7 不同浓度植物生长调节剂在1/2MS培养基上对绣球花的愈伤组织培养的影响 Table3.7 The influence of different concentrations of plant growth regulator in 1/2 MS medium on callus culture of Hydrangea 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 37 24±2.0 71.66±2.88e 45 24±2.0 75.83±5.20de 38 22±0.5 80.83±1.44cd 46 22±1.5 80.83±1.44cd 39 21±1.0 82.50±2.50bc 47 23±1.5 84.16±1.44bc 40 23±1.5 72.5±2.50e 48 24±2.0 81.66±1.44cd 41 20±1.5 83.33±2.88bc 49 24±1.5 75.83±3.81de 42 17±1.7 84.16±3.81bc 50 25±1.1 75.83±3.81de 43 16±1.5 88.33±5.20ab 51 25±0.5 67.50±6.61e 44 14±2.0 90.83±1.44a 52 28±0.5 65.83±1.44e       53 29±1.1 60.83±1.44e 表3.8 不同浓度植物生长调节剂在B5培养基上对绣球花的愈伤组织培养的影响 Table 3.8 The influence of different concentrations of plant growth regulator in B5 medium on callus culture of Hydrangea 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 试验号 启动时间(天) 愈伤组织诱导率(%) 54 17±1.1 78.33±2.88bc 62 19±2.6 83.16±1.60b 55 16±1.1 81.66±1.44bc 63 22±1.5 83.33±2.88b 56 15±0.5 84.16±3.81b 64 23±1.5 82.50±2.50bc 57 19±2.0 84.16±3.81b 65 25±1.0 76.66±2.88cde 58 20±1.1 81.66±2.88bcd 66 26±1.1 75.83±3.81de 59 21±1.5 75.83±5.20de 67 23±2.5 80.83±1.44bcd 60 22±1.5 76.66±6.29cde 68 25±0.5 73.33±1.44e 61 15±0.5 90.83±1.44a 69 26±1.1 66.66±2.88e       70 29±1.1 64.16±1.44e 表3.9 不同浓度单个植物生长调节剂处理对绣球花愈伤组织培养影响的方差分析 Table3.9 The variance analysis on different concentration of single plant growth regulator to the influence on callus culture of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 6-BA植物生长调节剂浓度 启动时间 69.600 4 17.400 4.350 显著 愈伤组织诱导率 829.784 4 207.446 74.088 极其显著 IBA植物生长调节剂浓度 启动时间 134.4 4 33.600 8.400 极其显著 愈伤组织诱导率 950.727 4 237.682 69.906 极其显著 NAA植物生长调节剂浓度 启动时间 339.60 4 84.900 53.063 极其显著 愈伤组织诱导率 513.624 4 128.406 71.257 极其显著 2,4-D植物生长调节剂浓度 启动时间 213.6 4 53.400 19.071 极其显著 愈伤组织诱导率 243.784 4 60.946 17.540 极其显著 3.2.4 多种植物生长调节剂对绣球花的愈伤组织的诱导 从表3.10中可以得出,多种植物生长调节剂对绣球花愈伤组织培养影响显著。从表3.6中可以看出,多个植物生长调节剂同时刺激绣球花‘蓝尼康’的愈伤组织比单个植物生长调节剂刺激更为明显。而最佳的愈伤植物生长调节剂配比为MS+IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L,愈伤启动时间为接种后12 d。诱导愈伤率达到94.16%。根据方差分析可以得知IBA和NAA植物生长调节剂对绣球花愈伤组织的刺激也是极其显著。 在愈伤组织培养过程中,如果能用多种植物生长调节剂进行培养则优先选用IBA1.0 mg/L和NAA1.0 mg/L的混合搭配。IBA和NAA的其他搭配一般都要比单个植物生长调节剂刺激愈伤组织的效果要强。不过绣球花‘蓝尼康’不管选用什么样的植物生长调节剂搭配都难以使愈伤率达到100%。而且愈伤启动时间也比较缓慢,植物生长调节剂浓度过高又容易导致愈伤组织死亡。 表3.10 不同浓度多个植物生长调节剂处理对绣球花愈伤组织培养影响的方差分析 Table3.10 The variance analysis on different concentrations of plant growth regulator to the influence on callus culture of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 IBA和NAA植物生长调节剂浓度 启动时间 1041.000 15 69.400 52.050 极其显著 愈伤率 3719.069 15 247.938 92.212 极其显著 3.2.5 不同植物生长调节剂对绣球花生根的影响 从表3.11可得知,三种植物生长调节剂中,效果最佳的是IBA,其次是NAA,最后是 IAA。随着植物生长调节剂浓度的增加,IBA和NAA均出现了不同程度的愈伤化,对植株的生根有所影响。随着植物生长调节剂浓度的增加,同时促进了植株的生根速度和生根长度。在IAA的刺激下,‘蓝尼康’的生根率虽然偏高,但是生根率很难达到100%。而IBA达到1.0 mg/L时生根率为100%,平均生根时间为6.7 d,生根长度为2.0 cm。当NAA达到1.0 mg/L和1.5 mg/L的时候生根率也达到100%。但是当NAA在1.5 mg/L的时候带芽茎段出现了愈伤情况,而愈伤组织容易影响带芽茎段的生根。NAA浓度在1.0 mg/L的时候平均生根时间为7 d,平均生根长度为1.9cm。根据表3.11中IBA和NAA比较,可以得出IBA1.0 mg/L对绣球花的生根更加有利。