微生物限度检查法

来源:www.xiangdang.net上传者:wangluoshouji时间:2015/11/26

中国药品检验标准操作规程2010版-微生物限度检查法

一、细菌、霉菌和酵母菌计数

1 简述

细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。

细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法,这是活菌计数的方法之一,也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测**果只反映在该规定条件下所生长的细菌(为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数,实际为菌落形成单位数(colony forming unity,cfu),不应理解为细菌、霉菌、酵母菌个数。

2 设备、仪器

2.1 设备

2.1.1 洁净实验室

微生物限度检查应有单独的洁净实验室,每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。

2.1.1.1 结构和要求

洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱,出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平整,能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形,无缝隙,不留死角。操作间内不应安装下水道。

洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内,室内光照应分布均匀,光照度不低于300LX。

2.1.1.2 温度、湿度 洁净实验室内的温度应控制在18~26℃,相对湿度最好在40%~60%。

2.1.1.3 操作间

操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级,局部洁净度为100级(或放置同等级净化工作台)。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压,不低于10Pa,操作间与缓冲间也应保持相对正压,不低于5Pa。操作台上备有药物天平,乙醇灯,火柴,乙醇棉球,大、小橡皮乳头等。

2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。

2.1.1.5 洁净级别及检查方法

通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法(参照《医药工业洁净室》(区)悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准)进行洁净度验证。

不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1。

表l –不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准

洁净级别

尘埃数<<m3

浮游菌(个)<<m3

沉降菌(个)<<

(Ф90mm?0.5h)

微粒直径≥0.5μm

微粒直径≥5μm

100级

≤3,500

≤0

≤5

≤1

10000级

≤350,000

≤2000

≤100

≤3

100000级

3,500,000

≤20,000

≤500

≤10

沉降菌数测定(Ⅱ法)

洁净实验室操作台消毒擦拭处理后,先启动层流净化装置30min,将备妥的营养琼脂平板3个(经30~35℃预培养48h,证明无菌落生长)。以无菌方式(或经传递箱)移人操作间,置净化台左、中、右各1个,开盖,暴露30min后将盖盖上。在30~35℃培养箱内倒置培养48h,取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

有条件的单位,同时应检查洁净操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。

操作问和净化工作台要定期检测其洁净度,分别应达到10000级和100级。如菌落数或微粒数超标,应清洗过滤系统中的过滤设施,必要时予以更换。

2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角,然后启动层流净化装置。

2.1.2 阳性菌实验室

涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动,应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外,阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准,阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。

2.1.3 洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中,布局合理,避免污染,便于管理。

2.2 仪器

2.2.1 恒温培养箱(30~35℃)、生化培养箱(23~28℃)、微波炉、匀浆仪(3000~8000

r/min)或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱(100~300℃)、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器(使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定)。

菌落计数器、显微镜(40×~1500×)、电子天平或药物天平(感量0.1g),pH计。

2.2.2 玻璃器皿

锥形瓶(250~300ml、500ml内装玻璃珠若干)、培养皿(9cm)、量筒(100ml,500m1)、试管(18mm×180mm)及塞、吸管(1m1分度0.0l,10m1分度0.1)、注射器(20ml或30m1)、涂布棒、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)、不锈钢桶(带盖)。玻璃器皿用前应洗涤干净,吸管、量筒不挂水滴,无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花,置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞,若用振荡器制备混悬液时,尚需用玻璃纸包裹瓶塞,以免振荡时供试液污染瓶塞,再用牛皮纸包扎。玻璃器皿,均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min,烘干备用。

2.2.3 用具

大、小橡皮乳头(放于干净带盖的容器中,并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡)。无菌衣、帽、口罩、手套(洗净后配套,用牛皮纸包严)灭菌,备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

接种环(白铱金或镍铬合金,环径4~5mm、长度6~10cm)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(12cm)、实验记录纸等。

3 试液、稀释剂和试剂

3.1试液

3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液(供洗手、擦拭操作台面用)。

3.1.2 5%石碳酸溶液(配好后装入玻璃消毒缸内,供消毒带菌吸管用)亦可选用其他适宜消毒液。

3.1.3 75%乙醇溶液。

3.1.4 碘酊或碘伏溶液。

3.2 稀释剂和试剂

稀释剂配制后,采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1)。

3.2.2 pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液(附件二3.5)。

3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠?蛋白胨缓冲液(附件二3.4)。

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