DNA分子标记检测技术谱系理学研究中应
摘：DNA分子标记检测基组寻找态位点揭示体间种群间遗传变异亲缘关系等方法针某特定系统学问题选择合适分子标记谱系理学研究中关键步前研究基础讨目前分子谱系理学研究中常分子标记方法限制性片段长度态性分析（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP ）扩增态性DNA（Random Amplification Polymorphism DNA RAPD）扩增片段长度态性（Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP）简单重复序列（Simple Sequence Repeats SSRs）等研究表明分子标记方法谱系理学研究中越越应进行群体遗传结构谱系理学分析具重意义
关键词：态位点分子标记谱系理学群体遗传结构
Application of DNA Molecular Markers of Testing in Phylogeographic Study
分子标记 ( Molecular Markers ) 体间遗传物质核苷酸序列变异基础遗传标记DNA水遗传态性直接反映种遗传标记——形态学标记生物化学标记细胞学标记相DNA分子标记具优越性：数分子标记显性隐性性状选择十分便利基组变异极丰富分子标记数量限生物发育阶段组织DNA标记分析分子标记揭示DNA变异表现中性影响目标性状表达良性状连锁检测手段简单迅速[12]
着分子生物学技术发展分子标记广泛存基组区域通机分布整基组分子标记态性进行较够全面评估研究象样性揭示遗传质利遗传样性结果物种进行聚类分析进解系统发育亲缘关系分子标记发展研究物种亲缘关系系统分类提供力手段外DNA分子标记广泛应遗传育种基组作图基定位基库构建基克隆等方面[3]
1 分子标记检测技术概述
20世纪80年代建立DNA分子标记检测技术基DNA分子变异建立起分子标记检测变异位DNA重复序列非编码序列表型作没影响然编码序列改变氨基酸序列
DNA序列变异分子标记假定选择中性 ( selective neutrality )
11 DNA分子标记分类
DNA变异检测手段DNA分子标记分四类
Southern杂交基础分子杂交类标记利限制性切核酸酶酶切凝胶电泳分离生物体DNA分子然标记特异性DNA探针杂交通放射显影非位素显色技术揭示DNA变异中常限制性片段长度态性 ( Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP )
聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain ReactionPCR ) 基础分子标记类标记根引物特点分机引物PCR标记特异性引物PCR标记前者应广泛机扩增态性DNA标记 ( Random Amplification Polymorphism DNARAPD )者应简单重复序列 ( Simple Sequence RepeatsSSRs )
基PCR限制性切核酸酶技术结合分子标记类标记种通限制性切核酸酶片段选择性扩增显示限制性片段长度态性扩增片段长度态性 ( Amplified Fragment Length PolymorphismAFLP )种通PCR扩增片段限制性核酸酶酶切提示扩增态性序列特征化扩增区域 ( Sequnce Characterzied Amplifide RegionSCAR )
单核甘酸态性 ( Single Nucleotide PolymorphismSNP ) 基础分子标记般通DNA芯片DNA测序分析检测DNA序列中单碱基变异
DNA分子标记然形式样基原理样通定方法手段揭示样中DNA序列间差异[48]
12 理想分子标记求
理想分子标记必须达求：(1) 具高态性(2) 显性遗传利分子标记鉴二倍体中杂合纯合基型(3) 明确辨等位基(4) 遍布整基组(5) 特殊位点标记外求分子标记均匀分布整基组(6)
选择中性(基效性)(7) 检测手段简单快速(实验程序易动化)(8) 开发成成量低廉(9) 实验室实验室间重复性(便数交换)目前发现种分子标记均满足求[9]
13 分子标记谱系理学研究关系
谱系理学 ( phylogeography ) 历史生物理学分支学科谱系理学概念Avise等（1987）提出门物种（尤指种水）谱系理分布原理程关新兴学科探讨物种演化（亲缘关系）质历史（冰河理隔离时间等）间相关性物种遗传变异形式生态学址历史事件结合起时间空间物种历史进行描述谱系理学称亲缘理学[10]
早应群体遗传学研究分子标记等位酶 ( Izoenzyme ) 然等位酶标记仅适干酶系统检测酶基表达产物部分变异变异总量核基变异三分[11]发展起基DNA遗传标记限制性长度态性分析 ( RFLP )通总基组限制性切酶消化产生许长度片段电泳分离转移尼龙膜硝酸纤维膜然特异DNA片段探针进行膜杂交着PCR技术产生PCR基础种分子标记相继出现：扩增态性DNA ( RAPD )扩增长度态性 ( AFLP ) 简单重复序列 ( SSRs ) 等
选择合适分子标记进行谱系理学研究进确定单倍型分布遗传样性进行分析终推测物种冰期避难探讨冰期群体历史重建进化显著单元 ( Evolutionary Significant UnitsESU ) 确定群体间分歧时间估算栽培植物起源追溯等等研究古代植物区系古理古气候重科学价值制定合理保护策略提供理指导[1213]
14 分子标记方法选择
选择合适分子标记进行谱系理学研究时需考虑方面：（1
）获位点数目（2）分子标记提供态性程度（3）否显性标记显性分子标记RAPDAFLP进行谱系理学研究时显性分子标记（：SSRsRFLPs）（4）实验重复性（5）转移性（6）操作性成
种分子标记特点见表11
表11 种谱系理学研究中常分子标记较
Table 11 Comparison of different molecular markers used in phylogeographic stugy
Marker
Abundance
Levels of polymorphism
Codominance
Reproducibiliby
Cost
Izoenzymes
Low
Low
Yes
High
Low
RFLP
High
Medium
Yes
High
High
SSR
High
High
Yes
High
High
RAPD
High
Medium
No
Low
Low
AFLP
High
High
No
High
High
2 DNA分子标记类
21 限制性片段长度态性
211 RFLP简介
限制性片段长度态性（ Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP ） 研究领域解释遗传学基组学定义物种亚种品系体间基组DNA受种限制性切酶作形成酶切图谱现象
RFLP技术1980年类遗传学家Bostein提出第代DNA分子标记技术 DonisKeller利技术1987年构建成第张遗传图谱DNA分子水态性检测技术进行基组研究基础RFLP技术已广泛基组遗传图谱构建基定位生物进化分类研究[14]RFLP标记根品种（体）基组限制性切酶酶切位点碱基发生突变酶切位点间发生碱基插入缺失导致酶切片段发生变化种变化通特定探针杂交进行检测较品种（体）
DNA水差异（态性）探针较确立生物进化分类关系探针源种种基组DNA克隆位染色体位点作种分子标记构建分子图谱
某性状（基）某（）分子标记协分离时表明性状（基）分子标记连锁分子标记性状间交换值表示目标基分子标记间距离基定位分子图谱分子标记克隆质粒繁殖保存限制性切酶切割基组DNA切片段类型样限制性切酶分子标记组成组合进行研究常限制性切酶般HindⅢBamHⅠEcoRⅠEcoRVXbaⅠ分子标记甚千分子标记越构建图谱越饱构建饱图谱 RFLP 研究目标[15]
212 RFLP原理
