微生物限度检查法


     
       中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法
     
    细菌霉菌酵母菌计数
    1 简述
    细菌霉菌酵母菌计数检测非规定灭菌制剂原辅料受微生物污染程度方法评价生产企业药原料辅料设备器具工艺流程环境操作者卫生状况重手段
    细菌霉菌酵母菌计数均采板菌落计数法活菌计数方法目前国际许国家常种方法琼脂板细菌霉菌酵母菌形成独立见菌落计数该法测**果反映该规定条件生长细菌(群嗜中温需氧兼性厌氧菌)霉菌酵母菌菌落数包括营养氧气温度pH素特殊求细菌霉菌酵母菌
    细菌霉菌酵母菌菌落均菌细胞生长繁殖成供试品中测菌落数实际菌落形成单位数(colony forming unitycfu)应理解细菌霉菌酵母菌数
    2 设备仪器
    21 设备
    211 洁净实验室
    微生物限度检查应单独洁净实验室洁净实验室应独立净化空气系统
    2111 结构求
    洁净实验室应采光良避免潮湿远离厕污染区操作间缓间间应样品传递舱出入操作间缓间门应直洁净实验室应六面光滑整耐受清洗消毒墙壁面天花板连接处应呈凹弧形缝隙留死角操作间应安装水道
    洁净实验室明灯应嵌装天花板室光应分布均匀光度低300LX
    2112 温度湿度 洁净实验室温度应控制18~26℃相湿度40%~60%
    2113 操作间
    操作间应安装空气菌滤层流装置洁净度应低10000级局部洁净度100级(放置等级净化工作台)操作间净化工作台洁净空气应保持环境形成正压低10Pa操作间缓间应保持相正压低5Pa操作台备药物天乙醇灯火柴乙醇棉球橡皮乳头等
    2114 缓间 缓间应洗手盆菌衣帽口罩鞋套等
    2115 洁净级检查方法
    通常采尘粒数浮游菌数沉降菌数测定法(参医药工业洁净室(区)悬浮粒子浮游菌沉降菌测试方法现行国家标准)进行洁净度验证
    洁净级微粒浮游菌沉降菌标准见表1
    表l –洁净级微粒浮游菌沉降菌标准
    洁净级
     
    尘埃数<<m3
    浮游菌()<<m3
    沉降菌()<<
    (Ф90mm?05h)
    微粒直径≥05μm
    微粒直径≥5μm
    100级
    ≤3500
    ≤0
    ≤5
    ≤1
    10000级
    ≤350000
    ≤2000
    ≤100
    ≤3
    100000级
    3500000
    ≤20000
    ≤500
    ≤10
     
    沉降菌数测定(Ⅱ法)
    洁净实验室操作台消毒擦拭处理先启动层流净化装置30min备妥营养琼脂板3(30~35℃预培养48h证明菌落生长)菌方式(传递箱)移操作间置净化台左中右1开盖暴露30min盖盖30~35℃培养箱倒置培养48h取出检查3板生长均菌落数超1
    条件单位时应检查洁净操作间净化工作台浮游菌微粒数
    操作问净化工作台定期检测洁净度分应达10000级100级菌落数微粒数超标应清洗滤系统中滤设施必时予更换
    2116 次操作前01%苯扎溴铵溶液适宜消毒液擦拭操作台污染死角然启动层流净化装置
    212 阳性菌实验室
    涉实验室监控菌株分离鉴定样品阳性菌株分离分析方法验证试验中阳性菌操作等实验活动应专门阳性菌实验室进行规定外阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准阳性菌实验室应配备生物安全柜阳性菌操作供试品检验洁净实验室进行
    213 洁净实验室阳性菌实验室洗刷灭菌消毒培养结果观察工作间等设施应相集中布局合理避免污染便理
    22 仪器
    221 恒温培养箱(30~35℃)生化培养箱(23~28℃)微波炉匀浆仪(3000~8000
    r/min)康氏振荡器恒温水浴电热干燥箱(100~300℃)电冰箱离心机离心微孔滤膜薄膜滤器蒸汽灭菌器(时进行灭菌效果检查应定期请关部门检定)
    菌落计数器显微镜(40×~1500×)电子天药物天(感量01g)pH计
    222 玻璃器皿
    锥形瓶(250~300ml500ml装玻璃珠干)培养皿(9cm)量筒(100ml500m1)试(18mm×180mm)塞吸(1m1分度00l10m1分度01)注射器(20ml30m1)涂布棒注射针头载玻片盖玻片玻璃消毒缸(带盖)锈钢桶(带盖)玻璃器皿前应洗涤干净吸量筒挂水滴残留抗菌物质吸口端距05cm处塞入约2cm适宜疏松棉花置吸筒牛皮纸袋中锥形瓶量筒试均应加棉塞硅胶塞振荡器制备混悬液时尚需玻璃纸包裹瓶塞免振荡时供试液污染瓶塞牛皮纸包扎玻璃器皿均160℃干热灭菌2h高压蒸汽121℃灭菌30min烘干备
    223 具
    橡皮乳头(放干净带盖容器中应定期70%~75%乙醇溶液浸泡)菌衣帽口罩手套(洗净配套牛皮纸包严)灭菌备次性菌衣帽口罩手套
    接种环(白铱金镍铬合金环径4~5mm长度6~10cm)乙醇灯乙醇棉球碘伏棉球灭菌剪刀灭菌手术刀灭菌镊子灭菌钢锥灭菌称样纸锈钢药匙试架火柴记号笔白瓷盘洗手盆陶瓦盖(12cm)实验记录纸等
    3 试液稀释剂试剂
    31试液
    311 01%苯扎溴铵溶液适宜消毒液(供洗手擦拭操作台面)
    312 5%石碳酸溶液(配装入玻璃消毒缸供消毒带菌吸)选适宜消毒液
    313 75%乙醇溶液
    314 碘酊碘伏溶液
    32 稀释剂试剂
    稀释剂配制采高压蒸汽灭菌法灭菌
    321 09%菌氯化钠溶液(附件二31)
    322 pH70菌氯化钠蛋白胨缓液(附件二35)
    323 菌聚山梨酯80氯化钠蛋白胨缓液(附件二34
    324 pH68菌磷酸盐缓液pH76菌磷酸盐缓液(附件二33)
    325 菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二32)
    326 菌01%氯化三苯四氮唑溶液(TTC)(附件二215)
    327 pH72菌磷酸盐缓液(附件二33)
    4 培养基
    41 营养琼脂培养基(附件二52)
    42 玫瑰红钠琼脂培养基(附件二54)
    43 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基(附件二55)
    培养基制备注意事项:
    431
    采干燥培养基说明配制应灭菌培养基pH进行校验配培养基原料应挑选琼脂凝固力应测定确定配制时琼脂量试剂规格应化学纯
    432 配制培养基应沉淀沉淀应溶化趁热滤灭菌
    433 培养基分装量超容器2/3免灭菌时溢出包装时塞子必须塞紧免松动脱落造成染菌
    434 培养基配制应2h灭菌避免细菌繁殖
    435 灭菌培养基应保存2~25℃防止污染3周毕保存密闭容器中1年制备培养基放置时间宜长免水分散失染菌
    436 宜采水浴微波炉加热熔化琼脂培养基勿电炉直接熔化琼脂培养基免营养成份度受热破坏已熔化培养基应8h次完剩余培养基宜
    44 培养基适性实验求操作见操作规程第三部分
    5 供试品抽样保存检验量
    51 抽样
    511 般采机抽样方法抽样量应检验量(2包装单位)3~5倍量(备复试留样观察)
    512 抽样时发现异常疑样品应选取疑问样品机械损伤明显破裂包装作样品
    513 药品瓶口(外盖侧瓶口周围)外观出长螨发霉虫蛀变质药品直接判合格品需抽样检验
    52 保存
    521
    供试品检验前应保存阴凉干燥处勿冷藏冷冻防供试品污染菌保存条件妥致死损伤繁殖
    522 供试品检验前应保持原包装状态严禁开启包装已开启样品作供试品进行检查
    53 检验量
    531 剂型检验量均需取2包装单位(中药蜜丸需取4丸膜剂取4片)
    532 固体半固体(黏稠性供试品)制剂检验量10g
    533 液体制剂检验量10ml
    534 膜剂规定外检验量100cm2
    535
    特殊贵重微量包装药品检验量酌减规定外口服固体制剂低3g液体制剂采原液者少6ml采供试液者少3ml外药品少5g
    求检查沙门菌供试品检验量应增加20g20ml(中10g10ml阳性试验)
    6 试验准备
    61
    供试品已灭菌皿锥形瓶匀浆杯试吸(1ml10m1)量筒稀释剂等移洁净实验室次试验物品必须事先做计划准备足够量避免操作中出入洁净实验室编号全部外包装(牛皮纸)掉
    62 开启洁净实验室空气滤装置工作低30min
    63 操作员肥皂适宜消毒液洗手进入缓间换工作鞋01%苯扎溴铵溶液消毒液洗手乙醇棉擦手穿戴菌衣帽口罩手套
    64 操作前先乙醇棉球擦手碘伏棉球(乙醇棉球)擦拭供试品瓶盒袋等开口处周围干灭菌手术镊剪供试品启封
    7 供试液制备
    根供试品理化特性生物学特性采取适宜方法制备供试液乳化剂分散剂中剂灭活剂量应证明效微生物毒性供试液制备需水浴加温时温度应超45℃时间超30min规定外常供试品制备方法:
    71 液体供试品
    取供试品10ml加pH70菌氯化钠蛋白胨缓液100ml混匀作供试液油剂加入适量菌聚山梨酯80供试品分散均匀水溶性液体制剂混合供试品原液作供试液
    72 固体半固体黏稠液供试品
    取供试品10g加pH70菌氯化钠蛋白胨缓液100ml匀浆仪适宜方法混匀作供试液必时加适量菌聚山梨酯80置水浴中适加温供试品分散均匀
    73 非水溶性供试品
    731 软膏乳膏剂
    取供试品5g(5m1)加含溶化(温度超45℃)司盘805g单硬脂酸甘油酯3g聚山梨酯8010g菌混合物(溶化温度超45℃)烧杯中先烧杯中菌助溶剂混合物溶化温度超45℃时加入供试品菌玻棒搅拌成团分次慢慢加入45℃pH70菌氯化钠蛋白胨缓液100ml边加边搅拌供试品充分乳化作120供试液
    732 油剂 取供试品10ml加入菌聚山梨酯80 5~8ml摇匀加入稀释剂100ml作110供试液
    733 栓剂 称取供试品10g置灭菌锥形瓶中加适量稀释剂置45℃水浴保温10min溶加入菌聚山梨酯80
    5~8ml振摇乳化加稀释剂(稀释剂聚山梨酯80总量100m1)摇匀作110供试液
    734 膏剂
    取供试品10g加含20ml菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅪH菌检查法)菌玻璃珠适宜容器中必时增加十四烷酸异丙酯量充分振摇供试品溶解然加入45℃pH70菌氯化钠蛋白胨缓液100m1振摇5~10min萃取油水明显分层取水层作110供试液
    74 非水溶性膜剂供试品
    般取样100cm2置灭菌锥形瓶中加入适量pH70菌氯化钠蛋白胨缓液45℃±1℃水浴中保温浸泡振摇供试品浸液作l10供试液中药膜剂取100cm2剪碎加适量pH70菌氯化钠蛋白胨缓液(通常1
    cm2加1ml2m1)浸泡振摇供试品浸液作110供试液
    7.5 肠溶结肠溶制剂供试品
    取供试品10g肠溶制剂加pH68菌磷酸盐缓液100ml结肠溶制剂加pH76菌磷酸盐缓液100ml均置45℃水浴中振摇溶解作110供试液
    76 气雾剂喷雾剂供试品
    取规定量供试品置冰箱冰冻室(-20℃)约1h取出迅速消毒供试品容器开启部位周围菌钢锥容器钻孔室温轻轻转动容器抛射剂缓缓全部释出菌注射器吸出全部药液加适量稀释剂(含非水溶性成份加适量菌聚山梨酯
    80)中混匀取相10g10ml供试品稀释成110供试液
    77 茶剂供试品
    取供试品10g置灭菌锥形瓶中加入稀释剂100ml振摇2~3min灭菌纱布滤(袋泡茶直接取2袋称样结果110加稀释剂浸泡30min)
    供试品吸水膨胀黏度高增加稀释剂量制成120~1100供试液
    78 贴膏剂供试品
    取规定量供试品掉贴剂保护层放置菌玻璃塑料片粘贴面适宜菌孔材料(菌纱布)覆盖贴剂粘贴面避免贴剂粘贴起然置适宜体积含灭活剂(聚山梨酯80卵磷脂)稀释剂中力振荡少30min放置均质仪均质l0min方法制备成供试液
    79 具抑菌活性供试品
    供试品具抑菌活性时应消供试液抑菌活性法检查常方法:
    791 稀释法
    取规定量供试液加较量培养基中单位体积供试品含量减少具抑菌作板法测定菌数时1ml供试液等量分注皿控制菌检查时加增菌培养基量培养基稀释法适抑菌作强制剂
    792 离心沉淀法 方法供试液中沉淀物抑菌活性较强供试品供试液中溶颗粒沉淀取供试液先500
    r/min离心3min取清液进行试验方法细菌计数控制菌(细菌)检查
    793 薄膜滤法 见细菌霉菌酵母菌计数
    794 中法 含汞砷防腐剂供试品相应试剂钝化中抑菌活性制成供试液
    8 供试液释稀(10倍递增稀释法)
    81 取2~3支灭菌试分加入9ml
    pH70氯化钠-蛋白胨缓液灭菌稀释剂(时操作般:左手执试塞开倾斜右手执10ml吸吸量切勿酒精灯火焰正方操作免火焰供试液中菌细胞杀灭)加稀释剂试塞应立塞
     