所以可以得出结论,绣球花的生根培养基最好选用MS+IBA1.0 mg/L,平均生根时间为6.7 d,生根长度为2.0 cm。 表3.11 不同植物生长调节剂对绣球花生根的影响 Table3.11 The influence of different plant growth regulators on the rooting of Hydrangea 试验号 生根率(%) 生根时间(d) 生根长度(cm) 生长状态 71 81.66±1.44e 12±1.1b 0.5±0.11e 正常 72 86.66±1.44d 11±1.0bcd 1.4±0.15d 正常 73 83.33±1.44e 7±1.1ef 1.6±0.10d 正常 74 72.50±2.50e 15±1.5a 0.6±0.10e 正常 75 94.16±1.44b 8±0.5de 1.9±0.15bc 正常 76 100±0.00a 6.7±0.5e 2.0±0.10ab 正常 77 98.33±1.44a 8±1.5de 2.2±0.21a 轻微愈伤 78 90.833±1.44c 9±1.5cd 1.2±0.30e 重度愈伤 79 87.50±2.50d 9±1.1cd 1.7±0.11cd 正常 80 100±0.00a 7±1.5e 1.9±0.05bc 正常 81 100±0.00a 8±2.0e 2.0±0.21ab 轻微愈伤 82 92.50±2.50bc 11±1.5bc 1.6±0.05de 轻微愈伤 从表3.12中可得知,通过方差分析可以得知NAA、IBA和IAA对绣球花的生根都有着极大的影响,除了IBA在生根时间上只是有显著影响,其他植物生长调节剂在生根率、生根长度和生根时间上都有着极其显著的影响。说明绣球花的生根也很容易受植物生长调节剂的影响。 表3.12 不同植物生长调节剂对绣球花生根的影响的方差分析 Table3.12 The variance analysis on the different plant growth regulators to the influence on rooting of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 NAA 生根率 302.250 3 100.750 40.300 极其显著 生根长度 1.033 3 0.344 133.777 极其显著 生根时间 60.356 3 20.119 15.188 极其显著 IBA 生根率 188.250 3 62.750 41.833 极其显著 生根长度 0.270 3 0.90 17.837 极其显著 生根时间 22.380 3 7.460 7.460 显著 IAA 生根率 308.25 3 102.750 82.200 极其显著 生根长度 0.247 3 0.091 914.000 极其显著 生根时间 23.422 3 7.807 7.807 极其显著 3.2.6 不同植物生长调节剂对绣球花腋芽诱导的影响 从表3.13中可以得出:三种植物生长调节剂相互比较下,6-BA优于NAA,而NAA优于2,4-D即6-BA>NAA>2,4-D。在6-BA植物生长调节剂作用下,绣球花‘蓝尼康’的出芽率和出芽个数逐渐上升,当6-BA浓度达到1.0 mg/L的时候达到顶端,出芽率为92.5%,平均出芽个数为3.3个。然后随着浓度的升高,出芽率和出芽个数下降。最适宜绣球花‘蓝尼康’腋芽诱导的培养基为:MS+6-BA 1.0 mg/L,出芽率为92.5%,平均出芽个数为3.3个。 表3.13 不同植物生长调节剂对绣球花腋芽诱导的影响 Table3.13 The influence of different plant growth regulators on the axillary bud induction of Hydrangea 试验号 腋芽诱导率(%) 平均出芽数(个) 83 81.66±1.44b 2.2±0.1c 84 92.50±2.50a 3.3±0.2a 85 84.16±1.44b 3.1±0.1a 86 70.83±1.44c 1.7±0.1d 87 79.16±.44b 2.1±0.2cd 88 81.66±2.88b 2.6±0.1b 89 80.00±2.50b 2.5±0.1b 90 64.16±5.20d 1.5±0.1e 91 71.66±2.88c 1.3±0.1d 92 70.83±5.20c 1.9±0.2de 93 61.66±2.88d 1.6±0.1e 94 55.83±5.20e 0.9±0.1e 根据表3.14可以得出,不同植物生长调节剂对绣球花腋芽诱导的不管是出芽率、出芽总数还是平均出芽数都有着非常大的影响。 表3.14 不同植物生长调节剂对绣球花腋芽诱导影响的方差分析 Table3.14 The variance analysis on the different plant growth regulators to the influence on axillary bud induction of Hydrangea 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 6-BA 腋芽诱导率 824.200 3 274.750 157.500 极其显著 平均出芽数 5.302 3 1.767 70.700 极其显著 NAA 腋芽诱导率 380.250 3 126.750 126.750 极其显著 平均出芽数 2.220 3 0.740 74.000 极其显著 2,4-D 腋芽率 626.250 3 208.750 208.750 极其显著 平均出芽数 0.982 3 32.750 32.750 极其显著 3.3 讨论 3.3.1 外植体的消毒 外植体消毒是植物组织培养的重要环节之一,获得无菌且具有生长活性的外植体是组织培养取得成功的重要因素[67]。组培试验能否成功的一个因素是:是否有效的杜绝染菌。而杜绝染菌主要分为三大方面:外植体灭菌、培养基灭菌和无菌操作。现在的培养基消毒和无菌操作的条件已经非常成熟。所以外植体的消毒是组培试验能否成功的很大一个因素。如何掌握外植体的消毒时间、消毒方式等是需要经过很多试验才能得出的结论。高浓度的乙醇会在细菌表面形成一层保护膜,阻止乙醇进入细菌体内,难以将细菌彻底杀死。但如果乙醇浓度过低,虽然可进入细菌,但不能将细菌体内的蛋白质凝固,同样也不能将细菌彻底杀死。经过众多试验表明75%的乙醇消毒效果最好。所以此试验所用的乙醇浓度为75%。升汞属于重金属,蛋白质的变性中有一条就是重金属,所以升汞可以使蛋白质变性,从而起到消毒的作用,但是因此升汞是一种有毒物质,不仅对人体危害大而且残留物也会对环境有所影响。汞及其化合物可通过呼吸道、消化道或皮肤吸收,若是不小心汞中毒,则会有头痛、头晕、乏力、失眠、多梦、口腔炎、发热等全身症状,更甚者急性腐蚀性胃肠炎,严重者昏迷、休克,甚至发生坏死性肾病致急性肾功能衰竭。