RFLP技术原理检测DNA限制性切酶酶切形成特定DNA片段引起酶切位点变异突变点突变（新产生酶切位点） 段DNA重新组织（插入缺失造成酶切位点间长度发生变化）等均导致RFLP产生该技术利限制性切酶识DNA分子特异序列特定序列处切开DNA分子产生限制性片段特性种群生物体言DNA序列存差果种差刚发生切酶酶切位点切酶识序列变成识序列种差切酶识位点DNA序列变成切酶识位点样导致限制性切酶酶切该DNA序列时会少酶切位点结果产生少酶切片段样形成种限制性切酶切割物种DNA序列时产生长度数量限制性酶切片段片段电泳转膜变性标记探针进行杂交洗膜分析态性结果[16]
RFLP分析通常测量影响限制性位点相关位置DNA变异显示谱带直接较者解释限制性位点DNA长度突变通常解释DNA倒位染色体倒位否RFLP分析结果通常样RFLP标记显性够总
DNA提取物中检测出核DNA细胞器DNA变异结果具搞重复性够检测出量遗传变异外出现目区域外DNA态性检测例出现探针区域外突变位点RFLP分析需量DNA常常需放射性核素样核DNA标记数量会受限制RFLP费高检测费时实验室数难检测酶DNA甲基化作定切点RFLP变化酶基活化引起
213 RFLP类型
类限制性切酶位点发生单碱基突变限制性位点发生丢失获产生态性称点态性 ( Point Polymorphism )类态性实际双态（＋）（－）类DNA 分子部发生较序变化致类态性分成两类：第类DNA 序发生突变缺失重复插入致第二类年发现谓高变区高变区 ( Highly variable region )串联重复序组成体高变区串联重复拷贝数相差悬殊高变区长度变化高变区两侧限制性切酶识位点固定位置高变区发生相位移类型RFLP 高变区串联重复序拷贝数产生突出特征限制性切酶识位点身碱基没发生改变改变基组中相位置[17]实际DNA 序中存着量单碱基换通常技术检测出影响限制性切酶识位点突变
214 PCRRFLP分析步骤
PCRRFLP分析步骤包括基组DNA分离目片段扩增限限制性切酶消化电泳分离检测等步骤：
1 提取研究象基组DNA
2目序列限制性切酶选择：叶绿体序列进行分析通常选择叶绿体基组具较高变异非编码区含子序列通常叶绿体基组长单
拷贝区变异速率短单拷贝区已知研究象序列信息先利某序列分析软件sequencherDNAsis序列酶切位点找出果想获较酶切片段选择少酶切位点酶然根实际情况定[18]
3目序列进行PCR扩增然选择限制性切酶进行酶切
4酶切片段电泳分离检测：DNA序列酶切产物通琼脂糖凝
胶电泳者聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离检测
215 RFLP谱系理学中应
植物叶绿体DNA ( cpDNA )非编码区域存相较高核苷酸置换率种间种拥较高遗传变异迄分子系统学谱系理学研究类基组叶绿体基组变异速率区域物种中样变异速率高区域长单拷贝区反转录区cpDNA遗传变异中少50插入缺失造成通限制性片段长度态性分析检测插入缺失点突变Tablert等 (1991)Demesure等 (1995) DumolinLapegue等 (1997) 开发系列扩增叶绿体线粒体非编码区通引物片段进行限制性切酶位点分析统计单倍型类型分布频率进行植物物种鉴定植物系统学分析群体遗传学谱系理学研究Ge等（2005）利SSRcpDNA PCRRFLP分子标记检测中国野蕉( Musa balbisiana ) 群体遗传结构亲缘理学分析基PCR限制性片段长度态性 ( PCRRestriction Fragment Length PolymorphismPCRRFLP ) 广泛应植物谱系理学研究中[1923]
22 机扩增态性DNA
221 RAPD简介
1990年WilliamsWelsh 等运机引物扩增寻找态性 DNA 片段作分子标记方法命名RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA )机扩增态性 DNA
RAPD技术诞生时间长独DNA态性快速简便等特点成目前基组遗传图谱构建基定位生物进化分类重手段[24]
222 RAPD标记原理特点
机扩增态性DNA标记技术建立PCR基础利具10左右碱基单链机引物 ( Arbitary primer )基组DNA全部进行PCR扩增检测基组变异
RAPD系列引物相特定引物说基组DNA序列特定结合位点特定结合位点基组某区域分布符合PCR扩增条件引物模板两条链互补位置引物3端相距定长度范围扩增出片段果基组区域发生DNA片段插入缺失碱基突变导致结合位点分布发生相应变化通 PCR 产物检测探知基组DNA区域态性进行RAPD分析时引物数然引物言检测基组DNA态性区域限利系列引物检测区域覆盖整基组RAPD整基组进行态性检测[25]
RAPD 技术 DNA 态性检测技术 RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism )DNA指纹图( DNA Fingerprinting )SSCP ( Singerstrind Conformatation Polymorphism ) 等相具特点：①RAPD技术受试物种（包括动物植物微生物）缺乏分子生物学研究背景直接基组进行态性分析②操作简便次RAPD扩增实际次简单PCR反应适合量样快速分析③需模板DNA量极少般次扩增需5～50ngDNA毛发脱落组织甚动物排泄物中提取微量DNA进行直接扩增珍稀濒危动物价值高种畜禽基组分析十分效
然RAPD具费低廉检测方便需基序列信息量假定基座检测出存危险需材料少等优点
RAPD图谱中某弱带重复性较差RAPD引物长度序列应引物数目扩增反应条件等实验技术方面尚未标准化影响条件RAPD分析结果性外RAPD标记含信息量假阳性假阴性结果法区分位点扩增DNA片段纯杂合法进行等位基分析等足定程度制约RAPD技术应[26]
223 RAPD基操作方法
RAPD操作方法体包括DNA提取扩增电泳染色等步骤具体操作程见 Williams等（19901993） Welsh等（1990）述着 RAPD技术发展该技术作改动
2231 RAPD反应体系
22311 RAPD反应仪器试剂
RAPD扩增实验仪器台 PCR扩增仪 RAPD反应中引物模板间结合机建议台固定PCR扩增仪进行RAPD反应
RAPD反应试剂：①PCR缓液家公司生产TaqDNA酶均配相应缓液② dNTP包括 dATPdGTPdCTPdTTP 4种种浓度25mmol／dm3③MgCl2 25mmol／dm3④机引物美国Opren公司生产800种机引物公司生产⑤牛血清白蛋白（BSA）10mg／ml明胶 001％③TaqDNA聚合酶
22312 RAPDPCR体系
PCR体系10μl20μl25μl50μl100μl反应体系中成分浓度：①机引物通常10碱基组成中G＋C％50％～70％RAPD引物浓度02μmol／dm3②dNTP（包括dATPdGTPdCTPdTTP）RAPD反应种dNTP浓度01mmol／dm3③PCR反应缓液：包括10mmol／dm3TrisHClpH值9050mmol／dm3 KCl25mmol／dm3MgCl2 ④0001％明胶（
2mg／ml BSA）⑤基组 DNA：5～50ng基组 DNA③TaqDNA聚合酶：05～1μl TaqDNA聚合酶⑦矿物油：反应混合物适量石蜡油覆盖防治反应液蒸发[2728]
22313 RAPD反应程序
RAPD种特殊PCR技术常规PCRRAPD求退火温度较低RAPD引物较短致（10bp）通常RAPD扩增条件：①94℃预变性200秒②94℃变性1分钟36℃退火1分钟72℃延伸2分钟包括40循环③72℃延伸300秒时PCR扩增仪性完全致RAPD反应条件应作相应改变RAPD反应 DNA必须片段纯度高基组 DNA（Genomic DNA）果DNA样品混杂质蛋白质PCR反应抑制剂会影响RAPD扩增效果
22314 RAPD产物检测
RAPD产物1／4体积溴酚蓝－EDTA－甘油混合液采15％琼脂糖胶检测电泳电压5V／cm溴化乙锭染色紫外光拍成