    82 取1支1ml灭菌吸吸110均匀供试液1ml加入装9ml
    pH70氯化钠-蛋白胨缓液灭菌稀释剂试中混匀1100供试液类推根供试品污染程度稀释
    11031104等适宜稀释级递增l稀释级必须换支吸
    稀释时吸插入第1级稀释液低液面25cm反复吸吹约10次吸液时应先吸高吸部刻度少许然提起吸贴试壁调整液量刻度吸移第2级稀释壁液面处(勿接触液面)缓慢放出全部供试液(吸应黏附残留液体)然吸放入消毒液缸
    9 计数方法验证
    某供试品具抗菌活性建立测定方法原测定法检验条件发生改变时影响检验结果准确性必须供试品抑菌活性测定方法性进行验证试验菌回收率应逐进行验证
    91 验证菌株肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]金黄色葡萄球菌Staphylococcus
    aureus[CCMCC(B) 26003]枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501]白色念珠菌Candida
    albicans[CMCC(F) 98001]黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]
    菌液制备
    接种肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌新鲜培养物营养肉汤培养基中营养琼脂培养基培养18~24h接种白色念珠菌新鲜培养物改良马丁培养基中改良马丁琼脂培养基培养24~48h述培养物09%菌氯化钠溶液制成1ml含菌数50~100cfu菌悬液接种黑曲霉新鲜培养物改良马丁琼脂斜面培养基培养5~7天加入3~5ml含005%(ml/m1)聚山梨酯8009%菌氯化钠溶液孢子洗脱然适宜方法吸出孢子悬液菌试含005%(ml/ml)聚山梨酯8009%菌氯化钠溶液制成1ml含孢子数50~l00cfu孢子悬液
    菌悬液制备室温放置应2h保存2~8℃菌悬液24时黑曲霉菌孢子悬液保存2~8℃验证贮存期代应量新鲜孢子悬液
    92 验证方法 验证试验分4组少应进行3次独立行试验分计算供试品组组试验菌回收率
    921 供试品组
    取低稀释级供试液1ml供试液加入50~l00cfu试验菌菌落计数方法测定菌数皿法计数时取试验菌液供试液1ml分注入皿中立倾注琼脂培养基薄膜滤法计数时取供试液2ml滤洗液洗次洗液中加入试验菌
     
    922 活菌组 取述试验菌液测定加入试验菌菌数
    923 供试品组 取低稀释级供试液1ml菌落计数方法测定供试品底菌数
    924 稀释剂组
    考察供试液制备程中微生物影响程度相应稀释液代供试品加入试验菌终菌浓度1ml含50~l00cfu供试品组供试液制备方法菌落计数方法测定菌数
    93
    结果判定组菌回收率均应低70%供试品组菌回收率均低70%该供试液制备方法菌落计数法测定供试品细菌霉菌酵母菌数次试验中供试品组菌回收率低70%应建立新方法消供试品抑菌活性重新验证
    94 验证试验供试品细菌霉菌酵母菌计数时进行
    95 注意事项
    951 标准菌种传代次数超5代冷冻干燥原始菌种开启转种培养培养物第代
    952 黑曲霉菌菌液制备
    黑曲霉菌接种改良马丁琼脂斜面培养基20~25℃培养5~7天量孢子产生加入3~5ml含005%(ml/m1)聚山梨酯8009%菌氯化钠溶液菌玻棒接种环轻轻孢子洗脱然支l0ml菌球形毛细吸口菌棉花纱布包扎滤菌丝装置吸出孢子悬液菌试孢子悬液稀释毫升含50~l00cfu
    953 做试验菌回收率试验时加入菌量50~l00cfu宜加菌量薄膜法菌落拥挤计数加菌量少误差较
    954
    进行验证试验时没适宜方法消供试品中抑菌作导致微生物回收失败应采微生物生长更高稀释级供试液进行方法验证试验时更高稀释级供试液确认低高稀释级进行高稀释级供试液选择应根供试品应符合微生物限度标准菌数报告规供试品应符合微生物限度标准1克细菌数1000cfu高稀释级1103
    采允许高稀释级供试液进行验证试验存株株试验菌回收率达求应选择回收情况接求方法进行供试品检测某种产品某试验菌较强抑菌性采薄膜滤法回收率40%采培养基稀释法回收率30%应选择薄膜滤法进行该供试品检测情况生产单位研制单位应根原辅料微生物质量生产工艺产品特性进行产品风险评估保证检验方法性保证产品质量
    10 检查法
    101 皿法
    1011
    述进行10倍递增稀释时该稀释级吸吸取该稀释级供试液1ml直径90mm灭菌皿中高稀释级低稀释级吸液时1支吸吸供试液1ml灭菌皿中稀释级种培养基少注2~3皿(般左手执皿盖半开右手执吸)注皿时1ml供试液慢慢全部注入皿中残留液体防止反流吸尖端部
    1012 阴性
    级稀释液注皿完毕1支1ml吸吸取试验稀释剂(pH70氯化钠-蛋白胨缓液)1ml分注入4皿中中2作细菌数阴性2作霉菌酵母菌数阴性YPD琼脂测定酵母菌数时增加2皿作酵母菌数阴性
    1013 倾注培养基
    预先配制细菌计数营养琼脂培养基霉菌酵母菌计数玫瑰红钠琼脂培养基含蜂蜜王浆液体制剂玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌)YPD琼脂培养基(酵母菌)熔化冷约45℃时倾注述皿约15ml时针反时针方快速旋转皿供试液稀释液培养基混匀盖陶瓦盖半盖盖冷凝水移陶瓦盖盖皿盖置操作台凝旋转皿时切勿培养基溅皿边皿盖
    1014 培养
    细菌计数板倒置30~35℃培养箱中培养3天霉菌酵母菌计数板倒置23~28℃培养箱中培养5天必时延长7天逐日观察菌落生长情况点计菌落数
    1015 菌落计数
    10151
    般板置菌落计数器板背面直接肉眼点计透射光衬暗色背景仔细观察勿漏计细琼脂层皿边缘生长菌落注意细菌菌落霉菌菌落酵母菌菌落间菌落供试品颗粒培养基沉淀物气泡油滴等区必时放镜低倍显微镜直接观察挑取疑物涂片镜检
    10152
    供试品微生物制剂应效微生物菌落排点计细菌霉菌酵母菌数排方法需该制剂微生物品种定须观察菌落特征染色形态
    10153
    供试品稀释液常含溶性原料辅料培养基注皿产生沉淀物培养时形成数量形物难菌落相区利菌落计数操作时适宜稀释级供试液增加注皿(1~2皿)注皿培养放置冰箱(勿结冻)中计数菌落时作含TTC
    营养琼脂注皿培养该培养基生长菌落红色衬白色背景易点计细菌菌落区分形物软膏等非水溶性供试品营养琼脂注皿呈乳白色培养生长菌落易辨认点计防止种情况含TTC营养琼脂注皿TTC量应抑制微生物生长宜通常浓度0001%
    10154
    板22菌落重叠肉眼辨时22菌落计数板生长链状片状云雾状菌落菌落间明显界线条链片作菌落计链片出现性状链片状菌落辨菌落时应分计数生长蔓延较片状菌落花斑样菌落外缘干性状相似单菌落般宜作计数
    10155
    菌落生长呈蔓延趋势者细菌需24h霉菌需48h做初步点计(点计霉菌菌落时轻轻翻转板勿反复翻转否早期形成孢子散落板部位萌生新霉菌菌落导致计数误差)
    10156
    培养3天点计细菌培养5天点计霉菌时菌落极易辨认细菌计数延长培养时间5天霉菌酵母菌计数延长培养时间7天点计菌落数
    10157 异议供试品YPD培养基作酵母菌计数时培养1周点计菌落数
    10158 含蜂蜜王浆液体制剂玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数YPD琼脂培养基点计酵母菌数两者合计数
    10159
    特殊情况营养琼脂培养基长霉菌酵母菌玫瑰红钠琼脂培养基长细菌应分点计霉菌酵母菌细菌菌落数然营养琼脂培养基霉菌酵母菌数玫瑰红钠琼脂培养基细菌数玫瑰红钠琼脂培养基中霉菌酵母菌数营养琼脂培养基中细菌数进行较菌落数培养基中菌数计数结果
    1016 菌数报告规
    10161 宜选取细菌酵母菌均菌落数300cfu霉菌菌落数均数100cfu板计数作菌数报告(取两位效数字)
    10162
    仅1稀释级菌落数符合述规定该级均菌落数稀释倍数报告菌数22稀释剂菌落数符合述规定高均菌落数稀释倍数值值报告
    10163 稀释级板均菌落生长仅低稀释级板菌落生长均茵落数1时1低稀释倍数报告菌数
    菌数报告规示例见表2
    表2 菌数报告规示例
    函数报告规
    示例
    稀释级(供试液1ml<<IIII均菌落计数(cfu)
    菌数报告数
    (cfu<<gml10cm2)
    原液
    110(1)
    1102(2)
    1103(3)
    1