所以选择升汞灭菌也属于无奈之选。根据采摘外植体的不同时间,不同部位,所用的消毒时间而有所不同。本实验中绣球花‘蓝尼康’最佳的消毒方法是:用自来水冲洗30-60min后,用0.1%升汞灭菌14min,无菌水冲洗外植体 4到5次。再接着放入75%乙醇消毒30 S,最后用无菌水冲洗5到7次,用滤纸吸干。而且本试验所用的只不过是绣球花的一个品种,其他绣球花种类消毒时间还需要继续进行摸索。作为组培的第一步,绣球花的消毒灭菌探索条件还需要进一步的摸索,希望能找到更方便更适宜更环保的灭菌方法。 3.3.2 褐化现象 褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题,而且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难,所以也常常有人认为,褐化能否得到有效的控制是植物组织培养能否成功的关键。植物组织培养中所说的褐化是指在外植体诱导初分化或者再分化的过程当中,自身组织从表面想培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色,外植体也进一步变褐而死亡的现象[68]。影响外植体褐化主要有两个因素:一个是外植体自身的原因,包括外植体的生长状态、生理特性等;第二个是外植体培养的所处环境,其中包括了培养基的成分及培养条件等。不同的外植体部位、取材时间、外植体大小、受伤程度等等都影响植物体是否褐化及褐化程度。所以在组培过程中,外植体的褐化往往是多种因素共同作用的结果,为了有效的控制褐化,外植体的选择和培养环境至关重要。外植体组织的受伤害程度会直接影响到外植体褐化的发生。外植体越小,切面雨体积的比率越大,伤害及其褐化的程度也会越大。所以,在切取外植体的时候,需要尽量减少伤口的面积,同时伤口处尽量剪切品种平整。在组培过程中,外植体出现褐化是植物在一种逆境下的适应性反应,所以在最适宜的培养条件下,外植体处于正常生长状态能够有效的抑制褐化。 虽然已经有效的控制了绣球花组培过程中的褐化现象,但是无法完全阻止褐化。褐化往往浪费了大量的原材、时间精力等。所以如何把握好取材部位、取材时间、外植体大小、受伤程度、培养基的配置、培养条件是至关重要的。 3.3.3 玻璃化现象 玻璃化指在组织培养过程中,有些植物的嫩茎、叶片往往会呈现半透明状,水浸状的现象,又称过度水化。玻璃苗的分化能力降低,难以增殖生根苗,这是一种生理失调症。目前已报道出现玻璃化苗的植物已经高达70多种。随着玻璃化产生机理研究的深入,某些植物的玻璃化已经得到了有效的控制。主要措施主要有:(1)选择不容易玻璃化的基因型及部位做外植体;(2)采取改善氧气供应状况和通气条件,控制温度 ,适当低温处理,降低容器内相对湿度;(3)适当提高蔗糖含量,降低培养基中的水分;同时减少细胞分裂素及生长素等方法均可以减少玻璃苗的发生。虽然对组织培养中出现的问题的发生、机理及控制进行了一定的研究,但是尚未能找到普遍适用的行之有效的解决办法,成为提高组织培养繁殖率和增加培养过程稳定性的主要障碍。因此对这些问题的研究仍需继续深入,以其找到更好的解决办法 ,使控制措施从治标走向治本,从而使植物组织技术发挥更大的作用[69]。 3.3.4 培养基的选择 培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都包括碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。一些培养基还含有抗菌素和色素。培养基是从无土栽培的营养液发展而来的,所以在某种意义上说就是模拟土壤。最初的培养基就是简单的马铃薯浸出液即土豆汁。后来随着植物生理学和生物化学的研究深入,培养基越来越复杂,成分越来越多。当支持物(如:琼脂、明胶)的发现并且应用到培养基的培养基中时,固体培养基也就随之诞生。固体培养基是组织培养基中最常用的一种培养基类型。人工合成培养基通常包括大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、支持物和植物植物生长调节剂。大量元素和微量元素通常使用无机盐代替,铁盐通常以螯合铁的形式出现,有机复物通常包括氨基酸、代谢载体和维生素等,糖可采用蔗糖或者葡萄糖,支持物一般采用高分子交联糖链(如聚半乳糖硫酸酯),这几类物质的用量和配比在多少年的发展中已经基本上形成了若干个模板,例如试验室中常用的MS、B5、Nicher培养基。按所用原料不同,可分为两类:应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的,称为天然培养基;应用化学药品配成并标明成分的,称为合成培养基或综合培养基。在化学试剂中的培养基,大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管,现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基需要防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),如果需要较长时间的贮存,必须存放在2-6℃的冰箱内[70]。愈伤组织的基础培养基有很多种,常见的有:MS、1/2MS、B5等。根据所培养的植物不同,所用的培养基也不一样。陆碧云[71]、陈笑蕾[72]等用的1/2MS培养基,而蔡新玲[73]、姚晓[74]等人则用的B5作为培养基。 不同的培养基有着不同的用处。在本试验愈伤组织培养中选用了3中培养基分别是:MS、1/2MS和B5。愈伤组织培养所用的培养基还有很多种,虽然本试验选用的三种培养基培养愈伤组织的效果并无太大的区别,但是绣球花的愈伤组织培养所用的培养基还需要进一步的探索,挖掘出更适合培养绣球花愈伤组织的培养基。而在生根诱导和腋芽诱导的培养基中只选用了最基础的 MS培养,其他的培养基并未尝试。多种培养基对绣球花的影响还有待深入研究。 3.3.5 植物生长调节剂的选择 生长调节因子植物植物生长调节剂,是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素,也是人工调控组织培养至关重要的存在。几乎所有的植物组织培养工作者都同意植物植物生长调节剂在组织培养中具有无可动摇的核心地位[75]。植物植物生长调节剂包括五大类:生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中最常用的就是生长素和细胞分裂素。生长素与细胞分裂素的共同作用在组织培养中十分重要,即所谓的“植物生长调节剂杠杆”。比如:生长素生物学效应高于细胞分裂素时,诱导植物组织脱分化和根原基的形成;细胞分裂素的效应高于生长素时,诱导植物组织再分化和芽原基的形成。