224 RAPD数统计方法
DNA提取扩增电泳染色程态程度较高RAPD谱带目前RAPD数处理没建立起套诸工酶数处理较完整统计体系年学者进行RAPD研究时提出种资料处理方法公式工酶RFLP统计方法国际流行着RAPD数处理方法程序较常UPGMA（权重配算术均数法）基原理运Jaccard相似系数[29]类似NTSYS（数量分类系统）SAS统计分析软件包中CLUSTER程序等方法检测体群体间遗传变异时RAPD
标记作孟德尔特征RAPD 标记具显／隐性交种类RAPD 谱中某态位点般纯合扩增产物频率作等位基频率异交种类RAPD 谱中某态位点杂合扩增产物存频率作RAPD表型频率定义已知等位基频率 Nei指数计算群体基样性遗传分化系数遗传距离Shannon指数估算群体遗传样性RAPD表型频率估算 Shannon表型样性指数Jaccard相似系数（距离）采琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色带相较少较易分析聚丙烯酰胺凝胶电泳硝酸银染色带较银染较敏感然目前文献中方法针前者认统计方法适合聚丙烯酰胺凝胶银染分析
225 RAPD标记技术谱系理学研究中应
RAPD机选择寡核苷酸序列（约10bp）基组DNA扩增出长度DNA片段基组DNARAPD引物结合位点核苷酸序列改变会产生RAPD指纹图谱通琼脂糖凝胶电泳进行分离检测RAPD钟显性标记某物种进行RAPD分析前需解物种基组信息已许研究利RAPD标记进行分子亲缘理学分析：Gabrielsen等 ( 1997 ) RAPD标记研究挪威SvalbardZemlya18虎耳草 ( Saxifraga oppositifolia ) 种群认该种群间存量基流现北欧群体冰期量具高遗传变异冰原附群体迁移形成[30]频繁迁移强基流冰期避难存活群体( 果前存话 )间遗传分化冰期互相混合消失品种分类鉴定常形态学工酶区某关系较材料准确区分RAPD分类鉴定表现出明显优势Willkie (1993) RAPD葱属进行遗传关系分析矮牡丹紫牡丹丁香方法做分类鉴定系谱分析工作Williams (1990) welsh (1990)
玉米豆水稻进行RAPD指纹图谱构建品种品系进行鉴定系谱分析RAPD标记技术已越越应植物谱系理学研究中
23 简单重复序列
231 SSR标记
简单重复序列（Simple Sequence RepeatsSSRs）称微卫星DNA（Microsatellite DNA）称短串联重复（Short tandem repeatSTR）类（1~6）碱基组成基序( motif )( AT ) n( GTT ) n( CAG ) n( ATTT )n ( n 重复) 等串联重复成DNA序列SSR长度般较短100bp植物基组中( AT ) n 常见SSR认机分布核DNAcpDNAmtDNA中基组中某特定SSR侧翼序列通常保守性较强单序列SSR侧翼DNA片段克隆测序然根SSR侧翼两端互补序列工设计合成引物通PCR反应扩增SSR片段遗传材料核心序列串联重复数目够PCR方法扩增出长度PCR产物产物进行凝胶电泳凝胶出现电泳谱带检测基型遗传变异扩增片段代表微卫星位点DNA变异事微卫星位点出现量跳跃片段侧翼区域出现突变[31]
SSR标记般检测单SSR位点变异类型显性鉴杂合体纯合体SSR标记数量丰富覆盖整基组DNA标记相SSR标记突变率高SSR标记中扩增DNA片段两侧序列未知SSR两侧引物具物种特异性需克隆测序意味着SSR引物开发检测费高SSR标记研究中断缺（stutter）谱带电泳结果难解释SSR突变模型意味着微卫星等位位点间非源相似性（homoplasy）高外SSR标记检测变异位点限研究物种间遗传变异限制SSR标记技术应
232 ISSR标记
2321 ISSR标记技术原理
简单重复间序列（InterSimple Sequence RepeatISSR）标记针SSR标记局限设计根植物广泛存SSR特点SSR序列3’端5’端加2~4机核苷酸作引物保证引物基组中SSR3’端5’端结合两侧具反排列SSR段DNA序列进行PCR扩增扩增产物进行电泳染色根谱带相应位置分析群体ISSR标记遗传变异
2322 ISSR标记特点
ISSR引物通常16～18碱基体2~4碱基组成串联重复序列然5’端3’端加1~4锚定碱基保证ISSR引物够SSR间DNA序列进行PCR扩增微卫星基组中广泛分布(Roder et a1．1998)等位变异特丰富ISSR检测高态性外ISSRSSR具物种特异性RAPD样类动植物研究引物设计求产物态性远RFLPSSRRAPD更加丰富提供更关基组信息RAPD技术更加稳定实验重复性更外ISSR操作起较简单成较低适合样检测[3235]
2323 ISSR标记实验操作
基 PCR技术分子标记方法样 ISSR技术包括 DNA提取PCR扩增电泳检测观察结果统计分析等步骤采常规方法提取 ISSR分析 DNA样品 SDS法 CTAB法根需适改良然需试剂盒提取 DNA进行纯化需 DNA样品进行电泳检测质量分光光度计检测 OD260280 OD260230菌水普通 TE DNA稀释贮存 20℃ 70℃冰箱中备确定引物 PCR仪基组中 SSR间序列进行扩增扩增步骤 RAPD技术相似引物植物材料扩增条件存差异需通预备实验体系反应液中
DNA模板浓度dNTPs引物Tag酶Mg2 +浓度 变性温度复性温度热循环程序等进行优化获清晰重复宜统计带纹[36]PCR产物需电泳分离染色显示进行谱带观察统计目前 DNA分离中电泳介质 ISSR扩增产物分离琼脂糖浓度常 15 20聚丙烯酰胺常浓度 6者分离效果通常更硝 酸银溴化乙啶 (EB)染色见光 (银染 )紫外光 (EB染色 )进行观察统计带纹 (计 1) (计0)相位置然根研究目应相关软件进行分析
233 简单重复序列谱系理学研究中应
SSR标记引物开发设计需消耗量力物力SSR种优点越越应群体遗传学谱系理学研究中Ge等（2005）利SSRcpDNA PCRRFLP分子标记检测中国野蕉( Musa balbisiana ) 群体遗传结构亲缘理学分析SSR数揭示中国野蕉群体显著理结构时利nrSSR估测花粉带基流cpDNA数估测种子流365倍Kuroda等(2006)利SSR变异日野生豆( Glyeine soja ) 群体遗传结构进行分析77野生豆群体616体分析结果发现野生豆群体观测杂合度低群体间存强烈分化认野生豆群体受较程度奠基者效应影响栽培豆群体出现明显分化时已出现栽培豆群体基渐渗现象[37]目前许报道利叶绿体SSR标记(cpSSRs)成功进行物种群体遗传学分子系统学研究针叶类植物中许研究根较保守cpSSRs两翼序列设计引物进行cpSSRs扩增进行分子谱系理学研究[38]Heuertz等 ( 2004 ) 结合叶绿体PCRRFLPcpSSRs方法欧洲岑树(Fraxinus excelsior ) 全部然群体遗传结构冰期历史进行研究发现然群体态性程度较低推测冰期避难伊利亚意利**尔卑斯山巴尔干半岛化石花粉结果致建议进行亲缘理学分析时候应该结合分子标记限度获物种遗传信息[39]
ISSR标记作点标记物种种群遗传样性亲缘关系分析等研究方面广泛Tsumura等ISSR方法研究日雪松 ( Cryptomeria japonica ) 花旗松 (Pseudotsuga menziesii ) 间亲缘关系结果发现24 ISSR引物87 ~ 100 引物物种中态性引物物种间样性差异Huang等ISSR4叶绿体DNA非编码区限制性位点变异研究40甘薯属 ( Ipomoea ) 样品遗传样性种关系[40]王心宇等 ( 2001 )利ISSR标记构建亲缘关系较麦品种品系指纹图谱RAPD结果作分析结果发现：(AG)n(Ac)n(TG)n 等二核苷酸重复引物类型亲缘关系品种品系区分开 杜金昆等 ( 2002 ) 利11ISSR引物供试47份麦品种明显区分开准确确定基型间遗传差异亲缘关系予卿等（2001）利ISSR分子标记研究37份栽培稻野生稻亲缘关系李进波等 ( 2003 ) ISSRSSR标记建立24水稻光温敏核育系DNA指纹图谱利13ISSR引物20SSR引物分获174态性片段62态性片段均ISSR引物检测1338态性片段远远高SSR引物检测率