    64
    8
    2
    640
    2

    420
    64
    8
    6400
    3


    420
    64
    64000
    4

    0
    05
    0
    <100
    5


    0
    0
    <100
    6

    0
    0
    0
    <10
    7

    0
    0

    <1
     
    102 薄膜滤法
    1021
    薄膜滤法起富集微生物分离样品中微生物生长产生干扰素作效提高检查结果灵敏度性年微生物检查领域中日益广泛应种技术手段
    1022
    薄膜滤法采滤膜孔径应045um滤膜直径般50mm便计数减轻供试液堵塞滤膜情况便操作前提选直径更滤膜薄膜滤器采直径滤膜洗量应进行相应调整选择滤膜材质时应保证供试品溶剂影响微生物充分截留滤器滤膜前应采适宜方法灭菌时应保证滤膜滤前完整性
    1023
    水溶性供试液滤前先少量洗液滤润湿滤膜油类供试品滤膜滤器前应充分干燥发挥滤膜滤效率应注意保持供试品溶液洗液覆盖整滤膜表面供试液薄膜滤需洗液洗滤膜滤膜直径50mm滤膜计张滤膜次洗量超100ml总洗量超1000ml直径滤膜薄膜滤器膜面积例调整总原避免体积高流速洗造成滤膜微生物受损伤
    1024
    供试液中通滤膜颗粒存常常造成滤膜堵塞压力升高严重情况时发生滤装置炸裂造成安全事实验室污染发生压力滤膜开裂滤膜孔径变造成滤膜微生物滤截留失败实际操作中应考虑薄膜滤中压力控制设备安全性设置定安全压力限度例滤膜两侧压差50psi具体压力限度应根具体薄膜滤装置滤膜确定
    1025 采适方法供试液中颗粒(前提影响微生物回收率)适增加薄膜面积降低滤液体流速效降低滤膜两侧压力差
    1026
    取相张滤膜含1g1ml10cm2供试品供试液加适量稀释剂中混匀滤供试品1g1ml10cm2含菌数较时取适宜稀释级供试液1ml滤pH70菌氯化钠-蛋白胨缓液适宜洗液洗滤膜洗方法洗量见10231024洗取出滤膜菌面贴营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基板培养种培养基少制备张滤膜滤膜贴板时空隙气泡否影响微生物生长
    1027 贴膏剂宜采薄膜滤法进行细菌霉菌酵母菌计数
    1028 阴性试验 取试验稀释液1ml述薄膜滤法操作作阴性阴性菌生长
    1029 培养计数 培养条件计数方法皿法片滤膜菌落数应超100cfu
    10210 菌数报告规
    相1g1ml10cm2供试品菌落数报告菌数滤膜菌落生长<1报告菌数(张滤膜滤1g1ml10cm2供试品)<1低稀释倍数值报告菌数
    103 培养基稀释法
    取低稀释级供试液(原液110供试液供试液)2份份1ml分注入皿中(皿05ml02ml<02m1)1皿倾注营养琼脂培养基约15ml混匀凝固倒置培养计数
     
    份供试液加注板点计菌落lml菌落数2组数2份低稀释级供试液菌落数均值稀释倍数报告
    104 结果报告
    1041 菌落数100时实数报告
    1042 菌落数100时取两位效数字报告第三位数字修约规处理
    105 复试
    供试品细菌数霉菌酵母菌数中项次检验合格应批样品中机重新取2倍包装量供试品法作单项复试两次三次检验结果均值报告3次结果均值超该品种项规定判供试品符合规定否判供试品符合规定
    106 注意事项
    1061
    菌落计数测定计数单位(皿膜)适计数范围宜低通常计数单位应少25cfu低限度越误差越应根实际微生物限度标准污染程度确定适宜供试液稀释级数计数测定方法标准限度低操作需供试品稀释程度高取较体积供试液通薄膜滤法富集计数测定限度标准宜采供试液稀释级应宜采计数测定方法见表3
    表3 限度标准宜采供试液稀释级应宜采计数测定方法
    限度标准
    Cfu<<g
    ml10cm2
    般23供试液稀释级应宜采计数测定方法
    原液
    110(1)
    1102(2)
    1103(3)
    1104(4)
    <10


     
     
     
    10
    ●■

     
     
     
    100
    ●▲■
    ●■

     
     
    1000
     
    ●▲■
    ●■


    10000
     
    ●▲
    ●▲■
    ●■
    ●■
    100000
     
     
    ●▲
    ●▲
     
     
    ●:皿法(供试液体积:1mlㄍ皿)
    ▲:皿法(培养基稀释法供试液体积:<1mlㄍ皿)
    ■:薄膜滤法(供试液体积较灵活)
    1062 供试品检验全程必须符合菌技术求灭菌具时接触污染器物灭菌吸口吹吸
    1063 供试液制备加入检验培养基超1h否导致微生物繁殖死亡影响计数结果
    1064 供试液稀释注皿时应取均匀供试液免造成实验误差
    1065 避免细菌菌落蔓延生长宜采取列方法处理:
    10651 开盖干燥 已凝固琼脂板开盖倒置斜放净化工作台开机1~2h合盖放入培养箱培养
    10652 换陶瓦盖 已凝固琼脂板盖换新干热灭菌陶瓦盖
    10653 加TTC 倾注培养基前1000ml营养琼脂加入灭菌1%TTC溶液1ml(终浓度0001%)混匀倾注皿
    11 检验报告书写
    品中国药典2010年版微生物限度检查法标准检验结果符合符合规定
    表4 细菌霉菌酵母菌形态特征较(营养琼脂玫瑰红钠琼脂板)
    菌落形态
    细菌
    霉菌
    酵母菌
     

     
     
     

     

    差板
    出现针尖
    10mm菌落
    般较细菌落
    板生长菌落时

    数直径12mm
    板生长菌落时

    外观
    形态
    样突起

    圆形时蔓延生长
    定型
    培养基表面生长者圆形
    层圆形铁饼纺锤三角形
     
    色泽
    白灰白色
    淡褐淡黄淡红
    色菌落正单面颜色
    菌落灰白菌落形成包子
    颜色样菌落正反面颜色

    乳白粉红见板
    色调较单
    透明度
    透明透明
    菌落半透明明显遮光性
    透明胶差
     
    边缘
    整齐整齐放射
    线树枝状锯齿状
    卷发状般倍镜
    般见边缘
    菌丝体构成呈放射状
    整齐低倍见球状卵圆状
    假菌丝状细胞细密排列
    气味
    般臭味
    霉味
    带酒香味
    培养
    基结合
    结合
    结合较牢固易挑起
    结合易挑起
    生长
    速度
    般快
    较慢
    较快


    形态
    球杆状细均
    高倍镜油镜见
    形态
    菌丝体相互交织成熟霉菌
    产孢组织孢子
    数圆卵圆形常芽体
    相连
    排列
    单分散定排
    列方式
    丝状交织
    单分散
     
    二控制菌检查
    l 简述
    控制菌检查检查某特定微生物(控制菌致病菌)规定次检出结果准复试
    控制菌检查次性报告实验结果应注意方法效性确证(方法验证阳性)实验程保障结果确证提高检验结果性避免漏检造成假阴性结果避免实验室污染造成假阳性结果
    控制菌检查中涉实验室监控菌株分离鉴定样品阳性菌株分离分析方法验证试验中阳性菌操作等应专门阳性菌实验室进行规定外阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准阳性菌实验室应配备生物安全柜阳性菌操作供试品检验洁净实验室进行
    2 方法验证
    建立供试品控制菌检查法原检查法检验条件发生改变影响检验结果准确性时应供试品抑菌活性检查法性进行验证验证时.供试品微生物限度项规定(药途径)选择相应菌株供试液制备控制菌检查法规定方法进行
     
    21 仪器设备具
    见控制菌检查项
    22 试液指示液
    见控制菌检查项
    23 培养基
    见控制菌检查项
    24 方法验证标准菌株
    应根具体品种项目标控制菌选择相应验证标准菌株常目标控制菌标准菌株:
    肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]
    金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]
    乙型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]
    铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]
    生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]
    白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]
    菌液制备取肠埃希菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌培养物少许接种l0ml营养肉汤培养基置30~35℃培养18~24h取均匀培养物1ml09%菌氯化钠溶液稀释成1ml含菌10~100cfu菌悬液菌数做试验时营养琼脂注皿板涂布培养计数确定生孢梭菌接种12ml硫乙醇酸盐流体培养基中置30~35℃培养18~24h09%菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu菌液
    25 供试液制备(见细菌霉菌酵母菌计数)
    26 验证方法
    261
    试验组取规定量供试液10~100cfu试验菌加入增菌培养基中相应控制菌检查法进行检查采薄膜滤法时试验菌应加次洗液中洗取出滤膜接增菌培养基中
    262 阳性 取10~100cfu试验菌加入增菌培养基中相应控制菌检查法进行检查
    263 阴性取相应稀释液代供试液相应控制菌检查法进行检查
    27 结果判定
    阳性组应检出试验菌阴性组应菌生长试验组检出试验菌供试液制备法控制菌检查法进行供试品该控制菌检查试验组未检出试验菌应建立新方法消供试品抑菌活性重新验证
     
    验证试验供试品控制菌检查时进行
    ()肠埃希菌
    1 简述
    肠埃希菌(Escherichia coli)肠杆菌肠杆菌科埃希菌属模式种埃希菌属肠埃希菌外新发现非脱羧埃希菌等5种肠埃希菌温血动物肠道栖居菌粪便排出体外药品中检出肠埃希菌表明该样品受温血动物粪便污染污染肠道病原体肠埃希菌普通肠埃希菌外尚致病性肠埃希菌引起婴幼成爆发性腹泻保汪体健康口服药品必须检查肠埃希菌
    4甲基伞形酮葡糖苷酸(4MethylumbelliferylβDglucuronideMUG)靛基质(indole)试验检查肠埃希菌项新技术检验步骤:增菌培养转种MUG蛋白胨培养基培养数情况需混合菌中分离单菌MUGIndole试验阳性阴性报告结果
    原理:利目标菌限定酶作底物水解产物产生颜色荧光反应作指示系统鉴定目标菌
    实验证明96%肠埃希菌含β葡糖苷酸酶(βglucuronidaseGUD)约10%沙门菌属菌种含酶MUGGUD水解产生荧光荧光反应敏感度较颜色反应强千万倍易观察没观性MUG鉴定肠埃希菌已广泛应床食品饮水污水等检测单MUG鉴肠埃希菌漏检率达6%鉴98%肠埃希菌基靛基质试验阳性MUG靛基质试验结合单MUG提高肠埃希菌检出率
    MUGIndole试验反应致时需供试液增菌培养物EMB琼脂板分离培养革兰染色镜检生化试验鉴该法理肠埃希菌检出率达98%
    仅IMViC生化试验鉴肠埃希菌属中肠埃希菌专属性强
    2 仪器设备具(参细菌霉菌酵母菌计数)
    3 试液指示液
    31 09%菌氯化钠溶液(附件二31)
    32 菌磷酸盐缓溶液(pH72)(附件二33)
    33 菌氨基苯甲酸溶液(附件二22)
    34 菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二32)
    35 靛基质试液(附件二217)
    36 甲基红试液(附件二42)
    37 VP试液(附件二211213)
    38 革兰染色液(附件二24210216)
    39 中性红指示液(附件二41)
    310 亚甲蓝指示液(附件二43)
    311 溴麝香草酚蓝指示液(附件二46)
    312 酸性品红指示液(附件二47)
    313 曙红钠指示液(附件二49)
     
    4 培养基
    41 营养肉汤(附件二51)
    42 营养琼脂(附件二52)
    43 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二56)
    44 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(附件二57)
    45 乳糖发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基5%乳糖培养基(附件二521522)
    46 蛋白胨水培养基(附件二518)
    47 磷酸盐葡萄糖胨水培养基(附件二519)
    48 枸橼酸盐培养基(附件二520)
    49 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附件二58)
    410 麦康凯琼脂(附件二59)
     
    5 准备
    51 菌液(见方法验证)
    52 供试品检验量(见细菌霉菌酵母菌计数53)
    53 供试液制备(见细菌霉菌酵母菌计数)
     
    6 操作步骤
    61 检验程序
    阳性试验
    供试品进行控制菌检查时应做阳性试验阳性试验加菌量10~100cfu供试品增菌培养基量检查供试品控制菌检查阳性试验应检出相应控制菌
    阴性试验 取稀释剂10m1加入100ml(200 m1)相应控制菌检查增菌培养基中培养应菌生长
    62 增菌培养
    取胆盐乳糖(BL)培养基3瓶瓶100ml2瓶分加入规定量供试液(相供试品1glml10cm2)中1瓶加入菌10~100作阳性第3瓶加入供试液等量稀释剂作阴性培养18~24h必时延48h阴性应菌生长
    取述培养物02ml接种含5ml
    MUG培养基试培养524h366nm紫外光观察时未接种MUG培养基作底紫外光培养物呈现蓝白色荧光MUG阳性呈现荧光MUG阴性观察培养壁加入数滴靛基质试液液面呈玫瑰红色靛基质阳性呈试剂色靛基质阴性底MUG靛基质试验应阴性MUG阳性靛基质阳性判供试品检出肠埃希菌MUG阴性靛基质阴性判供试品未检出肠埃希菌
    63
    分离培养呈现MUG阳性靛基质阴性MUG阴性靛基质阳性时应述供试品BL增菌培养液轻轻摇动接种环沾取1~2环培养液划线EMB麦康凯琼脂板培养18~24h板菌落生长生长菌落表1列菌落形态特征符判供试品未检出肠埃希菌
    表1 肠埃希菌菌落形态特征
    培养基
    菌落形态
    署红亚甲蓝琼脂
    呈紫黑色浅紫色蓝紫色粉红色菌落中心呈深紫色没明显暗
    色中心圆形稍突起边缘整齐表面光滑湿润常金属**
    麦康凯琼脂
    鲜桃红色微红色菌落中心呈深桃红色圆形扁边缘整齐表
    面光滑湿润
     