生长素包括很多种,如1-奈乙酸、吲哚乙酸和2,4-D等,它们的生物学效应有着微妙的不同,但总体效应是一致的。细胞分类素也是如此,包括6-苄基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤和玉米素等。植物植物生长调节剂在培养基中的用量通常在0.01-10 mg/L之间变化,细胞分裂素的浓度在非生根培养中要大于生长素。值得指出的是,植物植物生长调节剂的用量要考虑组织内源植物生长调节剂的含量及其生理学周期效应。换言之,植物生长调节剂的生物学效应是组织内源植物生长调节剂和人工添加的外源植物生长调节剂效应的总和。只有准确把握内源植物生长调节剂与外源植物生长调节剂的协同作用,才能有效地操作“植物生长调节剂杠杆”,合理的利用植物植物生长调节剂,做好植物组织培养[76]。 本试验在愈伤组织中选用了常见的4种植物生长调节剂,在生根培养中选用了三种植物生长调节剂,种子萌发中选用了三种植物生长调节剂。植物生长调节剂的种类有很多,单纯的几种植物生长调节剂太过于狭隘,更何况还有多种植物生长调节剂共同刺激。在试验中培养愈伤组织始终无法让愈伤率达到100%。而在生根培养中,生根率已经达到了100%。在生根培养和芽诱导培养中只选用了3种植物生长调节剂,4种梯度。如果选用的植物生长调节剂种类再多一些,梯度再分的更细一点,能够进一步完善绣球花‘蓝尼康’的组培体系。而在芽诱导培养中,芽的诱导率最高只达到了92%,并未达到100%。虽然绣球花‘蓝尼康’的组培体系已经初步建成,但是还需要选用更多的植物生长调节剂种类,尝试不同组合,将体系进一步的完善,绣球花的组培还需要未来不停的探索。 3.3.6 培养基pH值 培养基的pH值通过直接影响培养基的酸碱度、培养物对培养基中营养成分的吸收、调控组织培养过程中发生的各种生化反应来影响植物的组织培养效果[77]。廉家盛[78]等研究发现在蓝莓“美登”组织培养过程中最适宜的pH范围为5.4-5.8,且培养基的pH值对其增殖分化有显著影响;张玉红[79]等研究影响黄檗快速繁殖的培养条件时发现pH值影响其增殖和壮苗;张延红[80]等通过比较不同温度和培养基的pH值对黄芪组培苗叶片生长的影响,结果发现:在较低温度下,黄芪叶片生长速度快且呈绿色,培养基的最适宜pH是5.8,而当pH值很高时,组培苗的短枝则生长缓慢、叶片枯黄。 3.4 炼苗与移栽 炼苗是在保护苗木的情况下,采取空气流通、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程,使其定植后能够迅速适应土地的不良环境条件,缩短缓苗时间,增强对低温、大风等的抵抗能力,从而提高苗木的生存能力。组培苗生活在组培室中,非常脆弱,在移栽外界的时候炼苗就显得格外至关重要。 选用生长旺盛,根系发达的组培苗能大大提高绣球花的炼苗之后的成活率。而生根少,生长矮小的绣球花在移栽至温室棚的时候格外脆弱,很容易抵抗不了外界的刺激从而失去生理机能。 当生根后或根系得到基本发育后,将培养瓶移到室外遮阴蓬或温室中进行强光闭瓶练苗5-20 d左右,遮阴度宜为50%-70%。将培养容器的盖子或塞打开,在自然光下进行开瓶练苗3-7 d,正午强光或南方光照较强地区要注意采取措施如用阴蓬或温室避免灼伤小苗。如果在开盖容器中培养不超过1周,一般不会引起含蔗糖培养基的污染问题。开瓶炼苗可以分阶段进行,即首先松盖(或塞)一两天,然后部分开盖一两天,最后完全去盖。这种方法在相对湿度十分低的屋内特别有好处。培养容器的开口大小也影响开盖的速度,开口大的瓶盖应比开口小的瓶盖除去的速度慢一些。试管苗移栽是组织培养过程的重要环节,这个工作环节做不好,就会造成前功尽弃。试管苗从琼脂培养基中移出时要用长镊子小心取出,彻底清洗干净根部(因为残留的蔗糖和营养会成为潜在的致病微生物的生长培养基,洗不净容易引起移栽苗烂根死亡),并且避免损坏根系。之后直接移栽或使用 0.1%-0.3%的高锰酸钾或多菌灵等杀菌剂溶液中清洗,然后用清水清洗后移入苗床或盆钵,也可用水清洗后用多菌灵溶液浸泡10-30 min后移栽,栽后淋足定根水。炼苗在塑料薄膜(或玻璃)温室内或遮阴网室内进行,使用温室或温棚时应注意设置通风口,防止浇水后高温引起萎蔫及高湿引起烂苗。生长基质应当具有适合的pH值、多空隙、良好的排水和通气性能,如一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例为1:1:0.5。也可用砂子:草炭土或腐殖土为1:1。这些基质在使用前应高压灭菌,或用至少小时烘烤来消灭其中的微生物。由于移出的试管小植株极容易感染病,所以生长环境的卫生状况和病害防治对移栽能否成功十分关键。通常对生长基质、培养容器和苗床进行消毒处理,采用新的培养容器或聚乙烯薄膜效果都很好,必要时可喷施稀的杀菌剂。移出的试管苗一般在炼苗前4周遮阴要达到50%-90%,并采用喷雾洒水保持一定的湿度(85%左右),之后逐渐降低湿度和增强光照。湿度降低幅度及光照增加量依不同植物而定,总体上应促使老叶缓慢衰退并同时产生新叶。如果降低或增加过快,会使叶片褪绿和灼伤,缓苗期延长,甚至导致移栽苗死亡。但是,只要小植株能够忍受,尽可能高的光照水平是有利的。温度不应低于20℃,最好达到25-30℃。但温度湿度过高易于滋生杂菌,造成苗霉烂或根茎处腐烂,因此应对温度加以控制。遮阴和调节湿度(喷雾或塑料薄膜覆盖)也有助于控制温度。在炼苗时可适当施用大量和微量元素,如采用1/4或1/2 MS培养基溶液。移栽后定期施肥才能保持苗木旺盛生长,具体施肥方法(顶部喷施或掺入基质)与施肥量随不同植物而异[81-82]。 移栽一般在春季进行,如果在北方早春或冬季较冷的时节,可能需要对移栽苗床下铺电线进行加温,促进根系功能的恢复,直至新叶形成为止。对于较难移栽的植物,可先经沙床或营养盘移栽后,再移至营养袋中培育壮苗,也可直接移入营养袋中。直到长成一定规格(一定的高度、粗度和新叶数)和无病害的壮苗后,在大田中定植。也可不进行体外生根培养,直接将试管外或瓶外生根与炼苗相结合,也就是对无根苗进行直接移栽。这种方法对某些植物行之有效,并可大大节约成本,所需要的环境条件与生根试管苗的炼苗要求相同,特别需要注意湿度、光照和温度。在向生根基质移植前,有时需要经生长素诱导生根处理。 4 绣球花品种‘蓝尼康’胚抢救繁育技术研究 植物的胚是一个多细胞的结构,具有形成新个体的能力。胚可以从一个特殊的细胞、合子胚活体细胞发生,一个胚具有根的两级结构和茎原基结构。正常的胚,较小的结构也能够发育成一个完整的植物,小到一花一草,大到红豆杉等木本植物。这种巨大的潜能主要是由于胚具有特殊的结构。在正常亲合条件下,幼胚能够发育成熟并展现其潜力。在一些情况下,在早期就应该判断其发育是否收到抑制,对具有有价值的基因型,确保能够及时进行胚抢救。 4.1 材料与方法 4.1.1 材料处理 种子在授粉之后子房壁膨大,待子房壁变黄后采摘。用自来水冲洗脱壳后的成熟种子,去除杂质,并且用无菌水浸泡12h后冲洗风干,最后置于0℃冰箱中备用。 