SSR标记基础改进ISSR标记类快速准确产生足够态位点分子标记方法规模作物DNA指纹分析遗传作图基定位等研究分子谱系理学研究中发挥越越作
24 扩增片段长度态性
241 AFLP简介
扩增片段长度态性 ( Amplified Fragment Length PolymorphismAFLP ) 1993年荷兰科学家ZbaeauVos发展起种检测DNA态性新方法建立基组限制性片段基础PCR扩增Vos等1995年Nueleic Aeids Researeh发表AFLP：a new Technique for DNA fingerprinting文详细介绍AFLP指纹图谱标记原理
AFLP指纹标记技术结合AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) PCR ( Polymerase Chain Reaetion ) 两者特点总说具优势：(1)预先知道研究象基组信息(2) 仅需少量DNA(3) 具较高重复性(4) 扫描整基组引物组合产生量片段量信息(5) 符合孟德尔分离定律(6) 非等位基迁移出现概率极低 AFLP具身足处：(1) 显性标记报道指出AFLP扩增条带进行显性分析般说AFLP作显性标记(2) 成高试剂盒价格昂贵时操作定难度设计步骤繁
AFLP指纹图谱已广泛应 (1) 构建遗传图谱定位克隆基 (2) 群体遗传结构研究(3) 检测遗传样性(4) 系统发育重建(5) 确定杂交起源杂交理区域Arens等 ( 1998 ) AFLP技术研究Populus nigra 遗传结构确定杂种[41]
242 AFLP原理
AFLP指纹图谱原理简单引物设计十分巧妙基组DNA限制性切酶完全消化限制性片段两端接工接头作扩增模板接头序列限制性切酶位点序列基础设计引物引物3’端加干碱基(般说1~3碱基)进行PCR扩增酶切数片段中具引物3’端互补片段进行扩增果限制性酶切片段发生插入缺失重复者切酶识位点发生碱基突变等情况酶切片段长度者数目发生改变会电泳结果中反映出
通常基组DNA限制性酶切酶两切点酶具4碱基识位点MseⅠ5’T^TAA3’产生较DNA片段少切点酶具6碱基识位点EcoRⅠ5’G^AATTC3’产生较DNA片段两种酶分换作PseⅠTaqⅠ果EcoRⅠMseⅠ酶切组合会产生三种酶切片段理90MseⅠ
MseⅠ片段部分EcoRⅠ EcoRⅠ片段EcoRⅠ MseⅠ片段EcoRⅠ EcoRⅠ片段数两倍左右两种酶组合产生片段EcoRⅠ MseⅠ扩增片段[42]
243 AFLP标记实验操作
AFLP标记基操作步骤包括：基组DNA提取纯化限制性酶切连接预扩增选择性PCR扩增凝胶电泳银染数分析
预扩增连接接头限制性片段稀释作模版带较少选择性碱基（通常1~3甚含选择性碱基）引物进行扩增预扩增产物稀释作模版进行选择性扩增事实预扩增起纯化模版作
选择性扩增引物通常含2~3选择性碱基（物种需更）增强分辨率采touch downPCR进行扩增扩增反应结束AFLP指纹式样通放射性显影银染者荧光检测位素荧光标记EcoRⅠ引物MseⅠ引物双链PCR产物进行单链标记避免双链扩增片段变性凝胶均等迁移造成误差
244 AFLP标记谱系理学研究中应
AFLP十年里已成研究群体遗传结构亲缘理学工具
Schonswetter等 ( 2004 ) 利AFLP指纹图谱结合cpDNA序列核基DNA
相含量染色体数目研究结果研究北极阿尔卑斯山灯心草属植物
( Juncus biglumis ) 亲缘理历史AFLPcpDNA分析出致结该物种四亚组第四纪隔离冰期避难时发生遗传分化Skrede等( 2006 ) 分布欧亚陆西部北部种仙女木 ( Dryas octopetala ) 群体进行研究通AFLP指纹图谱分析群体北欧陆东部南部两组推测杂交理区域斯堪纳维亚半岛北部Tetra山脉高加索山脉阿尔泰山群体幸存冰期避难[43]SchonswetterTribsch ( 2005) 利AFLP阿尔卑斯山维植物柴胡属Bupleurum srellatum ( Apiaeeae ) 进行亲缘理学研究发现该物种然Corsica
DolomitesMontafon呈连续分布群体间分化时Corsica群体**尔卑斯山群体迁移[44]Oritz等（2007）分布欧洲西南部非洲西**岸Hypochaeris salzmanniana 14群体144体进行AFLP分析9引物组合扩增出487态性条带检测摩洛哥南部Loukos河流群体发生明显遗传分化推测该群体Hsalzmanniana第四纪冰期避难群体遗传样性降低原冰期群体北迁移者间冰期海面升群体历瓶颈效应者Hsalzmanniana繁育系统改变[45]AFLP技术种种优势Bensch等 ( 2005 ) 建议AFLP技术进行群体遗传样性遗传结构等方面研究认然AFLP显性标记通产生量AFLP位点弥补足处相显性标记AFLP实验体系建立耗时更短更容易[46]
25 单链构象态单核苷酸态
251 SSCP标记
单链构象态性 ( SingleStrand Conformation PolymorphismSSCP ) ：通聚丙烯酰胺凝胶电泳构象差异分子分离开方法单链DNA片段呈复杂空间折叠构象种立体结构部碱基配等分子互相作力维持碱基发生改变时会少影响空间构象构象发生改变空间构象差异单链DNA分子聚丙烯酰胺凝胶中受排阻通聚丙烯酰胺凝胶电泳非常敏锐构象差异分子分离开[47]研究中SSCP检查PCR扩增产物基突变建立PCRSSCP技术进步提高检测突变方法简便性灵敏性
SSCP技术基程：PCR扩增靶DNA特异PCR扩增产物变性迅速复性成具定空间结构单链DNA分子然适量单链DNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳通放射性显影银染溴化乙锭显色分析结果发现单链DNA带迁移率正常相发生改变判定该链构象发生改变进推断该DNA片段中碱基改变
SSCP技术简便快速灵敏需特殊仪器作种突变检测方法需进步测序确定突变位置类型SSCP点突变引起单链DNA分子立体构象改变实现电泳分离果某位置点突变单链DNA分子立体构象改变起作作加条件影响凝胶电泳法分辨造成漏检SSCP方法方法相较高检测率通电泳迁移率突变单链DNA分离进步提纯终DNA序列水鉴突变DNA片段[48]SSCP广泛应植物细胞器DNA遗传变异检测进行分子谱系理学研究中起定作
252 SNP标记
单核苷酸态 ( Single Nucleotide PolymorphismSNP )：指基组DNA序列中某特定核苷酸位点变异引起DNA序列态性SNP分析方法数量20余种体分基分子杂交SNP基公数库直接寻找新SNP构象基础SNP基酶切PCR反应SNP毛细电泳方法SNP直接测序SNP分析方法六类[49]
253 SSCPSNP谱系理学研究中应
进行群体遗传结构分析谱系理学研究中较常前四种分子标记方法SSCPSNP标记方法定范围起效作文诣讨较常四种分子标记方法（RFLPRAPDAFLP简单重复序列）谱系理学研究中应SSCPSNP方法做详细说明
总植物遗传方式选分子标记重决定素理想分子标记显性遗传种标记类型区分开谱系理学研究中应根研究象特性研究目选择适分子标记检测方法利基组信息结合种分子标记进行研究
3 讨
总说选择基组分子标记进行分子谱系理学研究时需考虑特点基组具遗传方式谱系理学研究利基组信息结合种分子标记进行没分子标记完全理想应该根研究目选择分子标记进行分析外选种分子标记考虑实验室仪器条件费情况等等着分子标记检测技术开发运相信谱系理学研究会巨推动作期获更推断植物群体遗传结构群体间基流冰期避难冰期群体重建历史等等研究古代植物区系古理古气候提供重科学