    **性板呈典型菌落生长时EMB麦康凯琼脂板生长菌落表1列菌落形态特征相符疑似者应挑取疑菌落进行分离纯化染色镜检IMViC试验确认否肠埃希菌
    规范操作药典求补充
    64 纯培养
    EMB麦康凯琼脂板生长菌落表1列特征相符疑似者接种针轻轻接触单疑似菌落表面中心沾取培养物应挑选2~3疑似菌落分接种营养琼脂斜面培养18~24h作检查
    板单疑菌落疑菌团(紫黑色金属**)应沾取疑菌团培养物少许重新取增菌培养液划线接种EMB琼脂板培养18~24h挑选单疑似菌落纯培养作检查
    65 革兰染色镜检
    651 接种环沾取菌水洁净载玻片取述疑似菌落营养琼脂斜面新鲜培养物少许制成均匀涂片然微温通火焰2~3次干燥固定
    652 滴加结晶紫染液染色1min水洗
    653 滴加碘液媒染1min水洗滤纸吸干余水
    654 滴加95乙醇脱色20~30s流出液色水洗
    655 滴加沙黄染液复染1min干镜检
    656 染色结果
    革兰阳性菌呈蓝紫色革兰阴性菌呈红色
    肠埃希菌革兰阴性短杆菌球杆菌状杆菌状
    657 注意事项
    6571 玻片必须洁净划痕涂片菌量宜少菌液浓否菌细胞成堆连成片染色反应难判断利菌细胞形态观察
    菌液浓须取洁净载玻片进步稀释
    6572 培养物菌龄16~24h宜培养时间长革兰阳性菌易染成红色
    6573 脱色关键脱色时间足菌细胞易染成阳性脱色时间长菌细胞易染成阴性
    7 生化试验
    71 乳糖发酵试验
    取述斜面培养物接种乳糖发酵培养24~48h观察产酸(指示剂酸性品红者红色指示剂溴麝香草酚蓝者黄色)产气(倒气泡气泡产气)
    避免迟缓发酵乳糖产生假阴性接种5%乳糖发酵绝数迟缓发酵乳糖细菌24h出现阳性适延长培养时间
    72 靛基质试验(Ⅰ)
    取述斜面培养物接种蛋白胨水培养基培养24~48h壁加入靛基质试液数滴轻轻摇动试液面呈玫瑰红色阳性呈试剂色阴性98%肠埃希菌靛基质试验阳性般24h出现阳性结果菌操作先中取出12ml培养液进行检查靛基质阴性余蛋白胨水培养物培养24h作靛基质试验
    73 甲基红试验(M)
    取述斜面培养物接种磷酸盐葡萄糖胨水培养基中培养48±2h培养液中加入甲基红指示液2~3滴(约ml培养液加指示液1滴)轻微摇动立观察呈鲜红色橘红色阳性呈黄色阴性
    74 乙酰甲基甲醇生成试验(VP)
    取述斜面培养物接种磷酸盐葡萄糖胨水培养基中培养48±2h2ml培养液中加入α萘酚乙醇试液1ml混匀加40%氢氧化钾试液04ml充分振摇4h(通常30min)出现红色应判阳性红色反应阴性
    75 枸橼酸盐利试验(C)
    取述斜面培养物接种枸橼酸盐培养基斜面培养2~4天培养基斜面菌苔生长培养基绿色变蓝色时阳性培养基颜色改变菌生长阴性
    8 结果判断
    81
    阴性试验呈阴性阳性试验MUG呈阳性供试品MUG阳性靛基质阳性报告1g1ml供试品检出肠埃希菌MUG阴性靛基质阴性报告1g1ml供试品未检出肠埃希菌
    82
    MUG阳性靛基质阴性IMViC试验-+革兰阴性杆菌报告1g1ml供试品检出肠埃希菌MUG阴性靛基质阳性IMViC试验++革兰阴性杆菌报告1g1ml供试品检出肠埃希菌
    83 供试品培养物检查符合82二项中项报告1g1ml供试品未检出肠埃希菌
    84 阴性菌生长阳性未生长生长菌落肠埃希菌做出检验报告
    9 注意事项
    91
    MUG法必混合菌中分离单菌落肠埃希菌外尚部分志贺菌属沙门菌属菌株少数革兰阳性球菌杆菌芽孢菌
    MUG阳性MUG培养基成分中增加氧胆酸钠量排革兰阳性菌干扰胆盐乳糖培养基中志贺菌沙门菌较难生长
    92
    配制MUG培养基时务必校正pH值灭菌pH74否pH值偏高MUG分解身显荧光分装MUG培养基试应挑选试蛋白胨显荧光
    93 培养时间
    供试品培养液接种MUG培养基中般培养5h24h观察否产生荧光荧光微弱准确判断时延长培养48h观察结果肠埃希菌菌株间GUD活性完全相底物底物浓度反应差异培养基中选择子影响培养时问温度pH值改变量竞争菌样品身物质成分干扰等结果判断影响
    94 结果观察
    取供试品MUG试验阳性阴性时366nm紫外光灯观察阳性应较强蓝白色荧光阴性荧光供试品MUG否荧光应仔细观察较调换位置(阴性居中)适倾斜试阳性荧光强烈影响供试品阴性观察时移阳性
    95
    药品中污染肠埃希菌易受生产工艺药物影响曙红亚甲蓝琼脂麦康凯琼脂板菌落形态特征时变化挑取疑菌落验观性较务必挑选2~3菌落分做IMViC试验鉴挑选菌落越检出阳性菌机率越高仅挑选菌落做IMViC试验鉴.易漏检
    96
    IMViC试验中灭菌接种针沾取菌苔首先接种枸橼酸盐琼脂斜面然接种蛋白胨水培养基磷酸盐葡萄糖胨水培养基中切勿培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面免产生假阳性结果
    根试验资料发现某菌培养3天构橼酸盐利试验产生阳性仅培养2天够枸橼酸盐利试验培养时间延长4天
    97 IMViC试验判断肠埃希菌属中肠埃希菌含混IMViC试验++者肠埃希菌外非活跃肠埃希菌(Ecoli
    jnactive)弗格森埃希菌(Efergusonii)赫尔曼埃希菌(Ehermanii)IMViC试验-+者肠埃希菌外非活跃肠埃希菌(Ecoli
    inactive)伤口埃希菌(Evulneris)蟑螂埃希菌(Eblattae)
    98
    阳性试验检查供试品否抑菌作培养条件否适宜阳性菌液制备计数加入含供试品培养基中等操作检测供试品洁净实验室净化台进行必须单独隔离间净化台操作免污染供试品操作环境
    99 类供试品中检测肠埃希菌控制菌次检出结果准抽样复验检出肠埃希菌控制菌培养物须保留1月备查
    (二)肠菌群
    1 简述
    肠菌群(Coliform)指37℃生长时发酵乳糖24时产酸产气革兰阴性芽孢杆菌符合述定义细菌肠埃希菌属(Escherichia)数菌外包括肠杆菌科肠杆菌属(Enterobacter)枸橼酸菌属(Citrobacter)克雷伯菌属(Klebsiella)数菌肠菌群包括正常畜肠道需氧数革兰阴性杆菌肠菌群作卫生指示菌控制肠埃希菌具广泛卫生学意义检查方法简便国际肠菌群作药品食品饮水等卫生指示菌卫生质量求更严格
    肠菌群检查通增菌分离革兰染色镜检确证试验等步骤
    2 仪器设备具(见肠埃希菌检查法)
    3 试液指示液(见肠埃希茵检查法)
    4 培养基
    41 乳糖发酵培养基(附件二521)
    42 乳糖胆盐发酵培养基(附件二522)
    43 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附录58)
    44 麦康凯琼脂(附录59)
    5 菌液(肠埃希菌控制菌方法验证24)
    6 操作步骤
    61 操作程序
    62 增菌培养
    取乳糖胆盐发酵3支分加入110稀释供试液1ml(含供试品01g01m1)1100稀释供试液1ml(含供试品001g001ml)11000稀释供试液1ml(含供试品001g001ml)取1支乳糖胆盐发酵加入稀释剂1ml作阴性均培养18~24h观察结果
    加供试液乳糖胆盐发酵菌生长菌生长产酸产气判该未检出肠菌群乳糖胆盐发酵产酸产气应进步分离培养
    63 分离培养 述产酸产气发酵中培养物分划线接种曙红亚甲蓝琼脂培养基麦康凯琼脂培养基板培养18~24h
    肠菌群菌落曙红亚甲蓝琼脂培养基板呈紫黑色紫红色圆形稍凸起边缘整齐表面光滑湿润麦康凯琼脂培养基板呈鲜桃红色粉红色圆形扁边缘整齐表面光滑湿润板菌落生长生长菌落述菌落特征符非革兰阴性芽孢杆菌判该未检出肠菌群板生长疑似菌落革兰阴性芽孢杆菌应进行确证试验
    64 确证试验
    述分离板挑选4~5疑似菌落分接种乳糖发酵中培养24~48时产酸产气判该乳糖胆盐发酵检出肠菌群否判未检出肠菌群
    65 结果判断 根肠菌群检出数表2报告1g1ml供试品中肠菌群数
    表2 肠菌群MPN(Most probable number)表
    供试品量检出结果
    肠菌群数N
    (    <<gml   )
    10g10ml
    01g01ml
    001g001ml
       +
       +
        +
    >102
       +
       +
      
    10   +
      
       
    1  
      
       
    <1
       注:+ 检出肠菌群 未检出肠菌群
    7 注意事项
    71 加供试液乳糖胆盐发酵药渣颜色较深沉淀物较干扰结果观察应仔细观察倒底部试壁培养液表面气泡针尖气泡产气
    72 乳糖胆盐发酵培养基倒30mm×3mm(径)否倒药渣遮挡便观察结果
    73 加供试液乳糖胆盐发酵培养倒产气少均应做分离培养革兰染色镜检产气太少延长培养时间
    75 挑选曙红亚甲蓝琼脂培养基麦康凯琼脂培养基板肠菌群疑菌落做乳糖发酵确证试验挑疑菌落越提高肠菌群检出率
    (三)沙门菌
    1 简述
    沙门菌属肠杆菌科重致病菌Bergey系统细菌学手册第卷(1984)沙门菌分5亚属2003年出版第八版床微生物手册沙门菌属分成两菌种肠炎沙门菌乍沙门菌中肠炎沙门菌分6亚属包括常见伤寒甲型副伤寒乙型副伤寒丙型副伤寒鼠伤寒猪霍乱等沙门菌时已发现2501血清型O抗原抗血清AE群包含沙门菌分离株95%沙门菌AFO价血清进行沙门菌初筛试验药品中沙门菌鉴定沙门菌属准10g(10m1)药品中否检出沙门菌作出检验报告
    沙门菌血清型繁血清型生化血清学特性密切相关相采种增菌培养基两种分离培养基涵盖沙门菌适增菌分离条件外药品生产程中常受加热干燥等加工步骤影响药品中污染沙门菌受损伤呈休眠状态须增菌培养前先进行预增菌然进行增菌分离三糖铁琼脂初步鉴生化试验血清学试验等步骤
    2 仪器设备具(见肠埃希菌检查法2)
    3 试液指示液(参见肠埃希菌检查法3)
    31 菌脲试液(附件二25)
    32 酚磺酞指示液(附件二44)
    33 亮绿试液(附件二29)
    34 氰化钾试液(附件二214)
    35 溴甲酚紫指示液(附件二45)
    36 革兰染色液(附件二24210216)
    37 沙门菌属A~F0价血清(0价1)
    4 培养基
    41 营养琼脂培养基(附件二52)
    42 营养肉汤培养基(附件二51)
    43 半固体营养琼脂培养基(附件二53)
    44 曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)(附件二58)
    45 麦康凯琼脂培养基(MacC)(附件二59)
    46 四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)(附件二511)
    47 三糖铁琼脂培养基(TSI)(附件二510)
    48 胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)(附件二513)
    49 沙门菌扁志贺菌属琼脂培养基(SS)(附件二512)
    410 蛋白胨水培养基(附件二518)
    411 脲(尿素)琼脂培养基(附件二523)
    412 氰化钾培养基(附件二524)
    413 赖氨酸脱羧酶培养基(附件二525)
    5 菌液
    取乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)
    50094]培养物少许接种10ml营养肉汤培养基30~35℃培养18~24h09%菌氯化钠溶液10倍递增稀释浓度相10~100cfuㄍml作阳性菌液菌液浓度板菌落计数法测
    6 操作方法
    61 准备工作:[见细菌霉菌(酵母菌)计数6 ]
    62 增菌培养
    621
    预增菌取营养肉汤培养基3份份200ml1份加入10g者10ml供试品混匀1份加入供试品阳性菌10~100cfu混匀1份加入稀释剂10ml作阴性30~35℃培养18~24h观察摇动阴性瓶应清亮透明菌生长
    622 增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶阳性瓶分吸取1ml接种1含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基试中培养18~24h
    63
     