挑选干燥饱满的种子,先放入75%乙醇消毒30 s,然后用无菌水冲洗3-5次,再用0.1%升汞进行灭菌,最后用无菌水冲洗5-7次,用滤纸吸干。无菌条件下,将处理好的种子接种到培养基中进行培养。 4.1.2试验方法 种子培养的培养条件是选用MS培养基添加NAA、IBA和6-BA三种植物生长调节剂,0.5 、1.0 、1.5 、2.0 和3.0 mg/L共五种梯度,蔗糖30 g/L,琼脂6 g/L,pH值为6.1,光照强度为1500-2000Lx,培养温度26℃。每种培养基接种5瓶,每瓶接10个种子,重复3次,培养后15 d和30 d后记录生长状况。 4.2 结果与分析 4.2.1 种子萌发试验 由表4.1可知,随着各个植物生长调节剂浓度的增加,绣球花‘蓝尼康’的种子萌发时间和萌发率逐渐增加,但是当IBA和6-BA浓度达到1.0 mg/L之后,种子萌发天数逐渐变长。NAA浓度达到1.5 mg/L的时候种子萌发天数达到最短,11 d。随着各个植物生长调节剂浓度的增加,绣球花种子的萌发率逐渐变高,当三个植物生长调节剂浓度均达到1.5 mg/L的时候种子萌发率均达到最高点,NAA达到82%,IBA达到 83%,6-BA达到78%。三种植物生长调节剂相互比较下,6-BA植物生长调节剂对绣球花种子萌发的刺激相对比较薄弱。综合考虑各个因素,最适宜绣球花种子培养的培养基应为MS+NAA 1.5 mg/L,种子萌发天数为11 d,萌发率为82%。但是调节各个植物生长调节剂并不能让绣球花的种子萌发率达到100%,所以如何更好的促进绣球花种子萌发还需要更多的时间进行探索。 表4.1 不同植物生长调节剂浓度对绣球花种子萌发的影响 Table 4.1 The influence of different kinds of concentration for plant growth regulators on the seed germination of Hydrangea 植物生长调节剂 种子萌发天数(天) 种子萌发率(%) NAA植物生长调节剂浓度(mg/L) 0.5 17±0.5cd 72±1.1g 1.0 14±1.7ef 76±1.1def 1.5 11±0.5g 82±2.3ab 2.0 15±1.1de 81±1.1abc 3.0 20±0.5b 70±1.1gh 6-BA植物生长调节剂(mg/L) 0.5 13±1.7fg 73±3.0fg 1.0 11±0.5g 77±1.1de 1.5 18±2.5bc 83±3.0a 2.0 18±0.5bc 82±3.0ab 3.0 20±0.5b 72±3.0g IBA植物生长调节剂(mg/L) 0.5 16±0.5cd 73±1.1fg 1.0 12±0.5fg 79±2.3bcd 1.5 18±0.5bc 78±1.1cd 2.0 20±1.5b 74±2.0efg 3.0 26±1.5a 68±2.0h 根据表4.2和表4.3可以得出,NAA、6-BA和IBA对绣球花种子萌发都有着极其显著的影响。从一开始的植物生长调节剂对绣球花的愈伤组织培养,到后面的对绣球花生根的影响,可以看出绣球花对于各个植物生长调节剂的刺激表现格外显著。 表4.2 绣球花种子萌发天数结果方差分析 Table4.2 The variance analysis on the result of seed germination’s time 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 NAA 种子萌发率 434.400 4 108.600 108.600 极其显著 6-BA 种子萌发率 213.600 4 53.400 53.400 极其显著 IBA 种子萌发率 417.600 4 104.400 47.455 极其显著 表4.3绣球花种子萌发率结果方差分析 差异源 指标 Ⅲ型平方和 df 均方 F 显著性 NAA 种子萌发天数 158.400 4 39.600 18.00 极其显著 6-BA 种子萌发天数 198.000 4 49.500 22.500 极其显著 IBA 种子萌发天数 158.400 4 39.600 24.750 极其显著 Table4.3 The variance analysis on the result of seed germination rate 4.3 问题与讨论 胚抢救( Embryo rescue)是指对由于营养或生理原因造成的难以播种成苗或在发育早期阶段就败育、退化的胚进行早期分离培养。胚抢救是果树早熟类型品种的选育以及近年来对无核类果树品选育所采取的有效手段与成功方法之一。1933年 Tukey 成功的培养了甜樱桃的幼胚成为胚培养的里程碑 ,自1987年至今 , Ramming 利用胚挽救技术已成功的培育出了早熟桃与无核葡萄。现在胚抢救技术在各个领域的应用越来越广泛。但是胚抢救中培养基的培养是最难掌握的,需要大量的试验进行摸索条件。李泽、谭晓风[83]等人以‘葡萄桐’种胚为试材做了组培试验,试验中选用了MS、1/2MS、1/4MS和WPM培养基,得出1/2MS培养基是油桐种胚再生体系建立的最佳培养基。本研究只选用了MS一种培养基,培养基种类过于单一,在培养的选择中有不足之处。其他培养基对‘蓝尼康’胚抢救的影响还有待研究。而且本试验选用了3种植物生长调节剂5种梯度,仍然无法使种子萌发率达到100%。所以使用多种组合的培养基和植物生长调节剂会对绣球花‘蓝尼康’胚抢救的培养基探索起到促进作用。 5 全文结论、创新点及研究展望 5.1 全文结论 1.扦插试验结果表明,NAA对绣球花‘蓝尼康’的生根长度,生根数目,甚至绣球花的成活率都有着很大的影响。适合‘蓝尼康’扦插的基质为珍珠岩:沙子=1:1,成活率为85%,平均生根数目为7.6条,生根长度为2.6 cm。在500 mg/L的3种植物生长调节剂下,最适宜绣球花扦插的植物生长调节剂为NAA,成活率为93%,平均生根数目为7.9根,平均生根长度为2.1 cm;最适宜绣球花扦插的NAA浓度为600 mg/L,成活率为93%,平均生根数目为8.3根,平均生根长度为2.3 cm。 2.绣球花‘蓝尼康’叶片最佳的消毒方法是:用自来水冲洗30-60 min后,然后在超净工作台上用75%乙醇消毒,无菌水冲洗外植体4到5次,用0.1%升汞灭菌14 min。再接着最后用无菌水冲洗5到7次,用滤纸吸干,接种到的初代培养基中进行培养。 3.在绣球花‘蓝尼康’的组织培养试验中,最佳的愈伤植物生长调节剂配比为MS+IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L,接种后12 d有愈伤组织长出,诱导愈伤率达到89.16%;最佳的生根培养基为:MS+IBA1.0 mg/L,生根率为100%,平均生根时间为6.7d,生根长度为2.08 cm;最适宜绣球花‘蓝尼康’腋芽诱导的培养基为:MS+6-BA 1.0 mg/L,不定芽的诱导率为为92.5%,每个外植体不定芽的平均数量为3.3个。 