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摘：DNA分子标记检测基组寻找态位点揭示体间种群间遗传变异亲缘关系等方法针某特定系统学问题选择合适分子标记谱系理学研究中关键步前研究基础讨目前分子谱系理学研究中常分子标记方法限制性片段长度态性分析（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP ）扩增态性DNA（Random Amplification Polymorphism DNA RAPD）扩增片段长度态性（Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP）简单重复序列（Simple Sequence Repeats SSRs）等研究表明分子标记方法谱系理学研究中越越应进行群体遗传结构谱系理学分析具重意义
关键词：态位点分子标记谱系理学群体遗传结构
Application of DNA Molecular Markers of Testing in Phylogeographic Study
分子标记 ( Molecular Markers ) 体间遗传物质核苷酸序列变异基础遗传标记DNA水遗传态性直接反映种遗传标记——形态学标记生物化学标记细胞学标记相DNA分子标记具优越性：数分子标记显性隐性性状选择十分便利基组变异极丰富分子标记数量限生物发育阶段组织DNA标记分析分子标记揭示DNA变异表现中性影响目标性状表达良性状连锁检测手段简单迅速[12]
着分子生物学技术发展分子标记广泛存基组区域通机分布整基组分子标记态性进行较够全面评估研究象样性揭示遗传质利遗传样性结果物种进行聚类分析进解系统发育亲缘关系分子标记发展研究物种亲缘关系系统分类提供力手段外DNA分子标记广泛应遗传育种基组作图基定位基库构建基克隆等方面[3]
1 分子标记检测技术概述
20世纪80年代建立DNA分子标记检测技术基DNA分子变异建立起分子标记检测变异位DNA重复序列非编码序列表型作没影响然编码序列改变氨基酸序列
DNA序列变异分子标记假定选择中性 ( selective neutrality )
11 DNA分子标记分类
DNA变异检测手段DNA分子标记分四类
Southern杂交基础分子杂交类标记利限制性切核酸酶酶切凝胶电泳分离生物体DNA分子然标记特异性DNA探针杂交通放射显影非位素显色技术揭示DNA变异中常限制性片段长度态性 ( Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP )
聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain ReactionPCR ) 基础分子标记类标记根引物特点分机引物PCR标记特异性引物PCR标记前者应广泛机扩增态性DNA标记 ( Random Amplification Polymorphism DNARAPD )者应简单重复序列 ( Simple Sequence RepeatsSSRs )
基PCR限制性切核酸酶技术结合分子标记类标记种通限制性切核酸酶片段选择性扩增显示限制性片段长度态性扩增片段长度态性 ( Amplified Fragment Length PolymorphismAFLP )种通PCR扩增片段限制性核酸酶酶切提示扩增态性序列特征化扩增区域 ( Sequnce Characterzied Amplifide RegionSCAR )
单核甘酸态性 ( Single Nucleotide PolymorphismSNP ) 基础分子标记般通DNA芯片DNA测序分析检测DNA序列中单碱基变异
DNA分子标记然形式样基原理样通定方法手段揭示样中DNA序列间差异[48]
12 理想分子标记求
理想分子标记必须达求：(1) 具高态性(2) 显性遗传利分子标记鉴二倍体中杂合纯合基型(3) 明确辨等位基(4) 遍布整基组(5) 特殊位点标记外求分子标记均匀分布整基组(6)
选择中性(基效性)(7) 检测手段简单快速(实验程序易动化)(8) 开发成成量低廉(9) 实验室实验室间重复性(便数交换)目前发现种分子标记均满足求[9]
13 分子标记谱系理学研究关系
谱系理学 ( phylogeography ) 历史生物理学分支学科谱系理学概念Avise等（1987）提出门物种（尤指种水）谱系理分布原理程关新兴学科探讨物种演化（亲缘关系）质历史（冰河理隔离时间等）间相关性物种遗传变异形式生态学址历史事件结合起时间空间物种历史进行描述谱系理学称亲缘理学[10]
早应群体遗传学研究分子标记等位酶 ( Izoenzyme ) 然等位酶标记仅适干酶系统检测酶基表达产物部分变异变异总量核基变异三分[11]发展起基DNA遗传标记限制性长度态性分析 ( RFLP )通总基组限制性切酶消化产生许长度片段电泳分离转移尼龙膜硝酸纤维膜然特异DNA片段探针进行膜杂交着PCR技术产生PCR基础种分子标记相继出现：扩增态性DNA ( RAPD )扩增长度态性 ( AFLP ) 简单重复序列 ( SSRs ) 等
选择合适分子标记进行谱系理学研究进确定单倍型分布遗传样性进行分析终推测物种冰期避难探讨冰期群体历史重建进化显著单元 ( Evolutionary Significant UnitsESU ) 确定群体间分歧时间估算栽培植物起源追溯等等研究古代植物区系古理古气候重科学价值制定合理保护策略提供理指导[1213]
14 分子标记方法选择
选择合适分子标记进行谱系理学研究时需考虑方面：（1
）获位点数目（2）分子标记提供态性程度（3）否显性标记显性分子标记RAPDAFLP进行谱系理学研究时显性分子标记（：SSRsRFLPs）（4）实验重复性（5）转移性（6）操作性成
种分子标记特点见表11
表11 种谱系理学研究中常分子标记较
Table 11 Comparison of different molecular markers used in phylogeographic stugy
Marker
Abundance
Levels of polymorphism
Codominance
Reproducibiliby
Cost
Izoenzymes
Low
Low
Yes
High
Low
RFLP
High
Medium
Yes
High
High
SSR
High
High
Yes
High
High
RAPD
High
Medium
No
Low
Low
AFLP
High
High
No
High
High
2 DNA分子标记类
21 限制性片段长度态性
211 RFLP简介
限制性片段长度态性（ Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP ） 研究领域解释遗传学基组学定义物种亚种品系体间基组DNA受种限制性切酶作形成酶切图谱现象
RFLP技术1980年类遗传学家Bostein提出第代DNA分子标记技术 DonisKeller利技术1987年构建成第张遗传图谱DNA分子水态性检测技术进行基组研究基础RFLP技术已广泛基组遗传图谱构建基定位生物进化分类研究[14]RFLP标记根品种（体）基组限制性切酶酶切位点碱基发生突变酶切位点间发生碱基插入缺失导致酶切片段发生变化种变化通特定探针杂交进行检测较品种（体）
DNA水差异（态性）探针较确立生物进化分类关系探针源种种基组DNA克隆位染色体位点作种分子标记构建分子图谱
某性状（基）某（）分子标记协分离时表明性状（基）分子标记连锁分子标记性状间交换值表示目标基分子标记间距离基定位分子图谱分子标记克隆质粒繁殖保存限制性切酶切割基组DNA切片段类型样限制性切酶分子标记组成组合进行研究常限制性切酶般HindⅢBamHⅠEcoRⅠEcoRVXbaⅠ分子标记甚千分子标记越构建图谱越饱构建饱图谱 RFLP 研究目标[15]
212 RFLP原理