    分离培养轻微摇动供试品增菌培养瓶阳性瓶分接种环沾取1~2环培养液接种胆盐硫乳琼脂(DHL)沙门菌志贺菌琼脂(SS)板曙红亚甲蓝(EMB)琼脂麦康凯琼脂板1倒置培养24~48h必时延长40~48h检查板疑似沙门菌菌落沙门菌述板菌落形态特征见表
    表3 沙门菌菌落特征
         
     
     
     
     
     
     

     
     
     
     
     
    沙门菌发酵乳糖蔗糖产酸菌落着色般色半透明数沙门菌产生H2S菌落中心呈现黑色甚全黑色DHL琼脂板较明显SS琼脂板H2S特征时明显沙门菌属亚属III数菌株发酵乳糖述板乳糖发酵菌落呈现粉红紫色产生H2SH2S指示系统板出现黑色中心述培养基非沙门菌属细菌呈现类似沙门菌菌落形态须进步鉴药物影响非典型菌株存沙门菌菌落呈现非典型形态色泽变深菌落粗糙等应注意辨
     
    64 初步鉴试验
    供试品分离板挑取2~3疑似菌落(菌落形态特征表3列形态特征相符疑似)分接种三糖铁琼脂斜面接种时应接种针轻轻接触单菌落中心部位沾取培养物划线三糖铁琼脂斜面(者克氏双糖铁琼脂斜面)穿刺底层先穿刺底层划线斜面培养18~24h观察结果
    疑似沙门菌三糖铁琼脂斜面反应:①斜面红色(产碱)底层黑色(产H2S)显示黄色(产酸)②斜面红色底层黄色③斜面黄色底层黑色显示黄色数沙门菌三糖铁琼脂产生气体底层琼脂出现气泡琼脂断裂产生气体菌种三糖铁琼脂斜面黄色时底层黑色斜面未见红色底层未见黄色斜面底层均红色者排沙门菌
    疑似沙门菌三糖铁琼脂营养琼脂斜面培养物作生化试验血清凝集试验革兰染色镜检沙门菌应革兰阴性杆菌
    65 生化试验
    651 靛基质试验 接种环沾取少许培养物接种蛋白胨水培养基中肠杆菌检查法靛基质试验项操作判断结果沙门菌应阴性反应
    652 脲酶试验 接种环沾取少许培养物划线接种脲琼脂斜面培养24h观察结果斜面变红色阳性反应沙门菌属阴性反应
    653 氰化钾试验
    培养物先接种营养肉汤培养基中培养20~24h接种环沾取培养液1环接种氰化钾培养基取环培养液接种含氰化钾样培养基作接种橡胶塞塞紧培养24~48h观察结果菌生长(混浊)试验菌生长阳性反应菌生长(混浊)试验菌生长(清亮)阴性反应沙门菌应阴性反应
    试验应十分注意密封口夏天分装培养基宜冰浴中进行防止氰化钾分解产生氢氰酸逸出致培养基氰化钾浓度降低抑制细菌生长造成假阳性
    氰化钾剧毒品操作时须谨慎切勿口吸液培养基加数粒硫酸亚铁20%氢氧化钾05ml毒然灭菌洗涤
    654
    赖氨酸脱羧酶试验接种环沾取少许培养物接种赖氨酸脱羧酶培养基中时接种支含赖氨酸样培养基作培养24~48h观察结果黄色(产酸)试验呈紫色阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)试验黄色阴性反应沙门菌应阳性反应
     
    655
    动力试验接种针沾取培养物穿刺接种半固体营养琼脂中培养24h观察结果动力细菌穿刺线外培养基扩散生长培养基呈混浊现象动力细菌仅穿刺线生长外扩散培养基呈清晰透明状动力表现培养物应室温保留2~3天行观察沙门菌鸡雏沙门菌动力变种外均具周身鞭毛运动动力试验阳性沙门菌生化反应初步鉴见表
    表4 沙门菌关细菌三糖铁琼脂初步生化试验鉴
          序号
          靛基质 脲酶 氰化钾 赖氨酸脱羧酶 判定菌属
          斜面 底层 产气 硫化氢
          11 - + +/- +/- - - - + 沙门菌属
          12 +/- + + + - - - + 沙门菌属III
          2 - + +/- + + - - + 缓慢爱德华菌属
          3 +/- - +/- +/- -/+ -/+ +/- - 弗劳柠檬酸杆菌
          41 - + +S + - + + - 奇异变形杆菌
          42 - + +/-S + + + + - 普通变形杆菌
          5 +/- + +/- - +/- - - +/- 肠埃希菌
          6 - + - - -/+ - - - 志贺菌属
          71 + + + - - +/- + - 阴沟肠杆菌
          72 + + + - - +/- + + 肺炎克雷伯菌产气肠杆菌
          8 - + +S/- - + +/- + - 普罗菲登斯菌属摩根菌属
          9 - + +/- - - -/+ + + 蜂房哈夫尼亚菌黏质沙雷菌
    针三糖铁琼脂反应+产酸(黄色)阳性阳性率>90%-产碱(红色)阴性阴性率>90%+/-数阳性少数阴性+S产生少量气体生化试验结果参见章65容+阳性阳性率>90%-阴性阴性率>90%+/-数阳性少数阴性-/+数阴性少数阳性(表晓青卫生防疫细菌检验参考第八版美国床微生物手册反应序号1典型反应外脲酶氰化钾试验赖氨酸脱羧酶试验三项中项异常反应序号2仅靛基质阳性结合血清学凝集试验加做部分生化试验判定否沙门菌情况排沙门菌
    66 血清学凝集试验
    661
    准备1片洁净灭菌载玻片中央端直径3mm接种环沾取沙门菌属0价1血清2~3环制成玻片横径相垂直条形涂抹长约15cm宽约05cm端生理盐水代血清法操作作阴性
    662 接种环分挑取三糖铁琼脂斜面营养琼脂斜面新鲜培养物少许血清盐水中混匀菌量适勿浓
    663
    玻片前倾斜数次暗色背景衬底良明条件进行观察阴性出现凝集现象试验组程度凝集现象阳性反应阳性反应通常3min发生时血清效价低反应迟缓时应玻片置培养皿放湿棉球旁边盖皿盖约20min观察结果果然没出现凝集应取斜面培养物置含少量生理盐水试中制成浓菌悬液100℃水浴中保温30min存Vi抗原冷做凝集试验出现凝集判阳性反应出现凝集现象阴性反应
    664 试验出现凝集现象非特异反应须该菌株培养物进行处理作凝集试验
    7 结果判断
    71
    供试品培养物革兰阴性杆菌三糖铁琼脂反应生化反应符合沙门菌属反应沙门菌属0价1血清凝集试验阳性反应(含检培养物l00℃30min处理凝集试验阳性反应)报告10g10ml供试品检出沙门菌
    72
    供试品培养物三糖铁琼脂反应生化反应符合沙门菌属反应沙门菌属0价1血清凝集试验阴性反应(含检培养物100℃30min处理凝集试验阴性反应)报告1g1ml供试品未检出沙门菌
    73 供试品培养物出现列情况应继续鉴定保留菌种送交关单位进步鉴定作报告
    731 供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应沙门菌属0价1血清凝集试验阴性反应
    732 供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应沙门菌属0价1血清凝集反应呈阳性反应
    74
    已检出沙门菌供试品分离菌种条件者应进步作菌型鉴定根检出菌特性推断菌型增加生化试验项目沙门菌单子血清OH凝集试验进行鉴定
    8 注意事项
    81 试验培养基需质量鉴定已知典型反应菌株(乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)
    50094]进行测试灵敏度特征性反应应符合求培养基需规定条件保存规定时间分离板前应置30~35℃温箱倒置孵育1~2h表面温暖湿润利分离沙门菌
    82
    供试品进行测试时需做阳性菌阴性阴性应菌生长阳性应显示阳性结果否检验结果效进行阳性菌试验时应供试品检验分开操作避免污染特接种环沾取菌液进行接种分离时避免动作形成气溶胶污染供试品检验具操作环境
    83
    保证试验方法性分离板疑似菌落应选取菌落时进行试验挑取菌落时分离板菌落密集部位挑取疑菌落应菌落分布稀疏部位挑选
    84
    生化试验血清学试验鉴定培养物必须纯培养物否正确结果遇血清学凝集试验阳性生化试验符合时应首先检查培养物纯度已污染培养物应丢弃污染菌掩盖沙门菌应污染培养物重新分离仔细选取单菌落进行试验
    85
    生化反应均需规定试验求进行观察三糖铁琼脂斜面反应时间应24士2h时间短长出现错误结果判断氰化钾试验试口应密塞否氰化钾浓度降低致抑菌作降产生错误判**果
    86
    血清凝集试验影响素甚电解质pH温度关外须特注意抗原抗体量例恰二者浓度适时凝集反应方明显见法试验价血清凝集力相较弱试验菌液量切测试前应已知阳性菌测试掌握适宜菌液浓度
    87
    沙门菌肠道重致病菌操作时应特注意防止分离检菌阳性菌操作环境试验污染增菌分离生化试验培养基血清学凝集试验染色镜检玻片等均需灭菌方洗涤
    (四)铜绿假单胞菌
    1 简述
    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)称绿脓杆菌假单胞菌属菌种广泛分布土壤水空气动物皮肤肠道呼吸道均存通环境生产环节污染药品菌常见化脓性感染菌烧伤烫伤眼科外科疾患中常引起继发感染菌许抗菌药物具天然耐药性增加治疗难度国外药典均铜绿假单胞菌检查列检查项目铜绿假单胞菌增菌分离纯培养革兰染色镜检生化试验等步骤进行检验
    2 仪器设备具(见肠埃希茵检验法2)
    3 试液指示液
    31 09菌氯化钠溶液磷酸盐缓液(附件二3133)
    32 1二盐酸二甲基苯二胺试液(附件二21)
    33 盐酸试液(附件二212)
    34 三氯甲烷(附件二157)
    4 培养基
    41 营养肉汤培养基(附件二51)
    42 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二56)
    43 营养琼脂培养基(附件二52)
    44 溴代十六烷基三甲胺(附件二514)
    45 绿脓菌素测定培养基(PDP琼脂)(附件二526)
    46 明胶培养基(附件二527)
    47 硝酸盐胨水培养基(附件二528)
    5 菌液
    铜绿假单胞菌[CMCC(B)
    10104]营养琼脂斜面培养物少许接种10ml营养肉汤培养基30~35℃培养18~24h09%菌氯化钠溶液10倍递增稀释浓度相10~100cfu/ml作阳性菌液菌液浓度做阳性实验时板菌落计数法测
    6 操作方法
    61 供试品取样量[见细菌霉菌(酵母菌)计数6]
    62 供试液制备[见细菌霉菌(酵母菌)计数7]
    63 增菌培养
    取胆盐乳糖培养基3份份100ml1份加入110供试液10ml(相供试品1g1ml)1份加入供试液阳性菌l份加入供试液等量稀释剂作阴性30~35℃培养18~24h(必时延48h)阴性菌应菌生长
     