4.在胚抢救繁育技术中种子萌发培养基为:MS+NAA1.5 mg/L,11d后种子开始萌发,种子萌发率达到82%。 5.2 创新点 1.本次试验首次研究了绣球花品种‘蓝尼康’的繁殖技术。 2. 本研究首次研究了绣球花品种‘蓝尼康’的胚抢救试验,获得了绣球花‘蓝尼康’的组培苗。 5.3 研究展望 本研究从扦插、组织培养和胚抢救三个方面进行的。发现选择合适的消毒方式及调节不同种类植物生长调节剂的配比是‘蓝尼康’组织培养成功的关键。在扦插方面,已经筛选出适合‘蓝尼康’的扦插基质和植物生长调剂及浓度;在扦插方面,已经筛选出适合 ‘蓝尼康’愈伤组织、生根和腋芽诱导的较佳培养基配方。在胚抢救方面,筛选出适合‘蓝尼康’种子萌发的植物生长调节剂和浓度。为完善绣球花繁育技术体系提供了数据和依据。 参考文献 [1] 卫兆芬.绣球属. 中国植物志[M].北京:科学出版社, 1995, 35(1):23-28. [2] 卫兆芬. 中国绣球属植物的修订[J].广西植物, 1994, 14(2):101-121. [3] 陈有名主编. 园林树木学[M].北京:中国林业出版社.1991. [4] 金桂芳,薛玉剑, 苏荣存,等. 国外引进优良绣球的快繁技术研究[J].北方园艺, 2009(7):192-194. [5] 郑万钧. 中国树木志[M].北京:中国林业出版社,1985. [6] 徐振华,王学勇. 花团锦簇八仙花[J].植物杂志,1999, (4) :23. [7] 杨杰雄. 花中珍品-八仙花[J].农村实用技术,2002, (6) :35. [8] 黄 林,黄小云.四川省及重庆市绣球属的分类研究[J].西南师范大学学报:自然科 学版,2001,26(3): 317-322. [9] 刘海俐,邵明丽. 地被植物在园林中的应用探讨[J].现代园艺,2008(5):48-49. [10] 潘瑞烛, 董愚得. 植物生理学[M].北京高等教育出版社,1995. [11] 黄世英,玉光添. 绣球花抗疟实验研究及临床疗效观察[J].广西中医药,1988, (03):44. [12]《中国药物大全》编委会. 中国药物大全·中药卷(2版) [M].北京:人民卫生出版社. [13] 韩玉林. 银边绣球品扦插繁殖技术[J].现代农业大学,2008,17:90-92. [14] Ziv M, MeirG, Halved a H.Factors influence the production of burdened gaucho plantlets in vitro [J].Planted, Tissue and Organ Culture,1993,2(1):55-60. [15] Crocker W,Barton L V.Physiology of seeds[M].USA: Chronics Botanical Co.1957. [16] 李际红,梦凡伟. 绣球花组织培养的技术研究[M].山东林业科技,2002,139:20-21. [17] 谭 巍. 八仙花栽培技术[J].北方园艺.2006(1):96-97. [18] 李万方. 八仙花栽培技术[J].北方园艺.2005(55)73-77. [19] 任叔辉. 八仙花的组织培养于快速繁殖技术[J].防护林科技.2006(1):10-11. [20] 韩玉林. 优良观赏树种银边绣球品的组织培养技术[J].林业实用技术,2009, 01:52-55. [21] 陈志萍. 绣球花盆栽及促成栽培技术[J].上海农业科技,2004(4):112. [22] 韩玉林. 银边绣球扦插繁殖技术[J].现代农业科技,2008(17):90-92. [23] 张卫芳. 八仙花的组织繁殖技术[J].花卉,2005(1):24. [24] 金桂芳,薛玉剑,苏荣存,等. 不同基质配比对绣球扦插生根的影响[J].安徽农业科 学,2009,37(14):6416-6419. [25] 韩玉林. 优良绣球品种培养技术[J].安徽农业科学,2008,29:12581-12809. [26] Jackson, G.E., Grance J.Field measurement of xylem cavitations:are Acoustic emissions useful [J].J.Exp.Bot.1996,47:1643-1650. [27] Crane J.C.Iwakiri B.T.Morphology and reproduction in fruit tress[J].California Pistachio Industry Annual Report,1992 . [28] Kottewand Ber.[D].Bot.ges.1922,40:269-272. [29] RobinsW[J].Bot.gaz.1922,73:376-390. [30] Wullschleger S, Meinzer FC,Verges RA. A review of whole-plant Water use studies in tress[J].Tree Physiology,1998,18:499-512. [31] Tward F.C, Holsten J.R. Dandsmlth J. Growth and organized development of culture dells 11:groxvth and division of freely suspendedcells. Amer [J].Bot. 1958, (45): 693 -703. [32] Steward F. Cand Pollard J.K. Proe. 4thInternatl. Cong[J]. Bioehem. VOI.6, 1975, 8:66- 114. [33]Skoog F,C. Tsui. Grol Vthsubstanees and the formation of budsin plant tissue [J]. In: Plant growth substanee(Ed:Skoog),1951,265-285. [34] Carson M.J Advantages of clonal forestry for Pinusradiatereal orimagined [J]. N2.J. ForSei. ,1986,16(3):403-415. [35] Zobel BJ. Talbert J.T APPIiedforest tree improvement [J].J.Wiley&Sons.N.Y1984. [36] Choi J.K.Lee J.S Studies on some of the principal factors involved in cold hardiness of Hibiscus Syracuse [J]. Journal of the Korea Society for Horticultural Science. 