芪枣颗粒微生物限度检查方法学验证资料
样 品： 芪枣颗粒 批号： 20100601 规格：15g
生产企业： 泰华天然生物制药限公司
仪器设备： 隔水式电热怛温培养箱 KEWEI 北京科伟
霉菌培养箱 MJX160B 海博迅
立式动电热压力蒸气灭菌器 LXC75L **华泰
培养基：（北京陆桥技术限公司生产）
营养琼脂培养基（国药集团化学式剂限公司） 批号 20090601
营养肉汤培养基（国药集团化学式剂限公司）批号 20090801
改良马丁培养基 批号091202
改良马丁琼脂培养基 批号091201
玫瑰红钠琼脂培养基 批号 091204
曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）批号 091201
胆盐乳糖增菌液（BL） 批号 091201
稀释液：PH70菌氯化钠蛋白胨缓液（北京陆桥技术限公司）批号100105
试验菌种：（均中国医学细菌保藏中心提供）
枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501] 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]
肠埃希菌[CMCC(B)44102] 白色念珠菌[CMCC（F）98001]
黑曲霉菌[CMCC(F)98003]
菌液制备：取标准菌株第二代新鲜培养物接种金黄色葡萄球菌枯草芽胞
杆菌肠埃希菌新鲜培养物营养肉汤培养基中35℃培养24时接种白
色念珠菌新鲜培养物改良马丁培养基中25℃培养48时（述培养物
09菌氯化钠溶液制成1ml含菌数50~100cfu菌悬液）接种黑曲霉新
鲜培养物改良马丁琼脂斜面培养基中25℃培养7天加入3~5ml09菌氯化
钠溶液孢子洗脱然吸出孢子悬液菌试09菌氯化钠溶
液制成1ml含孢子数50~100cfu孢子悬液结果见表Ⅰ
供试液制备：取供试品10g加稀释液100ml制成1：10供试液
方法验证试验：
常规法（皿法）
计数方法验证：（方法验证分试验组供试品组菌液组稀释剂组四组）验证试验供试品细菌霉菌酵母菌计数时进行
（1）试验组：取述供试液（1：10稀释级）1ml50－100cfu试验菌进行细菌霉菌酵母菌数测定 结果见表Ⅰ
（2）供试品组：取规定量供试液菌落计数法测定供试品底菌数结果见表Ⅰ
（3）菌液组：测定加试验菌数 结果见表Ⅰ
（4）稀释剂组：供试液制备需分散乳化中离心薄膜滤等特殊处理时应增加稀释剂组
标准规定：试验组菌回收率均应低70稀释剂组菌回收率均应低70
试验组菌回收率＝（试验组均菌数供试品组均菌数）菌液组均菌数×100
稀释剂组菌回收率稀释剂组均数菌液组均菌数×100
二培养基稀释法
取110供试液采05ml皿加入试验菌金黄色葡萄球菌50100cfu皿法进行试验结果见表Ⅱ
表Ⅰ 常规法（皿法）细菌霉菌酵计数方法验证试验结果
试验
结果
菌株
名称
试验
次数
试验组菌数
供试品
组菌数
菌液组菌数
回收率（）
板数
均数
板数
均数
板数
均数
1
2
1
2
1
2
枯草芽胞杆菌
1
81
75
78
0
0
0
90
71
805
969
2
72
69
705
0
0
0
70
73
715
987
3
76
78
77
0
0
0
81
75
78
987
金黄色
葡萄球菌
1
45
40
425
0
0
0
67
68
675
630
2
41
42
415
0
0
0
67
68
675
615
3
57
51
54
0
0
0
79
86
825
655
肠
埃希菌
1
105
94
995
0
0
0
129
110
1195
833
2
97
99
98
0
0
0
108
110
109
900
3
91
93
92
0
0
0
98
92
95
968
白色
念珠菌
1
105
98
965
0
0
0
106
102
104
928
2
110
113
1115
0
0
0
129
116
1225
910