    64 分离培养
    轻轻摇动述增菌培养液接种环取1~2环培养液(菌膜应挑取)划线接种溴代十六烷基三甲胺琼脂板30~35℃培养18~24h铜绿假单胞菌该培养基板典型菌落扁圆形定形边缘齐光滑湿润呈灰白色周边略呈扩散现象菌落相邻处常融合现象菌落周围常水溶性蓝绿色素扩散培养基显蓝绿色产色素菌株菌落粗糙型黏液型等应注意挑选
    65 纯培养
    供试品分离板生长64述典型菌落呈疑似菌落时接种针轻轻接触单菌落表面中心沾取培养物应挑取2~3疑似菌落分接种营养琼脂斜面培养作检查
    66 革兰染色镜检
    661 革兰染色(见肠埃希菌检查65)
    662 镜检
    铜绿假单胞菌革兰阴性芽孢杆菌单成成短链排列
    67 生化试验
    铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]做生化试验阳性株
    671 氧化酶试验
    取块白色洁净滤纸置皿菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许涂滤纸滴加1滴新配制1%二盐酸二甲基苯二胺试液30s纸片培养物出现粉红色逐渐变紫红色氧化酶试验阳性反应培养物变色仅显粉色阴性反应
    试验应注意:
    (1)试验菌落(苔)必须新鲜陈旧培养物反应结果
    (2)试验避免铁镍等金属接触普通接种针(环)(白金材料外)挑取菌(苔)否易出现假阳性宜玻璃棒木棒
    (3)试剂宜新鲜配制放置久二盐酸二甲基苯二胺氧化变色
    (4)反应需氧条件进行勿滴加试剂免浸泡培养物空气隔绝造成假阴性反应
    (5)麦康凯SS培养基等含糖培养基菌落适做氧化酶试验糖分解产酸抑制氧化酶活性
    672 绿脓菌素试验
    取营养琼脂斜面培养物接种绿脓菌素测定培养基(PDP)斜面30~35℃培养24h观察斜面色素色素试加三氯甲烷3~5ml菌玻棒搅碎培养基充分振摇培养物中色素完全萃取三氯甲烷静置片刻三氯甲烷分层吸三氯甲烷移试中加入盐酸试液(1mol/L)约1ml振摇静置片刻盐酸液层出现粉红色阳性反应粉红色出现阴性反应试验未接种PDP琼脂培养基斜面作阴性阴性试验应呈阴性培养基斜面色素产生应室温培养l~2天法试验次检验绿脓菌素试验阴性者应继续试验
    673 硝酸盐原产气试验
    接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种硝酸盐胨水培养基中置30~35℃培养24h观察结果果培养基倒中气体产生阳性反应表明该培养物原硝酸盐亚硝酸盐分解产生氮气倒气泡者阴性反应
    674 42℃生长试验
    接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物09%菌氯化钠溶液中制成菌悬液然菌悬液划线接种营养琼脂斜面立置41℃士1℃恒温水浴箱务整斜面浸没水浴中培养24~48h斜面菌苔生长者阳性反应菌苔生长阴性反应
    675 明胶液化试验
    接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许穿刺接种明胶培养基中穿刺深度应接培养基底部30~35℃培养24h取出放入0~4℃冰箱10~30min培养基呈溶液状明胶液化试验阳性反应明胶呈凝固状阴性反应
    试验应注意:
    (1)试验接种前培养基应固态否需培养基置冰箱凝固穿刺接种
    (2)试验应时设未接种细菌阴性试验时培养观察结果
    7 结果报告
    71 供试品培养物证实革兰阴性杆菌氧化酶试验绿脓菌素试验皆阳性者报告1g1ml供试品检出铜绿假单胞菌
    72
    供试品培养物氧化酶试验阳性镜检革兰阴性杆菌培养物绿脓菌素试验阴性时硝酸盐原产气试验42℃生长试验明胶液化试验皆阳性时报告1g1ml供试品检出铜绿假单胞菌
    73 7172结果符时报告1g1ml供试品未检出铜绿假单胞茵
    8 注意事项
    81
    铜绿假单胞菌污染药品生产工艺药物影响溴代十六烷基三甲胺板菌落形态产生非典型形态防止漏检挑取疑似菌落时宜取2~3菌落分进行检验提高铜绿假单胞菌检出率
    82
    绿脓菌素铜绿假单胞菌鉴定重特征色素产生受许素影响菌株差异变异外培养条件重素温度培养基成分等皆影响色素产生培养基中琼脂蛋白胨等均应事先测试选适宜品牌试验时阳性菌株作试验
    (五)金黄色葡萄球菌
    1 简述
    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)葡萄球菌属中种广泛分布然界空气土壤水物品动物皮肤外界相通腔道中常菌存菌产生种毒素酶毒性物质引起局部全身化脓性炎症严重时发展成败血症脓毒血症类化脓性感染中重病原菌菌抵抗力较强干燥情况生存数月80℃30min条件尚存活5%石碳酸01%升汞溶液10~15min会杀死
    金黄色葡萄球菌检查增菌分离纯培养革兰染色镜检血浆凝固酶试验等步骤进行法适外药品般滴眼剂眼膏剂检查
    2 仪器设备具(见肠埃希菌检查法2)
    3 试液指示液
    31 09%菌氯化钠溶液菌磷酸盐缓液(pH72)(附件二3133)
    32 革兰染色液(附件二24210216)
    33 菌枸橼酸钠氯化钠溶液(附件二27)
    34 血浆制备
    菌注射器吸取灭菌含5%枸橼酸钠09%氯化钠溶液1ml菌操作采取家兔(羊)血9ml轻轻混匀数分钟血液凝固时徐徐放入灭菌离心中离心(500
    r/min离心5min)分离血浆灭菌吸血浆转移灭菌试中置冰箱备前必须已知血浆凝固酶试验阳性金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌[CMCC(B)
    26003])测试证明血浆合格方实验
    35 1%酚磺酞指示液(附件二44)
    4 培养基
    41 营养肉汤培养基(附件二51)
    42 营养琼脂培养基(附件二52)
    43 亚碲酸盐肉汤培养基(附件二515)
    44 卵黄氯化钠琼脂培养基(附件二516)
    45 甘露醇氯化钠琼脂培养基(附件二517)
    5 菌液
    取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)
    26003]营养琼脂斜面新鲜培养物少许接种10ml营养肉汤培养基中30~35℃培养18~24h09%菌氯化钠溶液10倍递增稀释浓度相10~100cfu/ml作阳性菌液菌液浓度做阳性实验时板菌落计数法测(见方法验证标准菌株24)
    6 操作方法
    61 供试品检验量[见细菌霉菌(酵母菌)计数6]
    62 供试液制备[见细菌霉菌(酵母菌)计数7]
    63 增菌培养
    取营养肉汤(亚碲酸钠肉汤)培养基3份份100ml1份加入10ml供试液1份加入供试液阳性菌1份加入供试液等量09菌氯化钠溶液磷酸盐缓液(pH72)作阴性置30~35℃培养18~24h(必时延48h)阴性应菌生长
    64
    分离培养述供试品增菌培养液接种环沾取1~2环培养液划线接种卵黄氯化钠琼脂板甘露醇氯化钠琼脂板置30~35℃培养24~72h供试品分离板菌落生长菌落生长表列特征报告1g1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌
    表5 金黄色葡萄球菌三种选择性培养基菌落形态特征
          培养基 菌落形态特征
          卵黄氯化纳琼脂 金黄色圆形凸起边缘整齐光滑湿润外周分解卵磷脂产生乳浊圈菌落直径1~2mm
          甘露醇氯化纳琼脂 金黄色圆形凸起边缘整齐.光滑湿润.外周黄色环菌落直径07~1mm
    65 纯培养
    供试品分离板生长菌落表1列菌落特征相似疑似时应选取2~3菌落分接种针轻轻沾取菌落中心表面培养物接种营养琼脂斜面30~35℃培养18~24h取营养琼脂斜面培养物作革兰染色镜检接种营养琼脂肉汤30~35℃培养18~24h做血浆凝固酶试验
    66 革兰染色镜检
    661 革兰染色(见肠埃希菌检查法65)
    662 镜检金黄色葡萄球菌革兰阳性球菌芽孢般产生荚膜排列呈规葡萄状呈单成双短链状排列
    67 血浆凝固酶试验
    试法:取菌试(10mm×100mm)3支加入血浆09%菌氯化钠溶液(11)05ml1支加入琼脂斜面培养物菌悬液(检菌营养肉汤培养液)05ml余2支作:1支加入金黄色葡萄球菌[CMCC(B)
    26003]培养物菌悬液营养肉汤培养液05ml作阳性支加入营养肉汤09%菌氯化钠溶液05ml作阴性三时置37℃水浴恒温培养箱3h开始检查隔适时间观察次直24h检查时轻轻试倾斜(动作勿)仔细观察阴性血浆流动阳性血浆呈凝固状试验呈凝固者阳性反应凝固阴性反应阳性阴性符合求时应制备血浆重新试验
    7 结果判断
    果革兰染色结果清晰(必时加做已知革兰染色结果细菌进行染色质量控制)凝固酶试验阴性试验呈阴性阳性试验呈阳性结果供试品培养物列情况报告处理:
    71 疑似菌革兰染色呈阳性球菌血浆凝固酶试验阳性反应者报告1g1ml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株金黄色葡萄球菌葡萄球菌属菌种)
    72 革兰染色镜检革兰阳性球菌血浆凝固酶试验阴性反应报告1g1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌
    73 阴性菌生长试验结果效
    74 阳性试验呈阴性结果应加做验证试验考察检品否抑菌活性
    8 注意事项
    81
    金黄色葡萄球菌述两种分离培养基典型菌落金黄色受药物影响非典型菌株存呈橙黄色柠檬色白色做控制菌检查非典型菌落必进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌筛查防漏检金黄色葡萄球菌培养基存放时间培养时间影响色素产生培养基应新鲜配制培养时间宜48h
    82
    果干燥培养基应说明书配制注意pH值否符合规定必时应校正pH灭菌
     