1988 , 29(2):114-125. [37] Choi J.K.Lee J.S Studies on some principal factors involved in cold hardiness of Hibiscus surfaces.cold hardiness in relations to plant temperature and plant Constituents[J]. Journal of the Korea Society for Horticultural Science. 1989,30(1): 51-59. [38] Evitt.Rrsponses of Plant to Environment Stresses[R].New York:Academic Press,1980. [39] Hummel R.L. Teets T.M.Protein comparisions of non-and cold-acclimated Hibiscus Syracuse and H.rosa-sinensis[J].HortScience.1990,25(3):365. [40] BongaMnadDunarDJ.Tissue Culture in Fores. ytMartinus Nijhoff/ D. rW.Junk, The Hgaue, The Nehterlnads. 1982. [41] Choi J.K.Lee J.S.Studies on some of the principal factors involved in cold hardiness of Hibiscus Syracuse.Journal of the Korea Society for Horticultural Science [J]. 1988 (2): 114-125. [42] Choi J.K.Lee J.S.Studies on some principal factors involved in cold hardiness of Hibiscus surfaces.cold hardiness in relations to plant temperature and plant constituents.Journal of the Korea Society for Horticultural Science [J]. 1989, 30 (1) :51-59. [43] McClintock,E.The culticated Hydrangens[J].Baileyam,1956,4:165-175. [44] McClintock,E. Hydrangens[J].Nation.Hort.J.1957b,36:270-279. [45] McClintock,E. Hydrangens[J].Calif.Hort.J.197334(4):141-145. [46] Hummel R.L.Teets T.M.Protein comparisons of non-and cold-acclimated Hibscus Syracuse and H.rosa-sinensisi[J].HortScience.1990,25(3):365. [47] Evitt. Rrsponses of Plant to Environment Stresses[R].New York:Academic Press, 1980. [48] 崔德才, 徐培文. 植物组织培养与工化育苗[M].北京:化学工业出版社,2003,48. [49] 刘 欣,薛金芝,赵 丹,裴崎君. 植物组织培养技术在林木育种中的应用.吉林林 业科技,2007(5):9. [50] 曹孜义. 实用植物组织培养技术教程[M].兰州:甘肃科学技术出版社,1996. [51] 李浚明. 植物组织培养教程[M].北京:中国农业大学出版社,2002(3):61-64. [52] 王文静,袁道强,高松杰. 植物组织培养的应用现状.河南师范大学学报(自然科学 版)2000,8,28(3). [53] 谭文澄,戴策刚. 观赏植物组织培养技术[M].北京:中国林业出版社,2000:102. [54] 王正生,李凤鸣. 紫锻嫩枝扦插和移栽技术研究初报[J].吉林林业科 技.1989,78(2):1-3. [55] 谭文澄,戴策刚. 观赏植物组织培养技术[M].北京:中国林业出版社,2000:369-399. [56] 吴淑平,吕立哲,郑杰,党永超,竹玮. 不同扦插基质对茶树良种快繁的影响[J]. 河 南农业科学,2013,(08):38-40. [57] 郭伦发,林春蕊,何金祥,等. NAA对金花茶扦插成活率的影响[J]. 福建林业科 技, 2008,35(3):106-109. [58] COPES D L,MANDEL N L.Effects of IBA and NAA reatments on rooting Douglas first cuttings [J].New Forests,2000,20(3):249-257.  [59] 王 宁,曹帮华. 杨树嫩枝扦插实验[J].山地农业生物学报.2004,(1). [60] 郑君宝,刘玉君.几种木本植物插穗生根与内源IAA、IBA的关系[J].植物生理报,1991,17(3):313-316. [61] 薛玉剑, 金桂芳, 苏荣存. 不同基质配比对绣球扦插生根的影响[J]. 安徽农业科 学, 2009, 37(14):6416-6416. [62] 周余华,周 琴,蒋涛,等. 生长调节剂及基质对圆锥绣球扦插育苗的影响[J]. 江苏 农业科学, 2016, 44(9):204-207. [63] 李 泽,谭晓风,袁军,等. 油茶良种‘华硕’的组织培养及高效生根[J].植物生理学 报,2014(11):1721-1726. [64] 周新华,朱宜春,桂尚上,等.多花黄精组培生根技术研究[J].经济林研究, 2015, 33 (4) :102-105. [65] 魏猷刚,周达彪,韩 勇,吴志鹏,张宗俊. 萘乙酸对绣球花嫩枝扦插生根的影响 [J]. 仲恺农业工程学院学报,2016,(04):27-29. [66] 周 洲,李永丽,安世恒,等.欧美杨108高效组培再生系统[J].中南林业科技大学学报,2016,36(7):1-6. [67] 吴玲利, 柯镔峰, 龚春,等. 白木通组织培养及快速繁殖[J]. 植物生理学报, 2015 (6):903-908. [68] 翟晓桥. 木本植物组织培养褐化控制策略[J].河南林业科技,2008(1):38-40. [69] 陈兵先,黄宝灵,吕成群,杨来安,陈文军,任苓,王劲松. 