3
103
97
100
0
0
0
114
108
111
900
黑曲霉菌
1
35
25
30
0
0
0
36
32
34
882
2
79
76
775
0
0
0
81
75
78
993
3
83
75
79
0
0
0
86
78
82
963
表Ⅰ结果：采常规法（皿法）进行霉菌酵母菌数检查采常规法（皿法）进行细菌数检查
表Ⅱ 培养基稀释法（05ml皿）验证试验结果
菌株
名称
试验
结果
试验次数
试验组菌数
供试品
组菌数
菌液组菌数
回收率()
板数
均数
板数
均数
板数
均数
1
2
1
2
1
2
金黄色葡萄球(05ml皿)
1
93
133
113
0
0
0
107
128
1175
962
2
118
105
1115
0
0
0
107
128
1175
949
3
102
94
98
0
0
0
95
116
1055
929
表Ⅱ结果采培养基稀释法(05ml皿)进行细菌数检查
三控制菌检查：（验证时试验分试验组阴性组）
肠埃希菌 取1：10供试液10ml加入胆盐乳糖培养基（BL）100ml中法操作结果见表Ⅲ
表Ⅲ 控制菌检查方法验证结果表
菌株
名称
组
试 验 组 结 果 （+）
阴 性 组 结 果 （）
接菌数量CFU
培养基
分离板
生化试验
菌株
名称
接菌数量CFU
培养基
分离板
生化试验
分离板
生化试验
分离
板
生化试验
肠埃希菌
95
BL
MUG靛基质
金黄色葡萄球菌
68
BL
MUG
靛基质
浊
+ +
浊
标准规定：试验组应检出试验菌阴性菌检出
注：+ 培养基菌生长 培养基菌生长
表Ⅲ结果采常规法进行控制菌检查
结：品中国药典2005年版部附录微生物限度检查法方法学验证求验证采培养基稀释法（05ml皿）进行细菌数检查采常规法（皿法）进行霉菌数酵母菌数检查采常规法进行控制菌检查
泰华天然生物制药限公司质检中心
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样 品： 芪枣颗粒 批号： 20100601 规格：15g
生产企业： 泰华天然生物制药限公司
仪器设备： 隔水式电热怛温培养箱 KEWEI 北京科伟
霉菌培养箱 MJX160B 海博迅
立式动电热压力蒸气灭菌器 LXC75L **华泰
培养基：（北京陆桥技术限公司生产）
营养琼脂培养基（国药集团化学式剂限公司） 批号 20090601
营养肉汤培养基（国药集团化学式剂限公司）批号 20090801
改良马丁培养基 批号091202
改良马丁琼脂培养基 批号091201
玫瑰红钠琼脂培养基 批号 091204
曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）批号 091201
胆盐乳糖增菌液（BL） 批号 091201
稀释液：PH70菌氯化钠蛋白胨缓液（北京陆桥技术限公司）批号100105
试验菌种：（均中国医学细菌保藏中心提供）
枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501] 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]
肠埃希菌[CMCC(B)44102] 白色念珠菌[CMCC（F）98001]
黑曲霉菌[CMCC(F)98003]
菌液制备：取标准菌株第二代新鲜培养物接种金黄色葡萄球菌枯草芽胞
杆菌肠埃希菌新鲜培养物营养肉汤培养基中35℃培养24时接种白
色念珠菌新鲜培养物改良马丁培养基中25℃培养48时（述培养物
09菌氯化钠溶液制成1ml含菌数50~100cfu菌悬液）接种黑曲霉新
鲜培养物改良马丁琼脂斜面培养基中25℃培养7天加入3~5ml09菌氯化
钠溶液孢子洗脱然吸出孢子悬液菌试09菌氯化钠溶
液制成1ml含孢子数50~100cfu孢子悬液结果见表Ⅰ
供试液制备：取供试品10g加稀释液100ml制成1：10供试液
方法验证试验：