    83
    血浆凝固酶试验应新鲜培养物新鲜血浆陈旧培养物血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应外观察结果时摇动试凝固初期凝块易破坏引起假阴性试验
    84
    葡萄球菌属新版Bergey手册中收载28种微生物菌种鉴定中目前应较2003年出版第八版美国床微生物手册收录35菌种44菌型常见金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌3种参表进行鉴定中金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌鉴重
    表6 3种葡萄球菌性状
          性状 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌
          菌落色素 金黄色 白色 柠檬色
          (菌落直径) 08~10mm 05~15mm 05~15mm
          α溶血毒素 + -/极少+ -
          甘露醇
          需氧 + d d
          厌氧 + - -
          凝固酶 + - -
          卵黄反应 + - -
          耐热DNA酶 + - -
          新生霉素敏感性 S S R
          噬菌体分型 数分型 分型 分型
          A蛋白 + - -
          致病性 强 弱
    d结果确定S敏感R耐药
    85 目前商品化金黄色葡萄球菌检测试剂家微生物相关制剂公司售试剂具较稳定性准确性商品化检测试剂应适条件保存效期应
    (六)梭菌
    1 简述
    梭菌属(Clostridium)称梭状芽孢杆菌属菌体1um×5um左右革兰阳性杆菌形成芽孢芽孢菌体宽度细菌膨胀呈梭形名梭状芽孢杆菌该菌属中病原菌产气荚膜梭菌
    (Cperfringens)破伤风梭菌(Ctetani)肉毒梭菌(Cbotulinum)艰难梭菌(Cdifficile)均产生强烈外毒素动物致病某阴道创伤溃疡药品必须控制梭菌
    检查梭菌方法增菌产毒培养镜检形态观察必时做分离培养行鉴定
    2 仪器设备具
    21 玻璃器皿
    试(30mm×200mm)等洗涤干净残留抗菌物质包扎灭菌备[见细菌霉菌(酵母菌)计数]
    22 天离心机显微镜高压蒸汽灭菌器恒温干燥箱[见细菌霉菌(酵母菌)计数]
    221 天高压蒸汽灭菌器恒温干燥箱等应定期进行校验
    222 厌氧培养袋箱(罐)等(商品供应)测试选
    23 洁净实验室净化工作台[见细菌霉菌(酵母菌)计数211]
    24 手术镊手术剪取样匙应严密包扎灭菌备
    3 试液
    31 革兰染色液(附件二21021624)
    32 厌氧指示剂(附件二48)
    33 3%氧化氢溶液
    34 75%乙醇溶液
    35 碘酊溶液碘伏
    36 09%菌氯化钠溶液(附件二31)
    37 苯扎溴铵(11000)溶液
    4 培养基
    41 硫乙醇酸盐流体培养基(附件二533)
    42 梭菌增菌培养基(附件二529)
    43 哥伦亚琼脂培养基(含庆霉素20mg/L含庆霉素)(附件二530)
    5 菌液
    生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]
    菌液制备
    取生孢梭菌接种12ml硫乙醇酸盐流体培养基中置30~35℃培养18~24h09菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu菌液生孢梭菌标准菌液计数取毫升含100~1000cfu菌液01ml涂布哥伦亚琼脂培养基板置厌氧条件培养48~72h计数取毫升含10~100cfu菌液1ml
    接种少12ml硫乙醇酸盐流体培养基中摇匀置30~35℃培养18~20h计数中灯笼状菌团般情况该灯笼状菌团数板计数菌落数相[见方法验证24]
    生孢梭菌菌种保存取硫乙醇酸盐流体培养物混匀冻存分装超低温保存(-80℃)时取出然解冻硫乙醇酸盐流体培养基复苏复壮制备新鲜培养物
    6 操作方法
    61 剂型样品前处理
    611 散剂包装直接称取规定量样品
    612 胶囊包装连壳起称取规定量样品
    613
    软膏剂栓剂称取样品10g细菌霉菌(酵母菌)计数623规定适宜方法乳化乳化加入预热45℃09%菌氯化钠溶液制成120供试液
    62 增菌培养
    621
    厌氧培养装置准备商品厌氧培养袋箱罐说明求准备外实验室真空干燥器标瓶适宜容器代选列种方法制备厌氧条件:
    6211 冷触媒法
    前取试适宜容器3支1支称入硼氢化钠022g(厌氧培养容器容积1L计)1支称取枸橼酸033g碳酸氢钠037g1支放入活化钯粒约1g接种供试品培养(板)厌氧指示剂1支时置厌氧培养容器加水5ml前2支(容器)中迅速密封容器盖钯粒覆盖钯氧化铝球状条状颗粒(商品出售)前需160℃干烤2h电炉灼烧5min活化1次便失催化性次时需法活化方钯粒干置室温水中附量气泡者活性良直接法作钯粒活性检查
    6212
    焦性没食子酸法前取培养皿适宜容器1支加入焦性没食子酸10g水碳酸钠5g(厌氧容器容积1L计)接种供试品培养(板)厌氧指示剂1支时置厌氧容器迅速密封容器盖
    622 增菌培养
    取供试液10ml(相供试品1g1ml)4份中2份置80℃保温10min迅速冷述4份供试液直接处理分接种100ml梭菌增菌培养基中中2份(直接1份处理1份)梭菌增菌培养中分加入阳性菌(10~100cfu)置厌氧条件培养48h
    63
    分离培养取述培养物02ml分涂抹接种含庆霉素哥伦亚琼脂培养基板置厌氧条件培养48~72h供试品板菌落生长判供试品未检出梭菌供试品板菌落生长应挑选2~3菌落分进行革兰染色氧化氢酶试验
    64
    革兰染色镜检取疑似菌落涂片作革兰染色镜检观察染色菌体特征菌形态特征较典型培养形成芽孢初呈火柴头状卵圆形继膨呈球形菌体末端鼓槌状培养时间72h时菌体溶消失仅见游离芽孢囊般染色时呈圆圈状染色镜检卵圆形球形芽孢菌体着生菌体中央次端顶端梭菌典型形态
    65 氧化氢酶试验
    加滴3%氧化氢溶液琼脂表面单分散菌落转移载玻片菌落气泡形成表示氧化氢酶反应阳性梭菌应成阴性结果枯草芽孢杆菌作阳性反应菌
    7 结果判断
    述疑菌落革兰阳性梭菌卵圆形球形芽孢氧化氢酶试验阴性判供试品检出梭菌否判供试品未检出梭菌
    8 注意事项
    81 操作时勿损伤皮肤损伤应立注射破伤风抗毒素防感染
    82 带活菌毒素器具应彻底灭菌方洗涤
    (七)白色念珠菌
    1 简述
    白色念珠菌(Candida albicans)名白假丝酵母菌(Saccharomyces albicaus)属假丝酵母菌属(Saccharomyces)白色念珠茵条件致病菌医学全身性真菌感染病重组成旦感染常引起心膜炎肺炎尿布疹鹅口疮阴道炎脑膜炎败血症等
    白色念珠菌菌细胞呈圆形卵圆形直径3~6um革兰染色阳性菌体着色均匀出芽方式繁殖适宜培养基芽生孢子假菌丝生长假菌丝间末端形成厚膜孢子白色念珠菌具β硝基半乳糖苷酶分解NGL硝基苯酚游离碱性条件显色
    白色念珠菌广泛分布土壤水空气中目前国外药品食品标准已白色念珠菌作微生物检验中酵母菌代表菌药品药途径剂型白色念珠菌作控制菌非常必
    2 试验器材条件
    21 设备器皿
    生化培养箱(23~28℃)恒温培养箱(30~35℃)水浴锅显微镜三角烧瓶吸培养皿等
    22 标准菌株
    白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
    菌液制备
    取新鲜白色念珠菌菌种接种10ml沙氏葡萄糖液体培养基中30~35℃培养24~48时09%菌生理盐水稀释含菌10~100cfu/ml菌液沙氏葡萄糖琼脂培养基板计数测定
    23 培养基
    沙氏葡萄糖液体培养基(附件二535)
    沙氏葡萄糖琼脂培养基(附件二536)
    念珠菌显色培养基(法国CHROMAGAR公司)[附件二537]
    1%聚山梨酯80-玉米粉琼脂培养基(附件二538)
    3 试验操作
    取供试液10ml(相供试品1g1ml10cm2)直接处理接种适量(少100m1)沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养24~48 h取述培养物划线接种沙氏葡萄糖琼脂培养基板30~35℃培养24~48h(必时延长72h)
    白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基生长菌落呈乳白色偶见淡黄色表面光滑浓酵母气味培养时间稍久菌落增颜色变深质变硬皱摺
    板菌落生长生长菌落述菌落形态特征符判供试品未检出白色念珠菌
    板生长菌落述菌落形态特征相符疑似应挑选2~3菌落分接种念珠菌显色培养基板30~35℃培养24~48h(必时延长72h)板绿色翠绿色菌落生长判供试品未检出白色念珠菌
    4 确认试验
    板生长菌落绿色翠绿色挑取相符疑似菌落接种1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基培养24~48h取培养物进行染色镜检芽试验
    芽试验
    挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基培养物接种加滴血清载玻片盖盖玻片置湿润皿置35~37℃培养1~3h置显微镜观察见孢**出短芽
     
    述疑似菌非革兰阳性菌显微镜未见厚膜孢子假菌丝芽判供试品未检出白色念珠菌
    三培养基适性检查
    1 概述
    培养基质量影响微生物检验结果重环节计数测定培养基促生长力微生物限度检查结果判断重影响素控制菌检查培养基促生长力指示力抑制力差异菌落颜色形态等指标存较差异影响结果判断客观性
    培养基适性检查通检验培养基培养基较阳性菌生长状态特征评价判断检验培养基否符合检验求
    微生物限度检查培养基分细菌霉菌酵母菌计数测定培养基控制菌检查培养基两部分2010版中国药典微生物限度检查法中收载适性检查培养基质量进行控制
    2 培养基适性检查实验般求
    21 培养基适性检查适范围
    2010版中国药典规定微生物限度检查中成品培养基脱水培养基处方配制培养基均应进行培养基适性检查
    培养基适性检查试验确定实验室培养基(包括购置批号成品培养基批号脱水培养基干粉处方行配制培养基批次原材料等)制备程序(包括水质控制配制方法灭菌程序等)保存条件(温度湿度时间盛装培养基容器条件等)等否满足微生物限度检查求述影响培养基质量关键点应通培养基适性检查试验确定果中控制点发生变化应重新进行培养基适性检查影响培养基质量关键控制点变化应掌握微生物实验室质量控制般原(见22)超般原培养基否满足微生物限度检查法通培养基适性检查确定
    检验结果出现异常实验室质量控制需通培养基适性检查提供定
    总培养基适性检查正常条件关培养基质量实验室控制措施定次具体微生物限度检查样品检测试验活动中必须时进行培养基适性检查试验次微生物检查培养基均应适性检查
    22 微生物限度检查培养基质量控制般原
    221 处方培养基代通培养基适性试验简单确定
    222 培养基适性检查取代供应商法定标准培养基效期保存条件制备方法等更严格规定
     
    223
    果没特殊规定培养基配制采蒸馏水纯化水均应采定措施加检测控制蒸馏水应核实
    pH否5~7采离子交换法制备纯化水电阻值应2MΩ等
    224
    量现配培养基灭菌取出前提快取出切忌高压锅夜存留固体培养基灭菌融化融化状态放置超8h般预制培养基置洁净环境2~25℃保存应超21天固体琼脂培养基熔化应超次
    225 干粉培养基培养基原料变质应预制培养基储存程中发现浑浊变色长菌严重脱水等变化应
    23 培养基
    培养基应通严格质量研究控制具备性稳定质量优异特点培养基作种标准试剂应具备源质量保障
    24 培养基适性检查指标常方法
    241 检查指标:促生长力指示力抑制力
    242 常方法:直接接种法浇碟法表面接种法(涂布法)
    243
    液体培养基通常采直接接种法测定述3种指标接种时应注意接种量超培养基体积10%固体培养基采浇碟法表面接种法测定述指标采浇碟法考察固体培养基时保证取样行性行测定两皿求均数采表面接种法(涂布法)考察固体培养基时表面接种菌液02ml/皿量控制01ml/皿保证取样间行性行测定两皿观察结果
    3 计数培养基适性检查
    微生物限度检查中计数培养基3种营养琼脂玫瑰红钠琼脂酵母浸出粉葡萄糖琼脂
    31 计数培养基适性检查试验菌株
    肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]
    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]
    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]
    白色念珠茵(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
    黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]
    菌株培养菌液制备微生物限度检查方法验证
     