植物组织培养试管苗玻璃化 现象研究进展[J].林业科技开发,2011,(01):1-5. [70] 梁称福. 植物组织培养研究进展与应用概况[J].经济林研究,2005,(04):99-105. [71] 陆碧云. 四种药用野生蕨类植物的组织培养研究[D].广西:广西师范大学,2009. [72] 陈笑蕾. 牡丹组织培养的初步研究[D]河南:河南农业大学,2005. [73] 蔡新玲. 不同桂花品种群组织培养的研究[D].安徽:安徽农业大学,2007. [74] 姚 晓,步 达,陈建伟,李祥,汤彬. 南方红豆杉愈伤组织培养及其紫杉烷二萜类成分的分析[J].中草药,2014,(18):2696-2702. [75] 傅华龙,何天久,吴巧玉.植物生长调节剂的研究与应用[J].生物加工过程, 2008, (04) :7-12. [76] 张锋,潘康标,田子华. 植物生长调节剂研究进展及应用对策[J].现代农业科技, 2012, (01):193-195. [77] Owen H R, Wengerd D, Miller A R. Culture medium pH is influenced by basal mediu m, carbohydrate source, gelling agent, activated charcoal, and medium storge method [J]. Plant Cell Report, 1991, 10:583-586. [78] 廉家盛,朴炫春,廉美兰,等.培养基种类、玉米素浓度及pH值对蓝莓“美登”组培增殖生长的影响[J].延边大学农学学报, 2010, 32(4):269-271. [79] 张玉红,曲伟娣. 培养条件对黄檗快速繁殖影响的研究[J].植物研究, 2008, 28(2):236-239. [80] 张延红,高素芳,朱田田,等. 基本培养基及温度和对黄芪组织培养的影响[J].甘肃农业科技,2011,03:7-9. [81] 马宗新,汪茂斌,赵红柳,申飞,张书,杜俊兴. 组培苗的炼苗技术[J]. 安徽农业科学,2000,(04):420-421. [82] 龙冰雁,李增援. 浅论组培苗的炼苗技术[J]. 安徽农学通报,2006,(06):82. [83] 李 泽,谭晓风,张琳,龙洪旭,袁军,范晓明,曾艳玲. 油桐种胚再生体系的建立[J]. 经济林研究,2012,(04):119-122. 附录1: MS培养基母液配制 The MS culture medium mother liquor preparation 母液名称 药品名称 原配方规定量(mg/L) 扩大倍数 配制母液称取量(g) 母液体积(ml) 配1升培养基吸取量(ml) 大 量 元 素 NH4NO3 1650 10 16.5 500 50 K NO3 1900 19 KH2PO4 170 1.7 CaCl2·2H2O 440 4.4 MgSO4·7H2O 370 3.7 微 量 MnSO4·H2O 22.3 200 4.46 500 2.5 元 素 ZnSO4·7H2O 8.6 1.72 H3BO3 6.2 1.24 KI 0.83 0.166 Na2MO4·2H2O 0.25 0.05 CuSO4·5H2O 0.025 0.005 CoCl2·6H2O 0.025 0.005 铁盐(棕色) Na2-EDTA 37.3 100 3.73 250 2.5 FeSO4·7H2O 28.7 2.87 有机营养 烟 酸(Vpp) 0.5 100 0.05 250 2.5 盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 0.05 盐酸硫胺素(VB1) 0.1 0.01 甘氨酸 2 0.2 肌 醇 100 10 附录2: B5母液配置表 Fig6.2 The B5 culture medium mother liquor preparation 化合物名称 分子式 分子量 标准量(mg/L) 扩大倍数 称取量(mg) 定容体积(ml) 每升抽取量(ml) 大量 硫酸铵 (NH4)2SO4 132 134 100 13,400 2000 20 硝酸钾 KNO3 101.11 2500 250,000 七水硫酸镁 MgSO4·7H2O 246.47 250 250,000 四水磷酸二氢钠 NaH2PO4·4 H2O 192 150 15,000 钙盐 二水氢化钙 GaCI2·H2O 147.02 150 100 15,00 1000 10 铁盐 七水硫酸亚铁 FeSO4·7H2O 278.02 27.8 100 2,780 2000 20 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 372.25 37.3 3,730 微量 碘化钾 KI 166.01 0.75 200 150 1000 5 硼酸 HBO3 61.83 3.0 600 七水硫酸锌 ZnSO4·7H2O 287.54 2.0 400 二水钼酸钠 NaMoO4·2H2O 241.95 0.25 50 一水硫酸锰 MnSO4·1H2O 169.01 10 2,000 五水硫酸铜 CuSO4·5H2O 249.68 0.025 5 六水氯化钴 CoCI·6H2O 237.93 0.025 5 有机 盐酸硫胺素 C12H11CIN4HCI 337.27 10 100 1,000 500 5 盐酸吡咯醇 C8H11O3NHCI 205.64 1.0 100 烟酸(VB3) NC5HCOOH 123.11 1.0 100 有机醇 肌醇(环已六醇) C6H12O6 180.16 100 100 10,000 500 5 附录3:试验相关图片 图1-3 扦插实验成果图 Fig 1-3 The cutting experiment result map 图4-7 愈伤组织各个时期成果图 Fig 4-7 The callus of each period the result map 图8-11 生根培养各个时期成果图 Fig 8-11 The take root culture results in different historical periods 图12-14 胚抢救实验各个时期的成果图 Fig 12-14 The experimental results of various periods figure embryo rescu 本文档由香当网(https://www.xiangdang.net)用户上传

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    山有木兮゛

    贡献于2018-11-19

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