RFLP技术原理检测DNA限制性切酶酶切形成特定DNA片段引起酶切位点变异突变点突变（新产生酶切位点） 段DNA重新组织（插入缺失造成酶切位点间长度发生变化）等均导致RFLP产生该技术利限制性切酶识DNA分子特异序列特定序列处切开DNA分子产生限制性片段特性种群生物体言DNA序列存差果种差刚发生切酶酶切位点切酶识序列变成识序列种差切酶识位点DNA序列变成切酶识位点样导致限制性切酶酶切该DNA序列时会少酶切位点结果产生少酶切片段样形成种限制性切酶切割物种DNA序列时产生长度数量限制性酶切片段片段电泳转膜变性标记探针进行杂交洗膜分析态性结果[16]
RFLP分析通常测量影响限制性位点相关位置DNA变异显示谱带直接较者解释限制性位点DNA长度突变通常解释DNA倒位染色体倒位否RFLP分析结果通常样RFLP标记显性够总
DNA提取物中检测出核DNA细胞器DNA变异结果具搞重复性够检测出量遗传变异外出现目区域外DNA态性检测例出现探针区域外突变位点RFLP分析需量DNA常常需放射性核素样核DNA标记数量会受限制RFLP费高检测费时实验室数难检测酶DNA甲基化作定切点RFLP变化酶基活化引起
213 RFLP类型
类限制性切酶位点发生单碱基突变限制性位点发生丢失获产生态性称点态性 ( Point Polymorphism )类态性实际双态（＋）（－）类DNA 分子部发生较序变化致类态性分成两类：第类DNA 序发生突变缺失重复插入致第二类年发现谓高变区高变区 ( Highly variable region )串联重复序组成体高变区串联重复拷贝数相差悬殊高变区长度变化高变区两侧限制性切酶识位点固定位置高变区发生相位移类型RFLP 高变区串联重复序拷贝数产生突出特征限制性切酶识位点身碱基没发生改变改变基组中相位置[17]实际DNA 序中存着量单碱基换通常技术检测出影响限制性切酶识位点突变
214 PCRRFLP分析步骤
PCRRFLP分析步骤包括基组DNA分离目片段扩增限限制性切酶消化电泳分离检测等步骤：
1 提取研究象基组DNA
2目序列限制性切酶选择：叶绿体序列进行分析通常选择叶绿体基组具较高变异非编码区含子序列通常叶绿体基组长单
拷贝区变异速率短单拷贝区已知研究象序列信息先利某序列分析软件sequencherDNAsis序列酶切位点找出果想获较酶切片段选择少酶切位点酶然根实际情况定[18]
3目序列进行PCR扩增然选择限制性切酶进行酶切
4酶切片段电泳分离检测：DNA序列酶切产物通琼脂糖凝
胶电泳者聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离检测
215 RFLP谱系理学中应
植物叶绿体DNA ( cpDNA )非编码区域存相较高核苷酸置换率种间种拥较高遗传变异迄分子系统学谱系理学研究类基组叶绿体基组变异速率区域物种中样变异速率高区域长单拷贝区反转录区cpDNA遗传变异中少50插入缺失造成通限制性片段长度态性分析检测插入缺失点突变Tablert等 (1991)Demesure等 (1995) DumolinLapegue等 (1997) 开发系列扩增叶绿体线粒体非编码区通引物片段进行限制性切酶位点分析统计单倍型类型分布频率进行植物物种鉴定植物系统学分析群体遗传学谱系理学研究Ge等（2005）利SSRcpDNA PCRRFLP分子标记检测中国野蕉( Musa balbisiana ) 群体遗传结构亲缘理学分析基PCR限制性片段长度态性 ( PCRRestriction Fragment Length PolymorphismPCRRFLP ) 广泛应植物谱系理学研究中[1923]
22 机扩增态性DNA
221 RAPD简介
1990年WilliamsWelsh 等运机引物扩增寻找态性 DNA 片段作分子标记方法命名RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA )机扩增态性 DNA
RAPD技术诞生时间长独DNA态性快速简便等特点成目前基组遗传图谱构建基定位生物进化分类重手段[24]
222 RAPD标记原理特点
机扩增态性DNA标记技术建立PCR基础利具10左右碱基单链机引物 ( Arbitary primer )基组DNA全部进行PCR扩增检测基组变异
RAPD系列引物相特定引物说基组DNA序列特定结合位点特定结合位点基组某区域分布符合PCR扩增条件引物模板两条链互补位置引物3端相距定长度范围扩增出片段果基组区域发生DNA片段插入缺失碱基突变导致结合位点分布发生相应变化通 PCR 产物检测探知基组DNA区域态性进行RAPD分析时引物数然引物言检测基组DNA态性区域限利系列引物检测区域覆盖整基组RAPD整基组进行态性检测[25]
RAPD 技术 DNA 态性检测技术 RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism )DNA指纹图( DNA Fingerprinting )SSCP ( Singerstrind Conformatation Polymorphism ) 等相具特点：①RAPD技术受试物种（包括动物植物微生物）缺乏分子生物学研究背景直接基组进行态性分析②操作简便次RAPD扩增实际次简单PCR反应适合量样快速分析③需模板DNA量极少般次扩增需5～50ngDNA毛发脱落组织甚动物排泄物中提取微量DNA进行直接扩增珍稀濒危动物价值高种畜禽基组分析十分效
然RAPD具费低廉检测方便需基序列信息量假定基座检测出存危险需材料少等优点
RAPD图谱中某弱带重复性较差RAPD引物长度序列应引物数目扩增反应条件等实验技术方面尚未标准化影响条件RAPD分析结果性外RAPD标记含信息量假阳性假阴性结果法区分位点扩增DNA片段纯杂合法进行等位基分析等足定程度制约RAPD技术应[26]
223 RAPD基操作方法
RAPD操作方法体包括DNA提取扩增电泳染色等步骤具体操作程见 Williams等（19901993） Welsh等（1990）述着 RAPD技术发展该技术作改动
2231 RAPD反应体系
22311 RAPD反应仪器试剂
RAPD扩增实验仪器台 PCR扩增仪 RAPD反应中引物模板间结合机建议台固定PCR扩增仪进行RAPD反应
RAPD反应试剂：①PCR缓液家公司生产TaqDNA酶均配相应缓液② dNTP包括 dATPdGTPdCTPdTTP 4种种浓度25mmol／dm3③MgCl2 25mmol／dm3④机引物美国Opren公司生产800种机引物公司生产⑤牛血清白蛋白（BSA）10mg／ml明胶 001％③TaqDNA聚合酶
22312 RAPDPCR体系
PCR体系10μl20μl25μl50μl100μl反应体系中成分浓度：①机引物通常10碱基组成中G＋C％50％～70％RAPD引物浓度02μmol／dm3②dNTP（包括dATPdGTPdCTPdTTP）RAPD反应种dNTP浓度01mmol／dm3③PCR反应缓液：包括10mmol／dm3TrisHClpH值9050mmol／dm3 KCl25mmol／dm3MgCl2 ④0001％明胶（
2mg／ml BSA）⑤基组 DNA：5～50ng基组 DNA③TaqDNA聚合酶：05～1μl TaqDNA聚合酶⑦矿物油：反应混合物适量石蜡油覆盖防治反应液蒸发[2728]
22313 RAPD反应程序
RAPD种特殊PCR技术常规PCRRAPD求退火温度较低RAPD引物较短致（10bp）通常RAPD扩增条件：①94℃预变性200秒②94℃变性1分钟36℃退火1分钟72℃延伸2分钟包括40循环③72℃延伸300秒时PCR扩增仪性完全致RAPD反应条件应作相应改变RAPD反应 DNA必须片段纯度高基组 DNA（Genomic DNA）果DNA样品混杂质蛋白质PCR反应抑制剂会影响RAPD扩增效果
22314 RAPD产物检测
RAPD产物1／4体积溴酚蓝－EDTA－甘油混合液采15％琼脂糖胶检测电泳电压5V／cm溴化乙锭染色紫外光拍成
224 RAPD数统计方法