    32 实验操作
    321
    培养基制备规定程序新鲜配制营养琼脂(检培养基培养基)玫瑰红钠琼脂(检培养基培养基)酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(检培养基培养基)灭菌备
    322
    营养琼脂培养基取7菌皿分接种肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌2皿皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu)皿接种菌作空白倾注营养琼脂培养基混匀凝固30~35℃倒置培养48h计数检培养基法操作
    323
    玫瑰红钠琼脂培养基取5菌皿分接种白色念珠菌黑曲霉菌2皿皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu)皿接种菌作空白倾注玫瑰红钠琼脂培养基混匀凝固倒置培养72h计数检培养基法操作
    324
    酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基取3菌皿分接种白色念珠菌2皿皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu)皿接种菌作空白倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基混匀凝固倒置培养72h计数检培养基法操作
    33 结果判断
    检培养基菌落均数培养基菌落均数70%菌落形态应培养基菌落致判断该培养基适性检查符合规定
    4 控制菌检查培养基适性检查
    控制菌检查成品培养基脱水培养基培养基处方配置培养基均应检查检查项目包括培养基促生长指示抑制特性力
    41 计数培养基适性检查试验菌株
    肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]
    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]
    乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
    生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]
    白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
    菌株培养菌液制备微生物限度检查方法验证
    42 种培养基需测试力判断指标
    液体培养基促生长力检查:取100cfu试验菌分接种检培养基培养基中相应控制菌检查规定培养温度(30~35℃)短培养基时间培养增菌培养基澄清液体培养基培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊
    固体培养基促生长力检查:取试验菌液01ml(含菌数50~100cfu)分涂布检培养基培养基相应控制菌检查规定培养温度(30~35℃)短培养基时间培养
    培养基较检培养基培养基生长菌落形态特征应致
    液体培养基指示力检查:取100cfu试验菌分接种检培养基培养基中相应控制菌检查规定培养温度(30~35℃)短培养基时间培养培养基较检培养基中试验菌应生长情况/指示剂反应等应培养基致
    固体养基指示力检查:取试验菌液01ml(含菌100cfu)分涂布检培养基培养基相应控制菌检查规定培养温度(30~35℃)培养基时间培养检培养基试验菌茵落形态特征菌落颜色指示剂反应情况应培养基致
    培养基抑制力检查:取100cfu试验菌分接种液体检培养基培养基取试验菌01ml液(100cfu)分涂布固体检培养基培养基相应控制菌检查规定培养温度(30~35℃)长培养基时间培养试验菌应生长
    43 控制菌检查培养基力测试列表(表7)
    控制菌检查涉21种培养基特点异表格中概述培养基检查具体项目具体操作程序说明
    表7 控制菌检查培养基适性检查项目菌株判断指标
          培养基 测试菌株 测试特性 测试指标
          胆盐乳糖培养基 肠埃希菌 促生长力 浑浊
          铜绿假单胞菌 浑浊
          金黄色葡萄球菌 抑制力 未见浑浊
          MUG培养基 肠埃希菌 促生长力 浑浊
          肠埃希菌 指示力 366nm荧光
          曙红亚甲蓝琼脂
          麦康凯琼脂 肠埃希菌 促生长力 回收率
          乙型副伤寒沙门菌 回收率
          肠埃希菌 指示力 颜色形态
          乙型副伤寒沙门菌 颜色形态
          乳糖胆盐发酵 肠埃希菌 促生长力 浑浊产气
          金黄色葡萄球菌 抑制力 未见浑浊
          乳糖发酵培养基 肠埃希菌 促生长力 浑浊
          肠埃希菌 指示力 产气
          营养肉汤 乙型副伤寒沙门菌 促生长力 浑浊
          金黄色葡萄球菌 促生长力 浑浊
          四硫磺酸钠亮绿培养基 乙型副伤寒沙门菌 促生长力 清浑浊
          金黄色葡萄球菌 抑制力 清未见浑浊
          胆盐硫乳琼脂
          沙门志贺属琼脂 乙型副伤寒沙门菌 促生长力 回收率
          乙型副伤寒沙门菌 指示力 颜色形态
          溴化十六烷基三甲铵
          琼脂 铜绿假单胞菌 促生长力 回收率
          肠埃希菌 抑制力 生长
          绿脓菌素测定培养基 铜绿假单胞菌 促生长力 回收率
          铜绿假单胞菌 指示力 颜色形态
          亚碲酸盐肉汤培养基 金黄色葡萄球菌 促生长力 浑浊
          肠埃希菌 抑制力 未见浑浊
          卵黄氯化钠琼脂
          甘露醇氯化钠琼脂 金黄色葡萄球菌 促生长力 回收率
          金黄色葡萄球菌 指示力 颜色形态
          肠埃希菌 抑制力 生长
          培养基 测试菌株 测试特性 测试指标
          梭菌增菌培养基 生孢梭菌 促生长力 浑浊
          哥伦亚琼脂 生孢梭菌 促生长力 回收率
          沙氏葡萄糖肉汤 白色念珠菌 促生长力 浑浊
          沙氏葡萄糖琼脂 白色念珠菌 促生长力 回收率
          白色念珠菌 指示力 颜色形态
          念珠菌显色培养基 白色念珠菌 促生长力 回收率
          白色念珠菌 指示力 颜色形态
          白色念珠菌 抑制力 生长
          1%聚山梨醋80玉米
          琼脂培养物 白色念珠菌 促生长力 回收率
          白色念珠菌 指示力 颜色形态
    44 控制菌检查培养基适性检查实验操作
    控制菌检查培养基数量较特点相避免培养基配制程出现遗漏处特提示需特殊注意培养基:
    高压灭菌加热煮沸灭菌培养基3种:DHL琼脂SS琼脂念珠菌显色培养基
    需添加试剂培养基3种:TTB培养基亚碲酸盐肉汤哥伦亚琼脂培养基
    叙述培养基适性检查具体操作程:
    441 胆盐乳糖培养基
    新鲜配制100ml/瓶胆盐乳糖培养基4瓶121℃灭菌15min备分接种肠埃希菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌1瓶接种菌液量1ml(100cfu)瓶接种菌作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18时培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊培养48时空白培养瓶接种金黄色葡萄球菌培养瓶应浑浊
    442
    MUG培养基新鲜配制5ml/支MUG培养基121℃灭菌15min备取3支接种肠埃希菌2支接种菌液02ml(100cfu)支接种菌作空白培养5时366nm紫外光灯观察结果检培养基法操作置规定温度培养空白培养应浑浊366nm处观察荧光培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊366nm处应呈现荧光荧光明显延长24h观察
    443 曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
    新鲜配制EMB琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取5菌EMB琼脂板分涂布接种肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养18h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养24h空白板应菌落生长
     
    444 麦康凯琼脂培养基
    新鲜配制麦康凯琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取5菌麦康凯琼脂板分涂布接种肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌5皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养18时检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养24时空白板应菌落生长
    445 乳糖胆盐发酵培养基
    新鲜配制10m/支胆盐乳糖培养基121℃灭菌15min备取5支分接种肠埃希菌金黄色葡萄球菌
    2支接种菌液1ml(100cfu)支接种菌作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18h培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变色浑浊倒中应明显产气现象培养24h空白培养接种金黄色葡萄球菌培养应变色浑浊
    446 乳糖发酵培养基
    新鲜配制10ml/支乳糖发酵培养基121℃灭菌15min备取3支接种肠埃希菌2支接种菌液1ml(100cfu)支接种菌作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18h培养基较.检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变色浑浊导中应明显产气现象培养24h空白培养应变色浑浊
    447 营养肉汤培养基
    新鲜配制100ml/瓶营养肉汤培养基3瓶121℃灭菌15min备分接种乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌1瓶接种菌液1ml(100cfu)瓶接种菌株作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18h培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊培养48h空白培养瓶应浑浊
    448 四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)
    新鲜配制10ml/支TTB培养基基础121℃灭菌15min备前菌操作加入02ml碘试液0lml亮绿试液取5支分接种乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌2支接种菌液1ml(100cfu)支接种菌作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18h培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基清浑浊培养24h空白培养接种金黄色葡萄球菌培养应浑浊
    TTB中碳酸钙浑浊现象观察影响浑浊现象明显培养物接种胆盐硫乳琼脂(DHL)沙门志贺属琼脂(SS)板划线观察TTB培养物生长情况空白接种金黄色葡萄球菌培养划线应菌落生长检TTB培养基划线接种琼脂板应菌落生长颜色形态致
    449 胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
    新鲜配制DHL琼脂培养基加热充分溶解冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取3菌DHL琼脂板涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养18h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养48h空白板应菌落生长
    4410 沙门志贺属琼脂培养基(SS)
    新鲜配制SS琼脂培养基加热充分溶解冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取
    3菌SS琼脂板涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养18h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养48h空白板应菌落生长
    4411 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础
    新鲜配制溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取7菌琼脂板分涂布接种铜绿假单胞菌肠埃希菌3皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养18h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养24h空白板接种肠埃希菌板应菌落生长
    4412 绿脓菌素测定培养基(PDP)
    新鲜配制绿脓菌素测定培养基基础升培养基中加入10ml甘油121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取3菌绿脓菌素测定琼脂板涂布接种铜绿假单胞菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养24h检培养基法操作空白板应菌落生长检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致
    4413 亚碲酸盐肉汤培养基
    新鲜配制100ml/瓶营养肉汤培养基3瓶121℃灭菌15min备加入新鲜配制菌1%亚碲酸盐02ml分接种金黄色葡萄球菌肠埃希菌1瓶接种菌液1ml(100cfu)瓶接种菌株作空白检培养基法操作置规定温度培养培养18h培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变黑变浑浊培养48h空白培养瓶接种肠埃希菌培养瓶应浑浊
    4414
    卵黄氯化钠琼脂培养基新鲜配制卵黄氯化钠琼脂培养基基础121℃灭菌15min冷60℃参2010版中国药典例菌操作加入10%氯化钠卵黄液充分振摇倾注皿35℃培养箱预培8h备取5菌琼脂板分涂布接种金黄色葡萄球菌肠埃希菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养24h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养72h空白板接种肠埃希菌板应菌落生长
    4415 甘露醇氯化钠琼脂培养基
    新鲜配制甘露醇氯化钠琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取5菌琼脂板分涂布接种金黄色葡萄球菌肠埃希菌2皿接种菌液
    01ml(含菌50~1000fu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养24时检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养72h空白板接种肠埃希菌板应菌落生长
    4416 梭菌增菌培养基
    新鲜配制100ml/瓶梭菌增菌培养基2瓶121℃灭菌15min备接种生孢梭菌1瓶接种菌液1ml(100cfu)瓶接种菌株作空白置规定温度厌氧条件培养48h检培养基法操作空白培养瓶应浑浊培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊
    4417 哥伦亚琼脂培养基
    新鲜配制哥伦亚琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取3哥伦亚琼脂板涂布接种生孢梭菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀置规定温度厌氧条件倒置培养检培养基法操作48时空白板应菌落生长检培养基菌落形态特征应培养基菌落致
    哥伦亚琼脂培养基营养丰富适宜数需氧菌生长消杂菌生长检查结果影响升灭菌培养基中菌操作添加含相20mg庆霉素硫酸庆霉素添加庆霉素哥伦亚琼脂参述方法进行培养基适性考察
    4418 沙氏葡萄糖肉汤培养基
    新鲜配制100ml/瓶沙氏葡萄糖肉汤培养基2瓶121℃灭菌15min备接种白色念珠菌1瓶接种菌液1ml(100cfu)瓶接种菌株作空白检培养基法操作置规定温度培养培养48h培养基较检培养基中试验菌应生长良表现液体培养基变浑浊培养72h空白培养瓶应浑浊
    4419 沙氏葡萄糖琼脂培养基
    新鲜配制沙氏葡萄糖琼脂培养基121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取3沙氏葡萄糖琼脂板涂布接种白色念珠菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养24h检培养基菌落形态特征颜色气味应培养基菌落致培养72h空白板应菌落生长
    4420 念珠菌显色培养基
    新鲜配制念珠菌显色培养基加热充分溶解冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备念珠菌显色板前避光保存取5菌念珠菌显色板分涂布接种白色念珠菌肠埃希菌2皿接种01ml菌液(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养
    24h检培养基菌落形态特征颜色应培养基菌落致培养72h空白板接种肠埃希菌板应菌落生长
    4421 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基
    新鲜配制1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基基础升培养基中加入10ml聚山梨酯80121℃灭菌15min冷60℃倾注皿35℃培养箱预培8h备取31%聚山梨酯80-玉米琼脂板涂布接种白色念珠菌2皿接种菌液01ml(含菌50~100cfu)板接种菌作空白涂布均匀规定温度倒置培养检培养基法操作培养24h检培养基菌落形态特征芽指示力应培养基菌落致培养48h空白板应菌落生长
    Tags:中国药品检验标准操作规程
     

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