常规法（皿法）
计数方法验证：（方法验证分试验组供试品组菌液组稀释剂组四组）验证试验供试品细菌霉菌酵母菌计数时进行
（1）试验组：取述供试液（1：10稀释级）1ml50－100cfu试验菌进行细菌霉菌酵母菌数测定 结果见表Ⅰ
（2）供试品组：取规定量供试液菌落计数法测定供试品底菌数结果见表Ⅰ
（3）菌液组：测定加试验菌数 结果见表Ⅰ
（4）稀释剂组：供试液制备需分散乳化中离心薄膜滤等特殊处理时应增加稀释剂组
标准规定：试验组菌回收率均应低70稀释剂组菌回收率均应低70
试验组菌回收率＝（试验组均菌数供试品组均菌数）菌液组均菌数×100
稀释剂组菌回收率稀释剂组均数菌液组均菌数×100
二培养基稀释法
取110供试液采05ml皿加入试验菌金黄色葡萄球菌50100cfu皿法进行试验结果见表Ⅱ
表Ⅰ 常规法（皿法）细菌霉菌酵计数方法验证试验结果
试验
结果
菌株
名称
试验
次数
试验组菌数
供试品
组菌数
菌液组菌数
回收率（）
板数
均数
板数
均数
板数
均数
1
2
1
2
1
2
枯草芽胞杆菌
1
81
75
78
0
0
0
90
71
805
969
2
72
69
705
0
0
0
70
73
715
987
3
76
78
77
0
0
0
81
75
78
987
金黄色
葡萄球菌
1
45
40
425
0
0
0
67
68
675
630
2
41
42
415
0
0
0
67
68
675
615
3
57
51
54
0
0
0
79
86
825
655
肠
埃希菌
1
105
94
995
0
0
0
129
110
1195
833
2
97
99
98
0
0
0
108
110
109
900
3
91
93
92
0
0
0
98
92
95
968
白色
念珠菌
1
105
98
965
0
0
0
106
102
104
928
2
110
113
1115
0
0
0
129
116
1225
910
3
103
97
100
0
0
0
114
108
111
900
黑曲霉菌
1
35
25
30
0
0
0
36
32
34
882
2
79
76
775
0
0
0
81
75
78
993
3
83
75
79
0
0
0
86
78
82
963
表Ⅰ结果：采常规法（皿法）进行霉菌酵母菌数检查采常规法（皿法）进行细菌数检查
表Ⅱ 培养基稀释法（05ml皿）验证试验结果
菌株
名称
试验
结果
试验次数
试验组菌数
供试品
组菌数
菌液组菌数
回收率()
板数
均数
板数
均数
板数
均数
1
2
1
2
1
2
金黄色葡萄球(05ml皿)
1
93
133
113
0
0
0
107
128
1175
962
2
118
105
1115
0
0
0
107
128
1175
949
3
102
94
98
0
0
0
95
116
1055
929
表Ⅱ结果采培养基稀释法(05ml皿)进行细菌数检查
三控制菌检查：（验证时试验分试验组阴性组）
肠埃希菌 取1：10供试液10ml加入胆盐乳糖培养基（BL）100ml中法操作结果见表Ⅲ
表Ⅲ 控制菌检查方法验证结果表
菌株
名称
组
试 验 组 结 果 （+）
阴 性 组 结 果 （）
接菌数量CFU
培养基
分离板
生化试验
菌株
名称
接菌数量CFU
培养基
分离板
生化试验
分离板
生化试验
分离
板
生化试验
肠埃希菌
95
BL
MUG靛基质
金黄色葡萄球菌
68
BL
MUG
靛基质
浊
+ +
浊
标准规定：试验组应检出试验菌阴性菌检出
注：+ 培养基菌生长 培养基菌生长
表Ⅲ结果采常规法进行控制菌检查
结：品中国药典2005年版部附录微生物限度检查法方法学验证求验证采培养基稀释法（05ml皿）进行细菌数检查采常规法（皿法）进行霉菌数酵母菌数检查采常规法进行控制菌检查
泰华天然生物制药限公司质检中心
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