DNA提取扩增电泳染色程态程度较高RAPD谱带目前RAPD数处理没建立起套诸工酶数处理较完整统计体系年学者进行RAPD研究时提出种资料处理方法公式工酶RFLP统计方法国际流行着RAPD数处理方法程序较常UPGMA（权重配算术均数法）基原理运Jaccard相似系数[29]类似NTSYS（数量分类系统）SAS统计分析软件包中CLUSTER程序等方法检测体群体间遗传变异时RAPD
标记作孟德尔特征RAPD 标记具显／隐性交种类RAPD 谱中某态位点般纯合扩增产物频率作等位基频率异交种类RAPD 谱中某态位点杂合扩增产物存频率作RAPD表型频率定义已知等位基频率 Nei指数计算群体基样性遗传分化系数遗传距离Shannon指数估算群体遗传样性RAPD表型频率估算 Shannon表型样性指数Jaccard相似系数（距离）采琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色带相较少较易分析聚丙烯酰胺凝胶电泳硝酸银染色带较银染较敏感然目前文献中方法针前者认统计方法适合聚丙烯酰胺凝胶银染分析
225 RAPD标记技术谱系理学研究中应
RAPD机选择寡核苷酸序列（约10bp）基组DNA扩增出长度DNA片段基组DNARAPD引物结合位点核苷酸序列改变会产生RAPD指纹图谱通琼脂糖凝胶电泳进行分离检测RAPD钟显性标记某物种进行RAPD分析前需解物种基组信息已许研究利RAPD标记进行分子亲缘理学分析：Gabrielsen等 ( 1997 ) RAPD标记研究挪威SvalbardZemlya18虎耳草 ( Saxifraga oppositifolia ) 种群认该种群间存量基流现北欧群体冰期量具高遗传变异冰原附群体迁移形成[30]频繁迁移强基流冰期避难存活群体( 果前存话 )间遗传分化冰期互相混合消失品种分类鉴定常形态学工酶区某关系较材料准确区分RAPD分类鉴定表现出明显优势Willkie (1993) RAPD葱属进行遗传关系分析矮牡丹紫牡丹丁香方法做分类鉴定系谱分析工作Williams (1990) welsh (1990)
玉米豆水稻进行RAPD指纹图谱构建品种品系进行鉴定系谱分析RAPD标记技术已越越应植物谱系理学研究中
23 简单重复序列
231 SSR标记
简单重复序列（Simple Sequence RepeatsSSRs）称微卫星DNA（Microsatellite DNA）称短串联重复（Short tandem repeatSTR）类（1~6）碱基组成基序( motif )( AT ) n( GTT ) n( CAG ) n( ATTT )n ( n 重复) 等串联重复成DNA序列SSR长度般较短100bp植物基组中( AT ) n 常见SSR认机分布核DNAcpDNAmtDNA中基组中某特定SSR侧翼序列通常保守性较强单序列SSR侧翼DNA片段克隆测序然根SSR侧翼两端互补序列工设计合成引物通PCR反应扩增SSR片段遗传材料核心序列串联重复数目够PCR方法扩增出长度PCR产物产物进行凝胶电泳凝胶出现电泳谱带检测基型遗传变异扩增片段代表微卫星位点DNA变异事微卫星位点出现量跳跃片段侧翼区域出现突变[31]
SSR标记般检测单SSR位点变异类型显性鉴杂合体纯合体SSR标记数量丰富覆盖整基组DNA标记相SSR标记突变率高SSR标记中扩增DNA片段两侧序列未知SSR两侧引物具物种特异性需克隆测序意味着SSR引物开发检测费高SSR标记研究中断缺（stutter）谱带电泳结果难解释SSR突变模型意味着微卫星等位位点间非源相似性（homoplasy）高外SSR标记检测变异位点限研究物种间遗传变异限制SSR标记技术应
232 ISSR标记
2321 ISSR标记技术原理
简单重复间序列（InterSimple Sequence RepeatISSR）标记针SSR标记局限设计根植物广泛存SSR特点SSR序列3’端5’端加2~4机核苷酸作引物保证引物基组中SSR3’端5’端结合两侧具反排列SSR段DNA序列进行PCR扩增扩增产物进行电泳染色根谱带相应位置分析群体ISSR标记遗传变异
2322 ISSR标记特点
ISSR引物通常16～18碱基体2~4碱基组成串联重复序列然5’端3’端加1~4锚定碱基保证ISSR引物够SSR间DNA序列进行PCR扩增微卫星基组中广泛分布(Roder et a1．1998)等位变异特丰富ISSR检测高态性外ISSRSSR具物种特异性RAPD样类动植物研究引物设计求产物态性远RFLPSSRRAPD更加丰富提供更关基组信息RAPD技术更加稳定实验重复性更外ISSR操作起较简单成较低适合样检测[3235]
2323 ISSR标记实验操作
基 PCR技术分子标记方法样 ISSR技术包括 DNA提取PCR扩增电泳检测观察结果统计分析等步骤采常规方法提取 ISSR分析 DNA样品 SDS法 CTAB法根需适改良然需试剂盒提取 DNA进行纯化需 DNA样品进行电泳检测质量分光光度计检测 OD260280 OD260230菌水普通 TE DNA稀释贮存 20℃ 70℃冰箱中备确定引物 PCR仪基组中 SSR间序列进行扩增扩增步骤 RAPD技术相似引物植物材料扩增条件存差异需通预备实验体系反应液中
DNA模板浓度dNTPs引物Tag酶Mg2 +浓度 变性温度复性温度热循环程序等进行优化获清晰重复宜统计带纹[36]PCR产物需电泳分离染色显示进行谱带观察统计目前 DNA分离中电泳介质 ISSR扩增产物分离琼脂糖浓度常 15 20聚丙烯酰胺常浓度 6者分离效果通常更硝 酸银溴化乙啶 (EB)染色见光 (银染 )紫外光 (EB染色 )进行观察统计带纹 (计 1) (计0)相位置然根研究目应相关软件进行分析
233 简单重复序列谱系理学研究中应
SSR标记引物开发设计需消耗量力物力SSR种优点越越应群体遗传学谱系理学研究中Ge等（2005）利SSRcpDNA PCRRFLP分子标记检测中国野蕉( Musa balbisiana ) 群体遗传结构亲缘理学分析SSR数揭示中国野蕉群体显著理结构时利nrSSR估测花粉带基流cpDNA数估测种子流365倍Kuroda等(2006)利SSR变异日野生豆( Glyeine soja ) 群体遗传结构进行分析77野生豆群体616体分析结果发现野生豆群体观测杂合度低群体间存强烈分化认野生豆群体受较程度奠基者效应影响栽培豆群体出现明显分化时已出现栽培豆群体基渐渗现象[37]目前许报道利叶绿体SSR标记(cpSSRs)成功进行物种群体遗传学分子系统学研究针叶类植物中许研究根较保守cpSSRs两翼序列设计引物进行cpSSRs扩增进行分子谱系理学研究[38]Heuertz等 ( 2004 ) 结合叶绿体PCRRFLPcpSSRs方法欧洲岑树(Fraxinus excelsior ) 全部然群体遗传结构冰期历史进行研究发现然群体态性程度较低推测冰期避难伊利亚意利**尔卑斯山巴尔干半岛化石花粉结果致建议进行亲缘理学分析时候应该结合分子标记限度获物种遗传信息[39]
ISSR标记作点标记物种种群遗传样性亲缘关系分析等研究方面广泛Tsumura等ISSR方法研究日雪松 ( Cryptomeria japonica ) 花旗松 (Pseudotsuga menziesii ) 间亲缘关系结果发现24 ISSR引物87 ~ 100 引物物种中态性引物物种间样性差异Huang等ISSR4叶绿体DNA非编码区限制性位点变异研究40甘薯属 ( Ipomoea ) 样品遗传样性种关系[40]王心宇等 ( 2001 )利ISSR标记构建亲缘关系较麦品种品系指纹图谱RAPD结果作分析结果发现：(AG)n(Ac)n(TG)n 等二核苷酸重复引物类型亲缘关系品种品系区分开 杜金昆等 ( 2002 ) 利11ISSR引物供试47份麦品种明显区分开准确确定基型间遗传差异亲缘关系予卿等（2001）利ISSR分子标记研究37份栽培稻野生稻亲缘关系李进波等 ( 2003 ) ISSRSSR标记建立24水稻光温敏核育系DNA指纹图谱利13ISSR引物20SSR引物分获174态性片段62态性片段均ISSR引物检测1338态性片段远远高SSR引物检测率
SSR标记基础改进ISSR标记类快速准确产生足够态位点分子标记方法规模作物DNA指纹分析遗传作图基定位等研究分子谱系理学研究中发挥越越作
24 扩增片段长度态性
241 AFLP简介
扩增片段长度态性 ( Amplified Fragment Length PolymorphismAFLP ) 1993年荷兰科学家ZbaeauVos发展起种检测DNA态性新方法建立基组限制性片段基础PCR扩增Vos等1995年Nueleic Aeids Researeh发表AFLP：a new Technique for DNA fingerprinting文详细介绍AFLP指纹图谱标记原理
AFLP指纹标记技术结合AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) PCR ( Polymerase Chain Reaetion ) 两者特点总说具优势：(1)预先知道研究象基组信息(2) 仅需少量DNA(3) 具较高重复性(4) 扫描整基组引物组合产生量片段量信息(5) 符合孟德尔分离定律(6) 非等位基迁移出现概率极低 AFLP具身足处：(1) 显性标记报道指出AFLP扩增条带进行显性分析般说AFLP作显性标记(2) 成高试剂盒价格昂贵时操作定难度设计步骤繁
AFLP指纹图谱已广泛应 (1) 构建遗传图谱定位克隆基 (2) 群体遗传结构研究(3) 检测遗传样性(4) 系统发育重建(5) 确定杂交起源杂交理区域Arens等 ( 1998 ) AFLP技术研究Populus nigra 遗传结构确定杂种[41]
242 AFLP原理
AFLP指纹图谱原理简单引物设计十分巧妙基组DNA限制性切酶完全消化限制性片段两端接工接头作扩增模板接头序列限制性切酶位点序列基础设计引物引物3’端加干碱基(般说1~3碱基)进行PCR扩增酶切数片段中具引物3’端互补片段进行扩增果限制性酶切片段发生插入缺失重复者切酶识位点发生碱基突变等情况酶切片段长度者数目发生改变会电泳结果中反映出
通常基组DNA限制性酶切酶两切点酶具4碱基识位点MseⅠ5’T^TAA3’产生较DNA片段少切点酶具6碱基识位点EcoRⅠ5’G^AATTC3’产生较DNA片段两种酶分换作PseⅠTaqⅠ果EcoRⅠMseⅠ酶切组合会产生三种酶切片段理90MseⅠ
MseⅠ片段部分EcoRⅠ EcoRⅠ片段EcoRⅠ MseⅠ片段EcoRⅠ EcoRⅠ片段数两倍左右两种酶组合产生片段EcoRⅠ MseⅠ扩增片段[42]
243 AFLP标记实验操作
AFLP标记基操作步骤包括：基组DNA提取纯化限制性酶切连接预扩增选择性PCR扩增凝胶电泳银染数分析
预扩增连接接头限制性片段稀释作模版带较少选择性碱基（通常1~3甚含选择性碱基）引物进行扩增预扩增产物稀释作模版进行选择性扩增事实预扩增起纯化模版作
选择性扩增引物通常含2~3选择性碱基（物种需更）增强分辨率采touch downPCR进行扩增扩增反应结束AFLP指纹式样通放射性显影银染者荧光检测位素荧光标记EcoRⅠ引物MseⅠ引物双链PCR产物进行单链标记避免双链扩增片段变性凝胶均等迁移造成误差
244 AFLP标记谱系理学研究中应
AFLP十年里已成研究群体遗传结构亲缘理学工具
Schonswetter等 ( 2004 ) 利AFLP指纹图谱结合cpDNA序列核基DNA
相含量染色体数目研究结果研究北极阿尔卑斯山灯心草属植物
( Juncus biglumis ) 亲缘理历史AFLPcpDNA分析出致结该物种四亚组第四纪隔离冰期避难时发生遗传分化Skrede等( 2006 ) 分布欧亚陆西部北部种仙女木 ( Dryas octopetala ) 群体进行研究通AFLP指纹图谱分析群体北欧陆东部南部两组推测杂交理区域斯堪纳维亚半岛北部Tetra山脉高加索山脉阿尔泰山群体幸存冰期避难[43]SchonswetterTribsch ( 2005) 利AFLP阿尔卑斯山维植物柴胡属Bupleurum srellatum ( Apiaeeae ) 进行亲缘理学研究发现该物种然Corsica
DolomitesMontafon呈连续分布群体间分化时Corsica群体**尔卑斯山群体迁移[44]Oritz等（2007）分布欧洲西南部非洲西**岸Hypochaeris salzmanniana 14群体144体进行AFLP分析9引物组合扩增出487态性条带检测摩洛哥南部Loukos河流群体发生明显遗传分化推测该群体Hsalzmanniana第四纪冰期避难群体遗传样性降低原冰期群体北迁移者间冰期海面升群体历瓶颈效应者Hsalzmanniana繁育系统改变[45]AFLP技术种种优势Bensch等 ( 2005 ) 建议AFLP技术进行群体遗传样性遗传结构等方面研究认然AFLP显性标记通产生量AFLP位点弥补足处相显性标记AFLP实验体系建立耗时更短更容易[46]
25 单链构象态单核苷酸态
251 SSCP标记
单链构象态性 ( SingleStrand Conformation PolymorphismSSCP ) ：通聚丙烯酰胺凝胶电泳构象差异分子分离开方法单链DNA片段呈复杂空间折叠构象种立体结构部碱基配等分子互相作力维持碱基发生改变时会少影响空间构象构象发生改变空间构象差异单链DNA分子聚丙烯酰胺凝胶中受排阻通聚丙烯酰胺凝胶电泳非常敏锐构象差异分子分离开[47]研究中SSCP检查PCR扩增产物基突变建立PCRSSCP技术进步提高检测突变方法简便性灵敏性
SSCP技术基程：PCR扩增靶DNA特异PCR扩增产物变性迅速复性成具定空间结构单链DNA分子然适量单链DNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳通放射性显影银染溴化乙锭显色分析结果发现单链DNA带迁移率正常相发生改变判定该链构象发生改变进推断该DNA片段中碱基改变
SSCP技术简便快速灵敏需特殊仪器作种突变检测方法需进步测序确定突变位置类型SSCP点突变引起单链DNA分子立体构象改变实现电泳分离果某位置点突变单链DNA分子立体构象改变起作作加条件影响凝胶电泳法分辨造成漏检SSCP方法方法相较高检测率通电泳迁移率突变单链DNA分离进步提纯终DNA序列水鉴突变DNA片段[48]SSCP广泛应植物细胞器DNA遗传变异检测进行分子谱系理学研究中起定作
252 SNP标记
单核苷酸态 ( Single Nucleotide PolymorphismSNP )：指基组DNA序列中某特定核苷酸位点变异引起DNA序列态性SNP分析方法数量20余种体分基分子杂交SNP基公数库直接寻找新SNP构象基础SNP基酶切PCR反应SNP毛细电泳方法SNP直接测序SNP分析方法六类[49]
253 SSCPSNP谱系理学研究中应
进行群体遗传结构分析谱系理学研究中较常前四种分子标记方法SSCPSNP标记方法定范围起效作文诣讨较常四种分子标记方法（RFLPRAPDAFLP简单重复序列）谱系理学研究中应SSCPSNP方法做详细说明
总植物遗传方式选分子标记重决定素理想分子标记显性遗传种标记类型区分开谱系理学研究中应根研究象特性研究目选择适分子标记检测方法利基组信息结合种分子标记进行研究
3 讨
总说选择基组分子标记进行分子谱系理学研究时需考虑特点基组具遗传方式谱系理学研究利基组信息结合种分子标记进行没分子标记完全理想应该根研究目选择分子标记进行分析外选种分子标记考虑实验室仪器条件费情况等等着分子标记检测技术开发运相信谱系理学研究会巨推动作期获更推断植物群体遗传结构群体间基流冰期避难冰期群体重建历史等等研究古代植物区系古理古气候提供重科学
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